(分子生物学本科生课件)蛋白质磷酸化-2014
分子生物学基础PPT课件
RNA的种类与结构
• rRNA（核糖体RNA）：与蛋白质结合形成核糖体，参与 蛋白质合成
RNA的种类与结构
RNA的结构特点
单链结构，局部存在双链区域
存在多种修饰和二级结构，如茎环结构、 假结等 不同种类的RNA具有不同的结构和功能 域
RNA的合成与加工
转录
以DNA为模板，通过RNA聚合酶 催化合成RNA
蛋白质的结构与功能
研究蛋白质的结构、功能及其相互作 用，以及蛋白质在生命过程中的作用 机制和调控。
基因表达的调控
研究基因表达的时空特异性及其调控 机制，包括转录因子、表观遗传学修 饰等。
分子生物学与其他学科的关系
与遗传学的关系
与生物化学的关系
分子生物学是遗传学的重要分支，遗传学 为分子生物学提供了研究基础和理论框架 。
DNA的复制与修复
01
DNA复制的过程：起始、延伸和 终止。
02
DNA复制的酶：DNA聚合酶、解 旋酶、连接酶等。
03
DNA复制的特点：半保留复制、 边解旋边复制。
04
DNA修复的类型：直接修复、切 除修复、重组修复和SOS修复等 。
DNA的转录与表达
DNA转录的过程：起始、延伸和终止。
转录的酶：RNA聚合酶。
microRNA的调控作用
microRNA通过与mRNA的3’端非编码区结合，抑制mRNA的翻译 或促进其降解，从而调节基因表达。
信号转导与基因表达的关联
细胞外的信号分子通过信号转导途径，激活或抑制细胞内的转录因子 ，从而调节基因表达。
06
分子生物学技术与应用
DNA重组技术
DNA限制性内切酶
识别特定DNA序列，切割双链DNA。
生物化学分子生物学部分课件--蛋白质代谢
用统计 法尝试 确定含 多种核 苷酸的 密码子 的碱基 组份
1964年Nirenberg等发现将核苷酸三联体与对应 的AA-tRNA放在一起，AA-tRNA就会结合到 核糖体上去。
核糖体结合 实验:
Decoding of the Genetic code
Proteins are synthesized at rough ER
核糖体 20世纪50年代Paul Zamecnik通过将同位素标记的氨基酸注射 到大鼠体内，按不同时间取肝脏分析同位素标记的氨基酸跑到 哪里去了。时间长了会在任何地方都有同位素标记，但在注射 后数分钟就检测，同位素全部跑到了含有RNA的小颗粒中（即 核糖体， ribosome)。
密码的特点
• 连续性 • 兼并性
在不同生物中使用同义密码子的频率是不相同 的——偏爱密码
• 摆动配对（变偶现象） • 通用性
– 线粒体的密码有一定的差别 – AUG—起始密码和甲硫氨酸 – UAG、UAA、UGA—终止密码
硒半胱氨酸是大肠杆菌的第21个拥有密码子 的氨基酸（识别UGA）
高浓度时取代 正常Cys，用 在同步辐射实 验中
丙氨基酰tRNA：Ala-tRNAala 精氨基酰tRNA：Arg-tRNAarg 甲硫氨基酰tRNA： Met-tRNAmet
起始密码子AUG编码的Met由tRNAimet （真 核） 或tRNAfmet（原核）转运。 真核细胞起始密码子编码的Met不须甲酰化 大肠杆菌起始密码子编码的Met须甲酰化
The final solution
几乎同时，Gobind Khorana成功地合成了 非随机重复的多聚核苷 酸。当这些多聚物得到 的结果与 Nirenberg的 结果进行比较时，得到 了确切的密码子信息。 如 (AC)n得到的结果是 H和T等量参入，而密 码的分布是等量的CAC 和ACA,因此CAC对应 H, ACA对应T.
