沉积物中酶的测定方法

沉积物中酶的测定方法

水解酶

一、脲酶（靛酚比色法）

大多数细菌、真菌和高等植物均具有脲酶（urease）。它是一种酰胺酶（amidase），能酶促有机质分子中肽键的水解。土壤的脲酶活性与土壤的微生物数量、有机质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。

根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。此法的精确性较高，重现性较好。

试剂配制：

1．甲苯（分析纯）

2．10%尿素：尿素（分析纯）10g溶于100ml蒸馏水中。

3．柠檬酸盐缓冲液：368g柠檬酸（分析纯）溶于600ml蒸馏水中；295g氢氧化钾溶于1000ml蒸馏水；将二种溶液合并，用1mol/L氢氧化钠调pH至6.7，并用蒸馏水稀释至2L。

4．苯酚钠溶液：A.62.5g苯酚溶于少量95%乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml，存于冰箱中。B.27g氢氧化钠溶于100ml水中保存于冰箱中。使用前，将溶液A、B各吸取20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml备用。5．次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。

标准溶液：

氮的标准溶液：精确称取称0.4717g硫酸铵（105℃烘干）溶于水，稀释至1L，则得1ml含0.1mg氮的标准溶液，即100ppm。将100ppm的标准溶液稀释为

10ppm。

标准曲线绘制：分别吸取0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml稀释后的标准溶液于50ml容量瓶或刻度试管中，然后加蒸馏水至25ml。再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容至50ml。1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据吸光度和溶液浓度绘制标准曲线。（溶液浓度为：0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。）

分析步骤：

称2-5g过20目风干土于50ml三角瓶中，加5-10滴甲苯，盖好，15分钟后加10ml 10%尿素和20ml pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后，在37℃恒温箱中培养24小时，过滤。取滤液1~3毫升（视样品浓度定）于50ml刻度试管中，加蒸馏水至25ml，再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20分钟后定容，在分光光度计波长578nm处比色（1cm比色皿）。反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。还需减去无土基质（尿素＋柠檬酸盐）。

结果计算：

脲酶活性以24小时内每克土中氨态氮的毫克数来表示。

NH3-N（mg/1g土24h）=（浓度×稀释倍数×比色体积）÷（1000×干土重）1000为ug换算成mg

二、磷酸酶（磷酸苯二钠比色法）

磷酸酶（phosphatase）能酶促有机磷化合物的水解。试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着重要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况），是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。

研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5,6-7和8-10。所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的pH缓冲体系有醋酸缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），硼酸缓冲液（pH9-10）。

本法测定是以磷酸苯二钠为基质，在磷酸酶的作用下，用水解基质所生成的苯酚的量来表示酶的活性。

试剂配制：

1．甲苯（CR）

2．①pH5醋酸盐缓冲液：（酸性土壤）

A：0.2N醋酸溶液：称取1.776g冰醋酸和9.58g醋酸钠溶解，加蒸馏水定容到1000毫升。

B：0.2mol/L氢氧化氨溶液：取含25%~28%的氨水14.02ml稀释至500毫升。取A、B溶液各250ml用蒸馏水定容至1000ml。

②pH7柠檬酸盐缓冲液：（中性土壤）

A：0.1M柠檬酸溶液：称21.01g柠檬酸溶于1000ml蒸馏水中。

B：0.2M磷酸氢二钠溶液：Na2HPO4•7H2O53.63g或Na2HPO4•12H2O71.7g稀释至1000ml。

取A溶液64ml，B溶液436ml稀释至1000ml。

③pH10硼酸盐缓冲液：（碱性土壤）

A：0.05M硼砂溶液（Na2B4O710•H2O）称取19.05g硼砂溶于1000ml蒸馏水中。B：0.2M氢氧化钠：8g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。

取A溶液50ml，B溶液43ml，加水稀释至200ml。

3．pH9.8氨性氯化铵溶液：称取20g氯化氨溶于100ml浓氨水中，储存在橡皮塞瓶中，保存于冰箱。

4．0.5%磷酸苯二钠（Na2C6H5PO4•2H2O）：称5g磷酸苯二钠溶于1000ml缓冲液。

5．2%4-氨基安替匹林：称取2g4-氨基安替匹林，先用少量水溶解，最后稀释至100ml，浑浊时用滤纸过滤后使用。（一周内有效）

6．8%铁氰化钾溶液：称8g铁氰化钾溶于少量水，定容至100ml，储存在棕色瓶中。（一周内有效）

酚的标准溶液：

a.原液配制：0.5g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至500毫升，储存于棕色瓶中，浓度即为1000ppm。

b.工作液配制：取2.5ml原液稀释至250ml，即浓度为10ppm，储存于棕色瓶中。标准曲线绘制：分别取工作液1、3、5、7、9、11、13、15毫升于50毫升容量瓶或50毫升比色管中，加蒸馏水至25ml，再加0.25ml氨性氯化铵，0.5ml2%4-氨基安替匹林和0.5ml 8%铁氰化钾溶液，边加边摇匀，15分钟后定容，1.5h内在波长510nm处比色。(溶液的浓度分别为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0ppm试剂与测定相同。)

分析步骤：

称过20目的风干土2g于50ml三角瓶中，加5-10滴甲苯，盖好瓶塞，15

分钟后加0.5%磷酸苯二钠溶液20ml（对照直接加20ml缓冲液），摇匀并置37℃恒温培养24小时，培养结束后立即过滤。

吸滤液1~5毫升于50ml容量瓶（或比色管）中，加蒸馏水至25ml，再加入0.25ml氨性氯化氨，0.5ml2%4-氨基安替匹林和0.5ml8%铁氰化钾溶液，边加边摇匀，15分钟后定容，在波长510nm处比色。（用1cm比色杯，显色后1.5h内