一、激酶筛选方案
中国纳豆激酶团体标准
中国纳豆激酶团体标准一、纳豆激酶的活性定义和测量方法纳豆激酶是一种从纳豆中提取的酶，具有溶解血栓、降低血液粘稠度等作用。
纳豆激酶的活性是指其在一定时间内分解纤维蛋白的能力，通常以单位表示。
测量纳豆激酶活性的方法有多种，常用的有纤维蛋白平板法、光谱法等。
二、纳豆激酶原料的要求和检测标准纳豆激酶原料应符合以下要求：1.来源：应来自经过严格筛选的纳豆发酵原料，确保无污染、无有害微生物和有害化学物质。
2.活性：原料中纳豆激酶的活性应达到一定标准，如不得低于10000单位/克。
3.稳定性：原料应具有良好的稳定性，确保在生产、储存和使用过程中不易失去活性。
纳豆激酶原料的检测标准包括：1.外观：应呈均匀的黄色或淡黄色，无杂质。
2.气味：应具有典型的纳豆气味，无异味。
3.水分：水分含量应符合规定，以保证原料的稳定性。
4.活性：按照规定的测量方法进行检测，确保达到规定的活性标准。
三、纳豆激酶产品的生产规范和流程纳豆激酶产品的生产应遵循以下规范和流程：1.原料准备：按照规定的标准筛选原料，并进行必要的清洗和干燥处理。
2.提取和纯化：采用适当的提取和纯化技术，如离心、过滤、沉淀等，以获得高纯度的纳豆激酶。
3.制剂制备：将纳豆激酶与其他必要的辅料混合，制备成各种剂型的纳豆激酶产品，如片剂、胶囊、口服液等。
4.质量检测：对每个生产批次的产品进行质量检测，确保符合规定的标准。
5.包装和储存：按照规定的包装要求进行包装，并确保产品在适当的温度和湿度条件下储存。
6.运输：在运输过程中，应采取必要的措施防止产品损坏和污染。
四、纳豆激酶产品的质量控制和安全性评估纳豆激酶产品的质量控制是确保产品质量和安全的关键环节，应遵循以下要求：1.质量标准：制定详细的质量标准，包括性状、鉴别、纯度、活性等方面的规定。
2.质量检验：对每个生产批次的产品进行质量检验，确保符合质量标准。
3.不合格品处理：对不合格品进行标识、记录并按照规定进行处理，防止不合格品流入市场。
一株产纳豆激酶菌株的分离筛选及鉴定
一株产纳豆激酶菌株的分离筛选及鉴定马明;杜金华;王囡;高洁;商曰玲【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2007(033)005【摘要】对能产生纳豆激酶的菌群进行了筛选,分离得到了1株具有较高纤溶活性的菌株N391,其纳豆激酶相当于1 722.4U/mL尿激酶的酶活.利用细菌16S rDNA 通用引物对其16S rRNA进行PCR扩增,得到1 511bp的片段,该PCR产物序列通过Blast软件在NCBI网站中进行同源性比较,通过DNA MAN和MAGE3.1软件绘制系统发育树,结果表明,菌株N391的16S rRNA序列(DQ906100)与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的16S rRNA序列的同源性在99%以上,在系统发育树中,菌株N391与Bacillus subtilis在同一分支,且遗传距离最短.结合常规的形态、生理生化鉴定,N391的形态及大部分生理生化特征与Bacillus subtilis 极为相似,表明菌株N391属于Bacillus subtilis的1个菌株,由此初步确定该菌在微生物系统发育学上的地位.【总页数】5页(P37-41)【作者】马明;杜金华;王囡;高洁;商曰玲【作者单位】山东农业大学生命科学学院,山东泰安,271018;山东农业大学生命科学学院,山东泰安,271018;山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安,271018;山东农业大学生命科学学院,山东泰安,271018;山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安,271018;泰山学院生物科学与技术系,山东泰安,271021;山东农业大学生命科学学院,山东泰安,271018【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.一株产L-木酮糖菌株的分离筛选及鉴定 [J], 张玉宝;赵祥颖;杨丽萍;韩延雷;刘建军2.一株产α-淀粉酶菌株的分离筛选、鉴定及酶学性质研究 [J], 赵淑琴;杨孝朴3.一株产高温纤维素酶菌株的分离筛选 [J], 蒋芳;刘松青;甄阳光;谢光美4.一株产胞外多糖新菌株Escherichia hermannii的分离筛选及鉴定 [J], 冯雪萍;连治中;詹晓北;郑志永5.一株产脂肪酶菌株的分离筛选及鉴定 [J], 辛国芹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高通量药物筛选利器——HTRF,在激酶研究(kinase)中的应用
通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是 不容易的，因为这些离子很难吸收光子。镧系 元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到 镧系元素上。稀土元素螯合物和穴状化合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并 转移到镧系元素离子上，后者则发出其特征性的长寿命的荧光。