医学分子生物学 蛋白质的修饰与降解
利用电泳、免疫共沉淀、色谱、生物质 谱、生物信息学等方法，对修饰蛋白质及 修饰位点进行鉴定。
第二节
蛋白质的降解
蛋白质的降解途径
• 泛素-蛋白酶体通路：需能，高效、特异的 蛋白质降解过程，控制着动植物体内绝大 多数蛋白质的降解。
• 自噬-溶酶体：不需能量。主要降解细胞外 和细胞膜蛋白质
泛素-蛋白酶体系统
溶酶体
蛋白质的修饰
概念：是指蛋白质翻译后进行共价修饰加工的过程， 通过一个或几个氨基酸残基加上修饰基团而改变 蛋白质的性质。
目的：调节蛋白质的活性，使蛋白质结构更为复杂， 功能更完善。
蛋白质的修饰
• 磷酸化修饰 • 脂基化修饰 • 甲基化修饰 • 乙酰化修饰 • 类泛素化修饰 • 巴豆酰化修饰
一、磷酸化修饰
泛素化过程的关键酶
• 泛素激活酶E1：细胞只表达一种E1，将泛素转 移到泛素结合酶E2上；
• 泛素偶连酶E2：约50种，E2与许多E3作用； • 泛素连接酶E3：约1000种，直接或间接与底物
蛋白结合，促进泛素从E2的硫酯键转移到底物 蛋白上，作为被UPS识别和降解的靶向信号。
泛素化反应
1. 泛素的活化：以ATP为能量，将泛素C-端的羧基 连接到泛素活化酶E1的巯基上，形成一个泛素和 泛素活化酶E1之间的硫酯键。
• 大多数蛋白质通过26S蛋白酶体以ATP和泛素依赖 方式降解；11S-20S-11S,11S-20S-19S，PA20020S-19S以不依赖ATP和泛素的方式降解一些调节 蛋白、氧化蛋白及衰老蛋白。
泛素的结构与组成
• 泛素含有76个氨基酸残基, 广泛存在于真核生物， • 泛素的氨基酸序列极其保 守。 •泛 素 共 价 结 合 于 底 物 蛋 白 的赖氨酸残基上，将底物蛋 白进行泛素化标记而被UPS 特异识别并迅速降解。
分子生物学---11蛋白质磷酸化和信号转导
蛋白质磷酸化和信号转导一、蛋白质磷酸化过程和功能1、蛋白质磷酸化p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n（1）过程：P r o t e i n k i n a s e(蛋白激酶)P r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i nA T P A D PP h o s p h a t a s e（磷酸酶）P i（2）主要磷酸化位点（对有-O H的氨基酸进行磷酸化）丝氨酸（S e r）/苏氨酸（T h r）:磷酸化之后电荷发生变化使蛋白质活性改变酪氨酸（T y r）:磷酸化之后通常招募其他蛋白因子，使下游蛋白质活性改变（3）蛋白质磷酸化的功能生物热力学；蛋白质降解；酶活性的调控（激活o r抑制）；蛋白质相互作用2、重要的蛋白激酶（1）C D K s：c y c l i n-d e p e n d e n t k i n a s e周期蛋白依赖性蛋白激酶，属于一组调控细胞周期的S e r/T h r蛋白激酶，和周期蛋白c y c l i n协同作用发挥激酶活性，作用于细胞周期的不同阶段（2）R T K s：R e c e p t o r T y r o s i n K i n a s e受体酪氨酸激酶，是具有酪氨酸激酶活性的受体，如E G F R（表皮生长因子受体）（3）C y t o p l a s m i c P r o t e i n-T y r o s i n e K i n a s e s：非受体酪氨酸激酶，存在于细胞质中，大部分结构中存在S H2、S H3结构域，是磷酸化的结合位点。
如S r c、J A K、F A K等二、信号转导1、信号转导的种类E n d o c r i n e（内分泌）：激素P a r a c r i n e（旁分泌）：神经递质A u t o c r i n e（自分泌）：生长因子2、信号转导的步骤（1）信号分子的合成（2）信号分子释放（3）信号分子传导（4）信号分子与受体结合（5）激活细胞内信号通路（6）细胞内信号传导3、信号转导通路的几个重要的酶蛋白激酶；蛋白磷酸酶；G蛋白偶联受体；离子通道；细胞核受体；转录因子4、信号转导通路的种类及途径（1）细胞内受体介导的信号通路：信号分子一般为激素如孕酮（p r o g e s t e r o n e）、甲状腺素（t h y r o x i n）、维甲酸（r e t i n o i c a c i d）过程：血液中的激素分子从血管中游离出来进入细胞，与细胞质中的受体形成复合物，复合物进入细胞核内对基因的转录表达进行调控。
蛋白磷酸化与蛋白激酶(医学相关)
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（7）核糖体S6激酶（S6K）
包括S6KⅠ和S6KⅡ，能催化核糖体 S6蛋白磷酸化。
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（8）整合素连接激酶
整合素连接激酶（intergrin-linked kinase，ILK）可直接磷酸化PKB/Akt， 其活性依赖PI3K。
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PINCH, ILK domain structures & interacting partners
