DNA

O
CPG
欲合成的寡核苷酸链3′末端核苷(N1) 以其3′OH通过 1个长的烷基臂与固相载体【不溶性的高分子物质，常 用的有硅胶S、交联的聚苯乙烯、可控微孔玻璃珠 （CPG，controlled pore glass）等】耦联。CPG的孔 径根据所合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小 于40bp时，选择孔径500埃，链长大于40bp时，使用 1000埃CPG，使用CPG的缩合效率高达98%-99.9%， 可以满足合成长达140bp的寡核苷酸的条件。 核苷酸的5’羟基用二甲氧基三苯甲基（DMTr）保护。
DMTrO
N2
O
O
P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
• 上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历 一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固 定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解 物则通过过滤或洗涤除去。
• 6.切离，脱保护：当整个链达到预定的长
度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)。 一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、 苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT。
纯化
根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯 化的方法。常用的纯化方法有：C18柱、 OPC柱、PAGE和HPLC。
定量
• 根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定 量。
其它标记引物
• 5'-Biotin-CE Phosphoramidite
• 3'-(6-FAM)-CPG
HO
N1
O
乙酸酐和N-甲基咪唑
CPG
O CH3CO N1
O
CPG
5.氧化：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三 价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常 用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应 注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他 氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 Oxidiser (0.1M) (ABI) 0.1M Iodine in THF/pyridine/water
dichloromethane N
DMTrO
1
O
TCA
CPG
HO
N1
O
CPG
2.活化：在缩合之前，单体与四唑混合并进 入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷 酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙 胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷 酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保 证了单体活化充分。
ETT Activator 5-Ethylthio-1H-tetrazole in acetonitrile, anhydrous
DNA合成仪
固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分 DNA自动合成仪所使用的方法
亚磷酰胺DNA合成的试剂
• • • • • • • • 碱基柱 A、G、C、T亚磷酰胺单体 三氯乙酸(TCA)脱保护溶液 四唑偶联催化剂 乙酐，N—甲基咪唑封闭试剂 I2氧化混合物 乙腈清洗溶剂 氨水切除溶液
DMTrO
N1
3.连接：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲 核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体 相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。 形成3’，5’－磷酸二酯键。其中，磷为3价。
DMTrO
N2
O P
CH(CH3)2
N
CH(CH3)2
HO
N1
DMTrO
N2
O P
CH(CH3)2
N
来自百度文库
CH(CH3)2
OCH2CH2CN
单体：合成所用单体为核苷亚磷酰胺，是经过化学修饰的核苷 酸，含下面几个功能基团： 3’位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基。 3’位P上腈乙基，保护基，合成完毕后脱去。 5’-DMT，保护基，缩合前脱去。 A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。 G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。
dT-CE Phosphoramidite
1.脱保护基：用三氯乙酸（TCA）去除CPG所连核苷上的DMT, 以暴露5’羟基，供下一步缩合。此步需要注意TCA为一较强 的酸，可能会有脱嘌呤作用,故TCA与寡核苷酸接触时间不要 超过规定时间。 Deblock Mix (ABI) ：3% Trichloroacetic acid in
O
CPG
OCH2CH2CN
DMTrO
N2
O P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
4.盖帽：为了防止未反应的与CPG相连的5’羟基在随后的 循环中被延长，需要在连接反应充分进行之后使之封闭， 常用乙酰化来封闭此羟基。临用前混合乙酸酐和N-甲基咪 唑等形成一活性很强的乙酰化试剂，与少量未参与连接反 应的5’羟基缩合成酯键。由于须封闭的羟基少且乙酰化 试剂活性高和充分过量，此步反应速度很快，几秒钟即足 够。太长的盖帽时间有在非预期位置发生乙酰化反应的可 能，且增加乙酸酐与痕量水形成酸攻击新生成的亚磷酯键 的危险性。 Cap (ABI) THF/Lutidine/Acetic Anhydride