为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定 性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液中反应 时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可 竞争螯合物活性基团，当与 FRET 技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素 与穴状化合物结合，许多限制因素都可去除。
一般地，在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短。传统 FRET 技术的限制因素是由背景荧光引起的，其来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、 化合物和细胞裂解液。检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实 验灵敏度，并使数据分析变得复杂。背景荧光非常短暂（寿命为纳秒级），可以利用时间 分辨荧光方法将其去除。
图 2 ：试剂盒包装
产品特点 应用单克隆抗体保证批次的一致性 在 100 多种丝氨酸/苏氨酸激酶和 60 多种酪氨酸激酶上验证过 酶用量很少 ATP 浓度没有限制，因此可以用 ATP Km 进行筛选药物 每一个底物只有一个位点可以被磷酸化 针对酪氨酸激酶有特殊的试剂可以增强底物的稳定性 整个实验少于 2 小时 反应体系可以减少到 4ul
药物筛选完全手册
药物筛选完全解决方案Wherever you are looking for new drugs, you will findMolecular DevicesDrugTargetsGPCRs Kinases,Phosphatases, PDEsMembraneTransportersIonChannels药物筛选简介药物筛选流程 1药物筛选主要靶点 1GPCR药物筛选GPCR药物筛选简介 2 Molecular Devices为GPCR提供的解决方案 2激酶药物筛选激酶药物筛选简介 7 Molecular Devices为激酶提供的解决方案 8离子通道药物筛选离子通道药物筛选简介 13 Molecular Devices为离子通道提供的解决方案 14膜转运体筛选方案神经递质转运体和脂肪酸转运体简介 19 Molecular Devices为膜转运体提供的解决方案 19Molecular Devices 提供的技术平台21药物筛选是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，系指通过规范化的实验手段从大量化合物或新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性化合物的过程。
是临床新药开发的必经过程。
一个新药从研发到临床使用历时十年以上，耗资10亿美金。
平均而言，每一百万个化合物中最终能被FDA批准上市的只有一个，而上市的药物中，也只有30%的药物能够获得利润，收回其研发成本。
制药公司年收入的20%用在新药的研发上，全球每年在新药上的投资超过300亿美金。
在先导化合物的后续筛选过程中，40%到60%的先导化合物在后续的ADME/T（药物吸收、分布、代谢、分泌和毒性检测）中被淘汰。
72%的药物研发费用被浪费在日益增长的临床耗费、体内无法预测的调控环境以及药物的副作用方面。
因此，选出优良品质的先导化合物是药物筛选的一个至关重要的过程。
各制药公司在药物开发的早期都会收集尽可能多的关于靶点、待测化合物性质、以及现有筛选方法手段优劣性的信息，以确保尽快剔出阴性化合物，拿到优良品质的先导化合物，降低药物筛选的成本。
高校生物化学专业酶抑制剂筛选实验方案
高校生物化学专业酶抑制剂筛选实验方案为了研究酶抑制剂在生物化学领域的应用，本实验旨在筛选具有抑制特定酶活性的化合物，以便深入了解其生物活性和可能的药理效应。
以下是本实验的详细方案：实验材料：1. 目标酶：选择具有明确酶活性的酶作为目标，如乙酰胆碱酯酶（AChE）或蛋白酪氨酸激酶（PTK）等。
2. 酶底物：适合目标酶反应的底物，如乙酰胆碱对于AChE活性的检测。
3. 酶抑制剂样本：准备一系列有机化合物作为潜在的酶抑制剂，如天然产物或化学合成物。
4. 阳性对照组：包含已知具有抑制目标酶活性的化合物作为阳性对照，用于验证实验方法和设定阈值。
5. 阴性对照组：包含不具有抑制目标酶活性的化合物或溶剂，用于验证实验方法和排除假阳性结果。
6. 试剂：如缓冲液、底物浓度递增液、酶抑制剂稀释液等。
实验步骤：1. 预处理：根据实验需要，将目标酶、底物、酶抑制剂样本以及阳性、阴性对照组等准备好。
2. 负对照组实验：a. 在微量试管中加入适量缓冲液作为空白对照组，并记录酶活性测定结果。
b. 加入适量目标酶，使其达到最佳反应条件，并记录酶活性测定结果。
3. 阳性对照组实验：a. 在微量试管中加入适量缓冲液、阳性对照组样本和目标酶，使其达到最佳反应条件。
b. 加入适量底物，启动酶反应，并根据实验方法测定酶活性，作为阳性对照组结果。
4. 酶抑制剂筛选：a. 在微量试管中加入适量缓冲液、酶抑制剂样本和目标酶，使其达到最佳反应条件。