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1. 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/ threonine protein kinase，S/T-PK）催化 丝氨酸/苏氨酸的羟基磷酸化。
NH HC CH2 OH OC
NH HC CH2 OC
O OP O
O
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（1）蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）
• 与蛋白质或多肽底物结合； • 与磷酸供体ATP/GTP结合； • 转移磷酸基到底物相应的氨基酸残基上。
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2. 调节结构域/亚基 同源性较低。 作用： 调节酶的活性； 靶向作用，与酶的亚细胞定位有关。
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（二）蛋白激酶的种类
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真核细胞的蛋白激酶可分为五类： ① 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 ② 酪氨酸蛋白激酶 ③ 组/赖/精氨酸蛋白激酶 ④ 半胱氨酸蛋白激酶 ⑤ 天冬氨酸/谷氨酸蛋白激酶
• 广泛分布于各组织的胞质，以Ca2＋依赖 的形式从胞质中移位到细胞膜上，此过程 称之为转位。PKC转位是其活化的标志。
蛋白质磷酸化
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（续表） PhosphoSitePlusTM PHOSPHONET
/ homeAction.do
该数据库是PhosphoSite的新版，它是 基于网络的数据库，主要收集的是蛋白
该数据库是磷酸化位点的三维结构数据 库，储存了来自phospho.ELM 数据库 的信息，在结构和氨基酸残基水平的信 息非常丰富。
/ PPEP/
该数据库是由10类磷酸化蛋白结合域 （PPBD）介导的人的蛋白-蛋白相互作 用数据库。
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生命奥秘
残基水平
cSNP 蛋白质 数据库 dbSNP和蛋白质 数据库
表4 预测非特异性或组织特异性磷酸化位点的工具
数据库名称 NetPhos 2.0 CRP[63]
DISPHOS 1.3 NetPhosYeast 1.0 NetPhosBac 1.0
网址
http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/
生命奥秘
3.3.2 同位素代谢标记技术
15N标记法（15N labeling）是Oda等人最早提出的一种同位素代谢标记技术，它是在培养基中分别掺入 14N和15N来寻找差异表达蛋白的一种方法。虽然该方法非常适用于追踪单个磷酸化位点的动力学变化，但它 仅限于分析那些表达水平相对较高的蛋白质。SILAC（stable isotope labeling by amino acid in cellculture） 技术[25]出现以后，很快取代了15N标记法。SILAC技术，即细胞培养过程中氨基酸的稳定同位素标记，具有显 著的优点（表2），因而迅速获得认可并在国际著名实验室中广泛使用。已经使用过的稳定同位素标记氨基酸 有精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）和亮氨酸（Leu）等。
蛋白质分子的化学修饰课件
催化去磷酸化反应的酶，将蛋白 质上的磷酸基团去除。
蛋白质磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类
调节蛋白质活性
磷酸化修饰可改变蛋白质 的构象或活性位点，从而 调节其功能。
参与信号转导
磷酸化修饰在细胞信号转 导过程中起着关键作用， 可影响细胞生长、分化、 代谢等过程。
蛋白质稳定性
磷酸化修饰可影响蛋白质 的稳定性，通过调节蛋白 质降解途径来影响细胞内 蛋白质水平。
2023
PART 04
蛋白质甲基化修饰
REPORTING
甲基化修饰的种类
赖氨酸甲基化
赖氨酸残基的ε-氨基上加上甲基 基团，包括单甲基化、二甲基化
和三甲基化。
蛋氨酸甲基化
蛋氨酸残基的α-氨基上加上甲基基 团，通常为N-甲基化。
精氨酸甲基化
精氨酸残基的胍基上加上甲基基团 ，包括N-甲基化和N,N-二甲基化。
2023
PART 03
蛋白质糖基化修饰
REPORTING
糖基化修饰的种类
O-糖基化
糖基磷脂化
发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟 基上，由糖苷酶催化。
将糖基连接到脂质分子上，形成糖脂 。
N-糖基化
发生在蛋白质的氨基上，由糖苷酶催 化。
糖基化修饰的酶类
糖基转移酶
催化糖基从供体转移到受体上。
糖苷酶
催化糖苷键的断裂，释放出糖基 。
泛素化
泛素化是指将泛素分子加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的降解和功能。
