免疫层析标记物及其标记技术

原胶乳
免疫胶乳
荧光胶乳
荧光胶乳颗粒粒度均一、单分散性好，有较好的生物相容性；形成 微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定。
荧光乳胶层析法比一般的胶体金等固相免疫灵敏10～100倍，可以 有效排除背景色的干扰，且能够对待测物进行定量测定。
荧光胶乳颗粒的缺点是荧光染料系物理掺杂，容易发生泄漏，同时 高分子胶乳颗粒的表面修饰不够灵活，且由于多数具有输水性质， 而易发生非特异性吸附。
QDs激发谱宽而发射谱窄，并且具有较大的Stokes位移，都在很大 程度上提高检测的准确性；
QDs荧光寿命长，即不易衰变，稳定性高，可重复检测。 QDs在制备、修饰及抗原抗体标记等环节受到技术要求制约，结合
物稳定性也有待提高，并且检测时需紫外光作为激发光，仪器设备 要求和成本都较高。
免疫磁珠
上转磷光颗粒
上转磷光材料( up-convertingphosphor，UCP) 是新近发展起来的 由 2 种稀土金属元素（分别作为光吸收子和发射子）掺杂于氧化硫 等惰性材料中构成的一类能上转发光产生磷光的纳米级示踪材料。
上转磷光颗粒
天然生物材料不具备上转发光的特性，其发光信号不受检测环境的影 响，故样品本底低而灵敏度高，非常适合定量检测。
免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB） 是包被有单克隆抗体的 磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性结合形成复合物，是 近年来发展起来的一项新的免疫学技术。磁性免疫层析技术利用超 顺磁性纳米微粒作为标记物，由高灵敏度磁性检测仪测量包被了免 疫复合物的磁性微粒所产生的局部磁场效应，而得出待测分析物的 um dots, QDs）又称荧光半导体纳米颗粒，用于生物 探针的量子点主要由第二副族和第六主族的元素组成，如硒化镉（ CdSe）、硫化锌（ZnS）、碲化镉（CdTe）、硫化镉（CdS）等。 粒径多介于1~10 nm，极小的粒径，外观似点状，故得名为量子点。
量子点
QDs的发射光谱可以通过改变QDs的尺寸大小来控制，用单一波长 的光即可激发产生多种不同颜色的荧光，被认为是最适合作为多标 记检测的标记物；
胶体金免疫层析技术不足
采用物理吸附的方法结合，抗原/抗体容易从金纳米颗粒表面脱落下 来，标记物不稳定。 只能给出定性或半定量的结果，由于仪器的限制，目前还未能准确的 定量。
荧光胶乳
荧光胶乳是指将荧光染料通过物理吸附法、自组装法、化学键合 法、共聚法、包埋法等方法吸附或包埋到粒子内而形成的直径在 纳米至微米级（0.01~10 μm）范围内，受激发光源激发能发出荧 光的固体微粒。
胶乳标记技术
采用羧基化（COOH）的荧光微球，微球大小在200~500nm（F4、 F1、F2)。
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如柠檬酸钠、白磷、抗 坏血酸、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由 于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶 溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。
胶体金
胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗粒表面的过程。由 于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，阻止了胶 体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。
免疫磁珠
免疫层析标记技术
免疫层析标记技术
胶体金标记技术
蛋白质的预处理： • 蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成份。盐类成份能影响胶体金
对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉； • 用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。 蛋白与胶体金结合最佳pH确定 • 0.1mol/LK2CO3调pH，原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略偏碱。 胶体金与蛋白质的结合 • 确定所用蛋白比例（一般15~20ug/mL胶体金），加入BSA，PEG等稳定剂。 免疫胶体金的纯化 • 超速离心，复溶液保存。
待
层析方向
免疫反应
测
物
T
C
免疫层析技术基本原理示意图
免疫层析技术概况
胶体金免疫层析技术
荧光胶乳标记免疫层析
标记物稳定性差，结果靠肉眼观测，检测灵敏度低， 只能用于定性或半定量检测。上转磷光标记免疫层析
新型免疫层析技术
时间分辨荧光免疫层析
量子点标记免疫层析 纳米磁珠标记免疫层析
免疫层析标记物
胶体金
免疫层析标记物及其标记技术
定量技术部：张赛
1
免疫层析技术概况
2
免疫层析标记物
3
免疫层析标记技术
4
胶乳标记过程中常见问题
免疫层析技术概况
免疫层析技术概况
免疫层析测定法（Immunochromtogaphic Assay，简称ICA） 是出现于20世纪80年代初期，将免疫标记技术与层析技术结 合的一种新型检测技术。
时间分辨荧光纳米粒子
荧光激发光波长范围较宽，发射光谱峰范围窄，是类线光谱，有利于 降低本底荧光强度，提高分辨率。
激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移，有利于排除非特异荧 光的干扰，增强测量的准确性。
标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境 中荧光物质对检测结果的影响。
与易淬灭的荧光素标记物不同，UCP 不存在光学衰减且化学惰性强， 不受样品腐蚀或标记物自身衰变等影响，具有稳定的发光特性，可长 期存放和重复检测。
军事医学科学院微生物流行病研究所、北京热景生物技术公司，已 经在UPT技术平台上研制成功多项快速定量检测试剂并产业化。
时间分辨荧光纳米粒子
时间分辨荧光免疫分析法是用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元 素铕(Eu3+)、铽(Te3+)及钐(Sm3+)、镝(De3+)等螯合物的发光特点，用时 间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨， 可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
静电作用力
富含赖氨酸、精氨酸
作用力
疏水作用力
非极性氨基酸（色氨酸、 亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨 酸）
配位键结合力
含硫氨基酸（半胱氨酸和 甲硫氨酸）
胶体金
胶体金免疫层析技术优点
几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单，效率高，用量少，基本不改 变被标记蛋白的活性。 检测结果直接用颜色显示，肉眼判断容易，不需要特别仪器设备，操 作简便。