b. 加入适量底物，启动酶反应，并根据实验方法测定酶活性。
c. 比较各个酶抑制剂样本组的酶活性与负对照组的差异，确定是否具有抑制目标酶活性的效果。
5. 数据分析：a. 将实验结果转化为定量数据，如化合物浓度与酶活性的相关性。
b. 统计和分析每个酶抑制剂样本与目标酶的抑制作用，确定有效的化合物。
实验注意事项：1. 严格遵循实验操作规程，使用个人防护装备，如实验手套和防护眼镜等。
2. 每个实验步骤都要准确记录实验条件、操作过程和结果，以备后续分析。
酶抑制剂的筛选初1
酶抑制剂的作用方式
1.直接抑制病原微生物或人体内生物合成 途径中的某种关键酶，减少某种产物的 生成。 2.通过抑制人体内生物合成途径中的某种 酶使人体有益的底物得以积累，从而达 到治疗的目的。 3.通过抑制与某种生物合成途径直接相关 且必需的另一个生化反应的酶来减少有 害物的生成。
酶抑制剂的作用方式
1逆转录酶抑制剂rti2蛋白酶抑制剂3整合酶抑制剂目前国际上治疗艾滋病的药物共17种尚未有治疗艾滋的特效药高效抗逆转录病毒疗法逆转录酶抑制剂法及蛋白酶抑制剂的联合治疗是目前治疗中的基本治疗其他均为辅助治疗如免疫增强剂及中草药设计酶抑制剂筛选方法的基本原理在筛选酶抑制剂时要分离或精制得一定量的筛选酶再根据筛选酶与特定底物的特异性反应后所生成的反应物来设计反应程序从反应体系中底物的减少或消失和生成的产物的数量来判断待筛物的抑制活性强弱
设计酶抑制剂筛选方法 的基本原理
在筛选酶抑制剂时,首先要分离或精 制得一定量的筛选酶，然后再根据 筛选酶与特定底物的特异性反应后 所生成的反应物来设计反应程序,最 后从反应体系中底物的减少或消失 和生成的产物的数量来判断待筛物 的抑制活性强弱。
筛选模型的建立
筛选模型就是在筛选实验中所应用的实 验模型，由于抑制剂筛选要求实验方案 有标准化和定量化的特征，因而在传统 药理实验中常见的动物实验在抑制剂筛 选中较少应用，根据实验模型的不同， 药物筛选可以分为分子水平的筛选和细 胞水平的筛选。
1.比色检测法 比色检测法是最经典的酶检测方法，主要通过 测定反应底物或产物在紫外或可见光下的吸收 值，通过在特定波长下检测吸光值的变化．间 接地反应体系中酶的活性。比色检测法的关键 是在筛选反应体系中含有特定吸收波长、可用 于检测的化合物。对仪器要求简单，普通的酶 标仪就能够满足一般的高通量筛选的要求，也 是最为方便的检测方法之一，但是该方法的灵 敏度有时相对较低，有时为了达到信号在线性 范围内，需要较大的酶量和底物浓度。
产纳豆激酶菌株的分离筛选与鉴定的开题报告
产纳豆激酶菌株的分离筛选与鉴定的开题报告
标题：产纳豆激酶菌株的分离筛选与鉴定
背景
纳豆是一种在日本和其他国家受欢迎的膳食品，由大豆经过发酵制成。
纳豆发酵过程中，菌群会产生一种特殊的激酶酶，被称为纳豆激酶（nattokinase），具有防止血栓形成和减少高血压的作用。
因此，纳豆激酶已成为研究的热点之一，许多研究组正在寻找新的菌株或改良现有菌株以提高纳豆激酶的产量和活性。
在此背景下，分离筛选和鉴定纳豆激酶菌株将有助于发现高产菌株和优化纳豆激酶的发酵工艺。
方法
1. 分离纳豆激酶菌株：从不同来源的发酵纳豆的样品中分离菌群，并进行初步鉴定和筛选。
2. 筛选高产菌株：使用定量酶测定方法，筛选出纳豆激酶高产的菌株。
3. 鉴定菌株：通过形态学、生理生化特性和分子生物学方法对高产菌株进行确认和鉴定，比较其与已知的纳豆激酶菌株的异同。
预期结果
本项目将筛选到高产纳豆激酶菌株，并对菌株的鉴定和鉴别进行系统研究和分析，以期发现新的产纳豆激酶菌株或改良现有菌株的技术路线。
激酶抑制剂测试-检测方法详细介绍
4E-BP1可被专一性的抗磷酸化4E-BP1的抗体识别，并结合标记了辣根过氧化素酶的抗抗
汉 体，随后加入化学发光试剂并检测发光强度，以发光强度的大小反映酶活的高低。 ELISA法的优点是定量准确，信号值可以通过二级抗体或者亲和素-生物素系统放大，
Adapta™。其中ADP Hunter™可以利用激酶反应中产生的ADP，将烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate, PEP)转化为丙酮酸(pyruvate)，并最终转化为荧光信号。该方法可以 实时监测激酶的活性变化。而Transcreener™和Adapta™则是在ADP的特异性单克隆抗体上 标记铕(Eu)原子，同时再使用d2或者AlexaFluour647等荧光分子标记的ADP来竞争激酶反应 的产物ADP，用于检测ADP的生成量。 3.2.3 检测ADP生成量的方法的优缺点
2.4 核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
NMR的原理是用无线电波(60 cm~300 m)照射分子时，原子核自旋能级的跃迁，由于局 部抗磁屏蔽效应的存在，不同化学环境的原子核所吸收的频率不同，从而产生不同的化学
武 位移。常见的NMR有氢谱、碳谱、氮谱等等。氢谱主要研究氢分布，碳谱研究碳骨架的信
两类。
汉 1.1 膜过滤方法 在该方法中，激酶反应使得多肽产物被32P -ATP或者33P -ATP标记。该产物会结合在过
合 滤膜上，而其他游离的放射性同位素则会被磷酸盐洗脱，从而不会干扰实际检测。其主要
优势在于可以应用于激酶和多肽底物的检测上而不受其他条件的限制。该方法不需要对多