甲基化
甲基化是指将甲基基团加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的构象和与其他蛋白质
的相互作用。
蛋白质分子化学修饰的功能
调节蛋白质活性
调节蛋白质稳定性
蛋白质磷酸化
PI3K/Akt/GSK-3β 可以调控神经细胞 的生长和发育，GSK-3抑制剂则被看 作是糖尿病和阿尔茨海默氏症的可能 治疗药物。
实验设计
细胞裂解
免疫沉淀 p-AKT
GSK-3β 蛋白 的荧光标记
GSK-3β与p-AKT 激酶反应
Elution buffer洗 脱p-GSK-3β蛋白
WB检测p-GSK3β 的量
CAM激酶
钙调蛋白激酶（CaM-kinase） 是一类丝氨酸/苏氨酸激酶。一 个钙调蛋白可以结合4个Ca2+。 Ca2+同钙调蛋白结合形成钙-钙 调蛋白复合物（calciumcalmodulin complex），就会 引起钙调蛋白构型的变化，增强
了钙调蛋白与许多效应物结合的 亲和力。
在不同的细胞中，Ca2+-钙调蛋 白复合物可以同CaM-蛋白激酶、 cAMP磷酸二酯酶、以及质膜中 的Ca2+运输蛋白结合， 将它们 激活，进行信号的放大。
激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合，诱发细胞质cAMP的合 成并活化A激酶，再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激 酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解并提供 ATP。
C激酶与PIP2、IP3和DAG
蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是G蛋白偶联受体系统中的效应 物，在非活性状态下是水溶性的，蛋白激酶C的激活是脂依赖性的， 需要膜脂DAG 的存在，同时又是Ca2+依赖性的，当DAG在质膜中出 现时，胞质溶胶中的蛋白激酶C 被结合到质膜上，然后在Ca2+的作用 下被激活。
表观遗传学和磷酸化-蛋白质磷酸化-分子生物学课件.ppt
DNA甲基化修饰决定基因表达的模式，即决定 从亲代到子代可遗传的基因表达状态。
DNA甲基化的部位通常在CpG岛的胞嘧啶
胞嘧啶
DNMT1
S-腺苷 甲硫氨 酸SAM
5-甲基胞嘧啶
胞嘧啶甲基 化反应
真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：
组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也 可以与基因的激活相关，这往往取决于 被修饰的赖氨酸处于什么位置。
组蛋白修饰主要是氨基端的甲基化修饰和(或) 乙酰化修饰，特定组蛋白的氨基酸残基被甲基 化和(或)乙酰化可以最终激活基因的表达，反 之则抑制基因的表达。
特定组蛋白羧基端的泛素化同样影响蛋白质的 降解过程，从而也可调节基因的表达。
(2)糖原合成酶—P—失活
使许多蛋白质磷酸化 (1)核中组蛋白磷酸化—加速核酸的复制，转录。 (2)核糖体蛋白质磷酸化—加速蛋白质合成通性。 (3)使膜蛋白磷酸化—加速物质的转运。
蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用
(1). 在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于 胞内信使，
根据是否有调节物来分又可分成两大类： 信使依赖性蛋白质激酶（messenger-dependent protein
kinase），包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激 素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；非信使依赖型蛋白激酶。
蛋白激酶的催化作用： 使调节酶磷酸化 (1)磷酸化酶激酶—P—激活
基因表达的重新编程
已完全分化的细胞，其基因组在特定条件下经 历表观遗传修饰重建而为胚胎发育中的基因表 达重新编程(reprogramming)并赋予发育全能 性，为胚胎发育和分化发出正确的指令。
蛋白磷酸化与蛋白激酶
在基因表达调控中的作用
01
蛋白激酶通过磷酸化转录因子，影响其结合DNA的 能力和转录活性，从而调控基因表达。
02
磷酸化作用还可以影响染色质结构和表观遗传修饰 ，进一步调控基因表达。
03
蛋白激酶和磷酸酶在信号转导通路中相互作用，将 胞外信号转化为基因表达的改变。
在细胞凋亡与自噬中的作用
01
蛋白激酶通过磷酸化作用参与细胞凋亡的调控，如
荧光共振能量转移法
利用荧光标记的ATP和底物蛋白，通过检测荧光共 振能量转移来测定激酶活性。
酶联免疫吸附法
利用特异性抗体识别磷酸化底物蛋白，通过 酶联免疫吸附反应来测定激酶活性。
磷酸化蛋白的鉴定技术
二维凝胶电泳
通过二维凝胶电泳分离磷酸化蛋白，结合质谱技术进 行鉴定。
免疫沉淀法
利用特异性抗体沉淀磷酸化蛋白，结合质谱技术进行 鉴定。
磷酸化动态平衡
蛋白质的磷酸化状态是动态变化 的，受到激酶和磷酸酶的共同调 控，以维持细胞内信号传导的平 衡。
磷酸化蛋白的特性
结构变化
磷酸化会导致蛋白质构象的改变，从而影响其与其他分子的相互作用 和功能。