一、激酶筛选方案
十年前当人类基因组刚刚发布的时候，在成千上万的蛋白库中理论预测可能为激酶的蛋白大概500种以上。
在已公认的药物靶点中，蛋白激酶已成为药物筛选领域中第二大类药物筛选靶点。
激酶包括蛋白激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶。
蛋白激酶是通过共价调节的方式将磷酸基团转移到其他蛋白上发挥功能的，它们是激酶药筛靶点分子中的最大一类。
蛋白激酶表达和功能失调会导致癌症和其他疾病。
蛋白磷酸酶和磷酸二酯酶则是信号转导通路中的关键调控因子，在癌症、神经退化、糖尿病和其他疾病中发挥关键作用。
传统研究激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶活性的实验方法有两种：一是通过放射性同位素标记，另一种是高特异性的抗体标记；前者存在安全和废弃处理的问题，而后者则有昂贵和费时的问题。
激酶信号图 一、激酶筛选方案为了解决这些现存问题，Molecular Devices推出了专利的IMAP ®技术，一种基于磷酸基团检测的非放射性和均相分析方法。
IMAP技术不是基于特异抗体的技术，而是一种通用技术平台，可应用于任何激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的检测。
酶反应混合体系是由以下两个组分组成：1）荧光标记的底物+酶+反应buffer；2）IMAP结合体系，特异结合磷酸化的底物，并终止酶反应。
底物与IMAP珠子的结合作用可以由荧光偏振(FP)和时间分辨荧光共振(TR-FRET)来检测。
IMAP提供了一个应用于激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶筛选的完整的实验体系，也成为了准确分析激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的通用平台技术。
另外，为了帮助研究者来选择合适的激酶底物，Molecular Devices还开发了IMAP Substrate Finder Kits可以快速准确地在384微孔板中检测一种或几种激酶相对于多种多肽底物的活性。
IMAP ®TechnologyIMAP Reagent KitsCAMKTKLCMGCAGC CK1STEGYC TK 目前，IMAP技术已经应用到的激酶分布图蛋白酶酶和磷酸酶 磷酸二酯酶IMAP 技术原理:时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)和荧光偏振(FP)1. IMAP TR-FRET检测法激酶与荧光标记的多肽或蛋白底物反应后，加入亲和溶液，在此体系中，纳米粒子珠会再共价连接上一个铽元素标记的供体分子(Tb)-Donor；当磷酸化的底物多肽或蛋白分子结合到这个纳米粒子上，磷酸化的底物小分子就会与粒子珠上的铽元素标记分子(Tb)-Donor靠近，因而就会在(Tb)-Donor和磷酸化底物小分子间产生TR-FRET效应，通过检测这个效应来检测酶活性。
激酶抑制剂测试第四章节-激酶抑制剂检测方法详细介绍（二）
激酶抑制剂测试第四章节-激酶抑制剂检测⽅法详细介绍（⼆）1 均相⾮放射性同位素法上述这些⾮均相的⽅法，存在操作繁多的问题。
随着技术的发展，越来越多的均相⾮放射性⽅法开始被应⽤于激酶活性的检测之中，根据实验原理的不同，可以分为检测ATP的量、检测ADP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。
1.1 检测剩余的ATP的量有些⽅法可以利⽤测定激酶反应中未被消耗掉的ATP量来检测酶活，例如Promega公司的Kinase-Glo™技术。
该⽅法利⽤激酶反应后剩余的ATP，将荧光素转化为氧化荧光素，并发出化学冷光，荧光信号值与激酶活性成反⽐。
该试剂盒⾥的重组热稳定荧光素酶(Ultra-GloTM)，发出稳定的“辉光”型荧光，半衰期⼤于5个⼩时，不需要配套进样器的荧光仪，可成批处理⼤量的微孔板。
Ultra-GloTM发出的稳定荧光可适⽤于多种检测条件，与特定的缓冲液组成相搭配，可减少来⾃化合物的⾃发荧光的⼲扰。
该检测⽅法的成本很低，但为了产⽣⼤于2倍的信噪⽐，⾄少需要50%的转化率，因此不能⽤于进⾏激酶性质的研究，但在ATP产⽣50%~80%转化率的时候，抑制剂的活性的偏移在2到3倍之间，处于可以接受的范围，因此该⽅法可适⽤于抑制剂的⾼通量筛选。
1.2 检测ADP的⽣成量该类⽅法较易检测⼀些⾮多肽底物的激酶活性，如脂激酶，同时也可以测定⼀些ATP酶的活性。
该类⽅法⼜可以分为ADP偶联反应，即将ADP转化成其他物质并进⾏检测，例如Promega的ADPGloTM；依靠ADP抗体检测的⽅法，例如Invitrogen的Adapta®，Cisbio的Transcreener®等⽅法；1.2.1 ADP-GloTMADP-Glo™(原理见图1)是Promega公司开发的⼀种发光法激酶检测⽅式，检测激酶反应中所形成的ADP的量来反应激酶活性。
在该检测⽅法中，激酶反应中剩余的ATP会⾸先被ADP-Glo试剂消耗掉；接下来，激酶反应中⽣成的ADP则会被激酶检测试剂还原成ATP；然后，ATP在Ultra-Glo™萤光素酶的作⽤下，与荧光素反应发光，发光信号与激酶活性正相关。
产纳豆激酶细菌的筛选及酶学性质的研究的开题报告
产纳豆激酶细菌的筛选及酶学性质的研究的开题报告一、课题背景和研究意义：纳豆是一种日本传统食品，由大豆经过发酵制作而成。
在纳豆中存在着一种特殊的酶——产纳豆激酶（nattokinase）。
这种酶能够加速凝血物的溶解，具有预防心血管疾病、降低血脂、防止血栓形成等功效，因此备受关注。
为了开发纳豆中产纳豆激酶的产生技术，有必要对产纳豆激酶的酶学性质进行研究，并开展该酶生产菌株的筛选。
二、研究目的和内容：本研究旨在通过筛选纳豆中的产纳豆激酶生产菌株，并进一步研究其酶学性质，为产纳豆激酶的工业化生产提供理论基础。
1. 筛选合适的产纳豆激酶生产菌株。
首先，收集纳豆中的微生物样品，并通过筛选法得到具有产纳豆激酶能力的菌株；其次，对菌株进行鉴定和优化培养条件，提高产酶效率。
2. 测定酶学性质。
对产纳豆激酶的纯化步骤进行优化，得到较纯的产纳豆激酶，并测定其酶学性质，如最适温度、最适pH、稳定性以及酶动力学参数等。
三、研究方法：1. 细菌的样品收集与筛选收集纳豆中的不同微生物菌株，采用平板筛选法筛选出能够产生产纳豆激酶的微生物菌株。
2. 细菌的鉴定和培养条件的优化针对筛选出的菌株进行鉴定，并优化其培养条件和发酵条件，提高产酶效率。
3. 酶的纯化及酶学性质分析对产纳豆激酶的纯化过程进行优化，得到较纯的酶制备。
然后对纯化得到的酶进行酶学性质的测定，如酶的最适温度、最适pH、稳定性以及酶动力学参数等。
四、预期结果：通过本研究，将获得产纳豆激酶的优良制备菌株，并进一步研究其酶学性质，为产纳豆激酶的工业化生产提供技术支持，推动该生物活性物质在保健食品和药品领域的应用。
高纳豆激酶酶活枯草芽孢杆菌的筛选及菌种鉴定
１ 材料 与方法
１ １ 材料及试 剂 ．
作者简介 ：马明 （９ １ ）男，山东莱阳人，在读硕 士研 究生 ，主要研 究方 向为食 品发酵工程 。 １８ ～ ＋ 通讯作者 ：杜中 国 食 物 与 营 养
１Ｚ ｕｍ１ ０ｃ ］ 。以 ２ ｆ ％接种量接种 至液体 发酵培养基 （ 装液
１ ３ 试 验方法 ．
１ ３ １ 菌株的分离与初筛 ．． 将菌种加入无菌生理盐水 中振荡 ３ ｍｉ， ０ ｎ 进行稀释
抗肿瘤及重要的溶血栓等医药 功效 【。 ５ 纳豆激酶 来源 于 】 食品 ， 无毒 副作用 ，而且价廉易得 ， 为此开发溶栓纳 豆
保健食 品具有实用价值 。本文 旨在对产纳豆激酶菌株进 行筛选 、鉴定 ，以获得理想的纳豆发酵 生产用菌种 。
量 ５ｍｌ ５ ｍ１，３ ℃、１０ｐ ０ ／０ ） ７ ２ ８ ｒｍ恒 温培养 。２ ｈ ４ 后取发 酵液 ， ５ ０ｐ ３ ０ ｒｍ离心 １ｍｉ。 ０ ｎ 取上 清液 １ １ ０ 点样与纤维 蛋 白平板上 ，３ ℃ ， ７ 恒温 １ｈ ８ 后测量每个样品的溶解透 明圈直径 ，计算酶活 。
平板分离 ，涂 布于酪蛋 白平板 ，３ ￣ ７ Ｃ下培养 ３ ｈ ６ ，选取
透 明圈直径与菌落直径 比值 较大的菌落进行连续分纯与
继 代后 ，作为初筛得到 的菌株保藏备用 。 １３ ２ 菌株 的复筛 ．． 将 初筛 菌株接 入液体 种子培 养基 （ 装液量 ３ ｍｌ ０ ／ ２ ０ ） ７Ｃ、１０ｐ ５ ｍ１，３ ￣ ８ ｒｍ恒温培 养 ２ｈ 最 终活菌数约为 ４，
Ｎ ａ Ｈ ＰＯ４ ２％ ， Ｎ ａ ２ ２ ０． Ｈ ＰＯ４ ． ％ ， Ｃａ ２ ２ ， Ｍ ｇＳＯ ４ ０１ Ｃ１０． ％ ０．５ ， ｐＨ７０～ ７． ０％ ． ２。
酪氨酸激酶底物的筛选与特征分析
酪氨酸激酶底物的筛选与特征分析酪氨酸激酶是一类重要的信号转导分子，在细胞生命活动中扮演着重要的角色。
酪氨酸激酶可以磷酸化其底物，导致底物的活性、稳定性、亲和力和定位等方面的变化。
由于底物的活性、稳定性和亲和力的变化，酪氨酸激酶的底物特异性是非常重要的。
因此，酪氨酸激酶底物的筛选与特征分析是酪氨酸激酶研究的重要方向之一。
一、酪氨酸激酶底物筛选目前，常用的酪氨酸激酶底物筛选方法主要包括化学筛选、生物筛选和生物信息学筛选三种方式。
化学筛选：化学筛选的主要优点在于速度快，操作简便，一次可以筛选出大量潜在的底物。
其基本操作流程为：首先，化学修饰底物，使其具有磷酸化背景（如添加亚硝基硫代甘氨酸）。
接下来，将修饰后的底物加入已知的激酶反应体系中，经过一定的反应时间后，采用质谱或放射性测定等手段检测出与激酶相结合的底物。
然后，通过质谱分析确定底物的化学结构，最后由生物学实验验证其是否真是酪氨酸激酶底物。
生物筛选：生物筛选的主要优点是筛选出的底物具有生物活性，适用于分析酪氨酸激酶催化的生物效应。
其基本操作流程为：首先，挑选具有代表性的组织或细胞，提取其中酪氨酸激酶。
接下来，向酪氨酸激酶反应液中加入不同的底物组分，反应一定时间后，通过生化方法检测出与酪氨酸激酶反应的底物。
然后，对筛选出的底物进行进一步的生物学，生物化学和分子生物学研究。
生物信息学筛选：生物信息学筛选是一种虚拟筛选技术，可预测成百上千的可能酪氨酸激酶底物。
该方法基于计算机分析酪氨酸激酶底物信息学特征。
具体操作为先确定酪氨酸激酶的保守序列，然后基于该序列进行分析预测其底物。
具体可以通过计算机模拟和数据挖掘等方式实现。
二、酪氨酸激酶底物特征分析酪氨酸底物特征的分析可从底物序列特点、磷酸化区域、细胞定位、生物功能等角度进行。
底物序列特点：研究发现，不同酪氨酸激酶对底物序列的特异性不同。