功能多样性
不同位点的磷酸化可以引发不同的生物学效应，如激活或抑制酶的活 性、改变蛋白质的定位和稳定性等。
THANKS
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磷酸化蛋白质组学
利用特异性富集磷酸化肽段的技术，结合高分辨质谱 技术进行全蛋白质组范围内的磷酸化蛋白鉴定。
基于质谱的蛋白组学研究方法
鸟枪法蛋白质组学
利用高分辨质谱技术对复杂蛋白质样品进行全面分析，包括磷酸化蛋白的鉴定和定量。
数据依赖型采集模式
通过质谱仪的数据依赖型采集模式，对磷酸化肽段进行自动识别和碎裂，实现高通量的 磷酸化蛋白鉴定。
蛋白质磷酸化1
浅谈蛋白质磷酸化摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。
而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。
随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。
本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。
关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。
蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。
传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。
它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。
早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。
蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。
所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。
一、蛋白质磷酸化的概述蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。
已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。
蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。
【大四 必修】分子生物学蛋白质磷酸化课件
2) Ca2+ /磷脂依赖的蛋白激酶（ Ca2+/phospholipid dependent protein kinase）
经第二信使Ca2+ 、甘油二酯DG或磷脂酰丝氨酸刺激而激活的蛋白激酶称为 Ca2+ /磷脂依赖的蛋白激酶，是肌醇磷脂信号传导通路的关键环节。
多种激活剂与质膜上特异受体结合→磷脂酶C →肌醇磷脂（PIP2） 水解
2、DAG作用：激活蛋白激酶C,将存在于靶蛋白质中得丝氨酸和 苏氨酸残基磷酸化，
改变靶蛋白质的活性。如:糖原合成酶磷酸化后，停止合成 糖原。
3、DAG与IP3的协调作用 IP3－ →细胞质中Ca2 + ↑－→ 糖原合成酶活性↑ 蛋白激酶C－ →使IP3 诱导增高糖原磷酸化酶活性的过
程终止。
4、DAG的激活机理 DAG－→ 增加蛋白激酶C对Ca2 + +的亲合性－→ 在Ca2
1、Ser/Thr蛋白激酶 蛋白磷酸化是蛋白激酶将磷酸基因转移到特定底物蛋白上的共价修
饰过程，调控蛋白质的酶学活性或生物学功能，分为: ①cAMP依赖的PK ②Ca2+/磷脂依赖的PK ③ Ca2+/ （CaM）钙调蛋白依赖的PK ④cGMP依赖的PK ⑤近年发现新成员——DNA依赖的PK
⑴cAMP依赖的蛋白激酶（ cAMP dependent protein kinase.PKA） cAMP-依赖蛋白激酶是一种四聚蛋白酶，含有两个调控亚基和两个催
根据是否有调节物来分又可分成两大类： 信使依赖性蛋白质激酶（messenger-dependent protein
kinase），包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激 素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；非信使依赖型蛋白激酶。
最新蛋白质磷酸化概述
蛋白质磷酸化概述蛋白质磷酸化概述蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。
很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。
此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。
磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。
最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。
因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。