一般情况下，酪氨酸磷酸化靶标包括酪氨酸和苏氨酸，有的酪氨酸激酶还可以催化龙胆氨酸的磷酸化。
激酶谱筛选实验流程
激酶谱筛选实验流程激酶谱筛选实验可是个很有趣又有点小复杂的实验呢。
一、实验准备。
咱得先把要用的东西都找齐喽。
试剂方面，激酶缓冲液那是必须的，就像做饭得有油盐酱醋一样。
还有各种激酶底物，这可都是实验的关键角色。
仪器呢，酶标仪得提前检查好，要是它出问题，就像汽车没油一样，整个实验都得卡壳。
还有移液枪，这就像咱的魔法棒，得确保它能精准地吸取液体，要是吸取的量不对，那可就“差之毫厘，谬以千里”啦。
另外，实验样本也很重要哦。
样本的采集和处理得小心翼翼的，就像呵护小宝贝一样。
如果是细胞样本，得保证细胞状态良好，要是细胞都病恹恹的，那实验结果肯定也不准。
蛋白质样本的话，纯度要高，不能有太多杂质，不然就像在一群捣乱的小怪兽里找英雄一样困难。
二、实验操作。
先来说说激酶反应这一步。
把激酶和底物放在激酶缓冲液里，就像把小伙伴们聚在一个小房间里开派对一样。
不过这个派对可是有规则的，温度和时间都得控制好。
温度就像派对的气氛调节器，要是太热或者太冷，小伙伴们就玩不起来啦。
时间也是，太长或者太短，反应都不完美。
接着就是检测环节啦。
把反应后的样本放到酶标仪里，这时候就像把考试卷交给老师一样，满心期待又有点小紧张。
酶标仪会给出数据，这个数据就像宝藏的密码一样，我们得好好解读。
有时候数据可能不太理想，就像你满心期待收到的礼物不是自己想要的那样，但是别灰心，这时候就需要重新审视前面的步骤，是不是哪里出了小差错。
三、实验后的思考。
做完实验，可不能就这么拍拍屁股走人。
得好好看看结果，要是结果好，那就像打了胜仗一样，值得好好庆祝。
可以和小伙伴们分享自己的经验，就像分享美食一样快乐。
要是结果不好，也别太沮丧，就当是一次探险，虽然没有找到宝藏，但是在过程中发现了很多新的小路。
可能是样本处理的问题，也可能是某个试剂的浓度不对。
这时候就需要我们像侦探一样，去寻找线索，重新设计实验，再来一次。
每一次的失败都是通往成功的垫脚石，只要我们不放弃，总有一天能把这个激酶谱筛选实验做得又好又漂亮。
一、激酶筛选方案
十年前当人类基因组刚刚发布的时候，在成千上万的蛋白库中理论预测可能为激酶的蛋白大概500种以上。
在已公认的药物靶点中，蛋白激酶已成为药物筛选领域中第二大类药物筛选靶点。
激酶包括蛋白激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶。
蛋白激酶是通过共价调节的方式将磷酸基团转移到其他蛋白上发挥功能的，它们是激酶药筛靶点分子中的最大一类。
蛋白激酶表达和功能失调会导致癌症和其他疾病。
蛋白磷酸酶和磷酸二酯酶则是信号转导通路中的关键调控因子，在癌症、神经退化、糖尿病和其他疾病中发挥关键作用。
传统研究激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶活性的实验方法有两种：一是通过放射性同位素标记，另一种是高特异性的抗体标记；前者存在安全和废弃处理的问题，而后者则有昂贵和费时的问题。
激酶信号图 一、激酶筛选方案为了解决这些现存问题，Molecular Devices推出了专利的IMAP ®技术，一种基于磷酸基团检测的非放射性和均相分析方法。
IMAP技术不是基于特异抗体的技术，而是一种通用技术平台，可应用于任何激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的检测。
酶反应混合体系是由以下两个组分组成：1）荧光标记的底物+酶+反应buffer；2）IMAP结合体系，特异结合磷酸化的底物，并终止酶反应。
底物与IMAP珠子的结合作用可以由荧光偏振(FP)和时间分辨荧光共振(TR-FRET)来检测。
IMAP提供了一个应用于激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶筛选的完整的实验体系，也成为了准确分析激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的通用平台技术。
另外，为了帮助研究者来选择合适的激酶底物，Molecular Devices还开发了IMAP Substrate Finder Kits可以快速准确地在384微孔板中检测一种或几种激酶相对于多种多肽底物的活性。
IMAP ®TechnologyIMAP Reagent KitsCAMKTKLCMGCAGC CK1STEGYC TK 目前，IMAP技术已经应用到的激酶分布图蛋白酶酶和磷酸酶 磷酸二酯酶IMAP 技术原理:时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)和荧光偏振(FP)1. IMAP TR-FRET检测法激酶与荧光标记的多肽或蛋白底物反应后，加入亲和溶液，在此体系中，纳米粒子珠会再共价连接上一个铽元素标记的供体分子(Tb)-Donor；当磷酸化的底物多肽或蛋白分子结合到这个纳米粒子上，磷酸化的底物小分子就会与粒子珠上的铽元素标记分子(Tb)-Donor靠近，因而就会在(Tb)-Donor和磷酸化底物小分子间产生TR-FRET效应，通过检测这个效应来检测酶活性。
激酶谱筛选
激酶谱筛选激酶谱筛选是一种利用激酶反应的技术，以识别和提取具有活性的酶作为其主要目的。
激酶是一种指令非常特殊的蛋白质，它们可以改变某些化合物的化学性质以及它们的分子形状和结构。
激酶的活性通常确定其特定的激活能量，以及在特定温度和pH下的活性峰大小。
从这个意义来看，激酶谱筛选是一种检测、分离和鉴定活性酶的技术，以便满足各种应用要求。
激酶谱筛选有多种不同的方法，但最常用的技术是分析激酶反应特性所需要的表征。
利用这些技术，可以找到特定的激酶，并进行定量检测，以对激酶活性进行分类。
这种技术非常有用，因为它不仅可以发现某种特定的激酶，而且还可以估计其特定的活性。
激酶谱筛选技术可用于不同的应用，如分析酶类和抗性性质，分析激酶反应和优化生产方程式等。
此外，这项技术可以用来筛选新的激酶，以优化特定应用的性能，将控制杂质转化为更可预测的过程，并获得更高的可分辨性和稳定性。
激酶谱筛选的步骤包括激酶颗粒的大小测定、酶反应激活能力的检测和激酶反应的绘图表征。
首先，分析激酶颗粒的大小，以便确定激酶的特定活性范围，这有助于激酶的有效鉴定。
然后，利用激酶反应检测仪，检测激酶反应激活能力，以了解激酶反应的激活和抑制情况。
最后，使用绘图工具，测量激酶反应的活性，以及各种温度和pH下激酶反应的特性和变化。
通过充分利用激酶谱筛选技术，我们可以获得许多有用的信息。
可以指导精确调节酶特性及催化条件以改善应用特性，识别不同特性的酶类，以及检测活性酶活性是否与潜在的反应有关。
此外，还可以用来开发新的催化剂，以满足未来应用的需求。
总之，激酶谱筛选技术对于研究和开发酶及其应用具有重要的意义，它可以提供准确的、有效的酶反应的分析结果。
激酶谱筛选是一种利用激酶反应的技术，它可以满足不同应用的需求，它也可以帮助我们识别和提取具有活性的酶，并检测激酶反应的活性是否与潜在的反应有关。
通过对激酶反应特性的检测，可以准确的确定激酶的活性和特性，并优化应用的性能。
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十年前当人类基因组刚刚发布的时候，在成千上万的蛋白
库中理论预测可能为激酶的蛋白大概500种以上。
在已公认
的药物靶点中，蛋白激酶已成为药物筛选领域中第二大类药
物筛选靶点。
激酶包括蛋白激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶。
蛋白激酶是通
过共价调节的方式将磷酸基团转移到其他蛋白上发挥功能
的，它们是激酶药筛靶点分子中的最大一类。
蛋白激酶表达
和功能失调会导致癌症和其他疾病。
蛋白磷酸酶和磷酸二酯
酶则是信号转导通路中的关键调控因子，在癌症、神经退
化、糖尿病和其他疾病中发挥关键作用。
传统研究激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶活性的实验方法有两
种：一是通过放射性同位素标记，另一种是高特异性的抗体
标记；前者存在安全和废弃处理的问题，而后者则有昂贵和
费时的问题。
激酶信号图 一、激酶筛选方案
为了解决这些现存问题，Molecular Devices推出了专利的
IMAP ®技术，一种基于磷酸基团检测的非放射性和均相分析方
法。
IMAP技术不是基于特异抗体的技术，而是一种通用技术
平台，可应用于任何激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的检测。
酶反应混合体系是由以下两个组分组成：
1）荧光标记的底物+酶+反应buffer；
2）IMAP结合体系，特异结合磷酸化的底物，并终止酶反应。
底物与IMAP珠子的结合作用可以由荧光偏振(FP)和时间
分辨荧光共振(TR-FRET)来检测。
IMAP提供了一个应用于激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶筛选
的完整的实验体系，也成为了准确分析激酶、磷酸酶和磷酸
二酯酶的通用平台技术。
另外，为了帮助研究者来选择合适的激酶底物，
Molecular Devices还开发了IMAP Substrate Finder Kits
可以快速准确地在384微孔板中检测一种或几种激酶相对于多种多肽底物的活性。
IMAP ®
Technology
IMAP Reagent Kits
CAMK
TKL
CMGC
A
GC CK1
STE
GYC TK 目前，IMAP技术已经应用到的激酶分布图蛋白酶酶和磷酸酶 磷酸二酯酶
IMAP 技术原理:时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)和荧光偏振(FP)
1. IMAP TR-FRET检测法
激酶与荧光标记的多肽或蛋白底物反应后，加入亲和溶液，在此体系中，纳米粒子珠会再共价连接上一个铽元素标记的供体分子(Tb)-Donor；当磷酸化的底物多肽或蛋白分子结合到这个纳米粒子上，磷酸化的底物小分子就会与粒子珠上的铽元素标记分子(Tb)-Donor靠近，因而就会在(Tb)-Donor和磷酸化底物小分子间产生TR-FRET效应，通过检测这个效应来检测酶活性。
激酶和磷酸酶
磷酸二酯酶
2. IMAP FP检测法
在激酶与荧光标记多肽底物反应后，加入亲和溶液，磷酸化的小分子多肽底物就会结合到大分子的三价金属离子的纳米珠子上，从而降低了小分子底物分子的自旋速度，因而也就增加了其偏振化程度。
（STE/CMGC/CK1/TKL）
酪氨酸激酶类
底物发现试剂盒
IMAP ® Assays仪器兼容性IMAP Substrate Finder实验流程
3. IMAP Substrate Finder
在一块384孔板上包含50种以上已经经过验证的多肽底物
(Substract), 每一底物至少有四个重复，方便客户用于筛选不同
的参数。
试剂盒附有Substrate Map，方便客户分析核对数据。
为了简化实验设计、实验分析和达到最佳实验效果，MD已将
IMAP Assay Kits在FlexStation ®3和SpectraMax ® M4/M5/M5e，
Paradigm系统，以及FilterMax F3，F5上进行了优化，此试剂盒
有大体积装适用于高通量筛选和小体积装适用于低通量应用。
鞘氨醇脂肪酸激酶实验分析不仅是采用IMAP TR-FRET第一类激酶家族，也建立了一个非常重要的高通量药物筛选靶位。
1. 鞘氨醇脂肪酸激酶的IMAP ®
(TR-FRET)筛选平台研究
三种底物鞘氨醇
水平-鞘氨醇激
酶1浓度变化曲线三种底物鞘氨醇水平-鞘氨醇激
酶2浓度变化曲线
底物-3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1) 浓度效应曲线，四种体系：1）活性 PDK + 失活SGK 底物 2）仅活性SGK 底物3）仅失活SGK 底物 4）仅活性 PDK
Syk络氨酸激酶的IMAP-FP分析与免疫
荧光偏振(FPIA)分析对比，两图中：
60%激酶抑制：S/N值A<B；Z’ 因子A<B EC50：A>B 2. 蛋白激酶的IMAP ® (FP)筛选平台研究
鞘氨醇脂肪酸激酶的IMAP ® (TR-FRET)筛选平台实验总结：
● 低背景 ● 不需抗体 ● 低化合物干 ● 通用平台 ● 底物浓度灵活 ● 比率计算 ● 高灵敏度 ● 高通量兼容
鞘氨醇激酶1和2 - ATP 的依赖
三种底物鞘氨醇
水平-鞘氨醇激
酶1浓度变化曲线三种底物鞘氨醇水平-鞘氨醇激酶2浓度变化曲线
● 可广泛应用于各种激酶的药物筛选 (多样的底物选择和< 1μM 及 >300 μM的ATP浓度范围)
● 与免疫荧光偏振相比较具有更大的信号检测范围
● 可作为激酶级联效应研究，使得处于非活性状态下的激酶抑制物鉴定成为可能
● 荧光标记的蛋白可作为激酶底物3. 蛋白激酶PKCα和CDK5/p35针对不同底物的稀释效应曲线研究
蛋白激酶的IMAP ®
(FP) 筛选平台实验总结
神经递质转运体的功能失调是神经抑制和退行性疾病，如Alzheimer和Parkinson形成的重要原因。
监控5-羟色氨，去甲肾上腺素，多巴胺等神经递质的再摄取过程对进一步理解这些疾病起关键作用。
脂肪酸在多个细胞生物学过程中都发挥重要作用，如线粒体的氧化过程，生物膜的合成过程和能量的储存过程等。
细胞内脂肪酸的浓度病理性增加，将导致一系列的疾病，如细胞凋亡，胰岛素受体脱敏，2型糖尿病，肥胖和心血管疾病等。
因此理解脂肪酸的摄取和调控过程将对生物医学的研究和药物的开发有着重大意义。
常规筛选神经递质转运体和脂肪酸转运体的方法都是同位素标记法和复杂的荧光标记法，这些方法或需要通量较低的荧光激活的细胞分选过程，或需要洗涤，损伤细胞。
Molecular Devices为膜转运体的制药领域的研究者提供了两类试剂盒：神经递质摄取转运体试剂盒和QBT TM脂肪酸摄取转运体试剂盒。
两类试剂盒都是同源、免洗、用于活细胞荧光检测的，可扩展到高通量筛选。
一. 神经递质转运体试剂盒
原理
该试剂盒使用一个Mask dye和一荧光物质，其中荧光物质的特性与神经递质5-羟色氨，去甲肾上腺素，多巴胺等相似，可以被相应的转运体摄取入细胞内。
细胞外荧光物质的荧光信号被Mask dye掩盖，Mask dye无法进入细胞内，因此细胞内的荧光物质的信号就会释放出来。
荧光信号变化可被具荧光功能的酶标仪，如SpectraMax, FilterMax, Paradigm，以及FLIPR检测。
Nisoxetine抑制表达在HEK细胞上的5-羟色氨转运体
稳定表达人5-羟色氨转运体的HEK细胞以
每孔10,000的细胞密度种植在多聚赖氨酸包被
的384孔板上过夜。
实验前移去培养基，将
Nisoxetine溶于含0.1%BSA的HBSS中，
37°C下孵育细胞10分钟。
然后加入染料。
使
用FlexStation® 3检测荧光信号的实时变化。
二、膜转运体筛选方案
二. 脂肪酸转运体试剂盒
原理
QBT脂肪酸摄取试剂盒使用了一种荧光标记的脂肪酸类似物，该物质可被脂肪酸转运体摄取入细胞内，导致细胞内荧光信号增高。
该试剂盒也同样含有Mask Dye，掩盖细胞外的荧光信号。
细胞内荧光信号的变化可用酶标仪的底读方式实时检测。
相对于对照而言，脂肪酸转运体的抑制剂会降低细胞内荧光信号的强度。
Leptin的抑制效应
3T3L1脂肪细胞以50,000个/孔的密度种植
于96孔板中，培养基为DMEM+FBS，培养5
个小时，然后除去血清，在100 nM leptin存在
或不存在的情况下继续培养1小时。
加入10 nM
Insulin，37°C, 5% CO2下再培养30分钟。
最
后加入100µl脂肪酸染料。
FlexStation ®3用于
检测细胞内荧光信号的实时变化。
图中：A:
insulin, B: insulin and leptin, C: basal.。