研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。
这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。
在17.2节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。
该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。
大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。
这三种羟基磷酸氨基酸在酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。
在17.3节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。
蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。
研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（Methods in Enzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。
磷酸化蛋白质组学
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。
蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。
目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。
在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。
磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。
鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。
用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。
在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来[60, 61]。
1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。
目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。
这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。
Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，从而鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。
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2020/10/22
蛋白质磷酸化与非磷酸化
非活性蛋白与活性蛋白的构象之间的转换是通过可逆共价修饰 调节蛋白质的方式，蛋白激酶则是这一过程催化磷酸化的重要蛋白， 而磷酸酯酶是去磷酸化的重要蛋白.
已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左 右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的 把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程， 其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸.
2、DAG作用：激活蛋白激酶C,将存在于靶蛋白质中得丝氨酸和 苏氨酸残基磷酸化，
改变靶蛋白质的活性。如:糖原合成酶磷酸化后，停止合成 糖原。
3、DAG与IP3的协调作用 IP3－ →细胞质中Ca2 + ↑－→ 糖原合成酶活性↑ 蛋白激酶C－ →使IP3 诱导增高糖原磷酸化酶活性的过
程终止。
4、DAG的激活机理 DAG－→ 增加蛋白激酶C对Ca2 + +的亲合性－→ 在Ca2
化亚基。当cAMP-依赖蛋白激酶的调控亚基结合时，激酶解离成两个具有 催化活性的蛋白激酶（由催化亚基形成）和一个二聚的调控亚基。
cAMP-依赖蛋白激酶被活化后，它解离出来的活性蛋白酶能够催化 ATP分子与目标代谢酶分子的磷酸化反应。一般是代谢酶的Ser或Thr残基 的羟基被ATP磷酸化，其结果是代谢酶被抑制或激活。cAMP即是通过上述 机制实现对代谢酶活性的调控。
C激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响，原因是后者大大提高了C激酶对于 Ca2+的亲和力，从而使得C激酶能被生理水平的Ca2+离子所活化。C激酶主要实施对 丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，它具有一个催化结构域和一个调节结域。
2020/10/22
1、IP3作用：IP3与IP3受结合后，变构，钙通道打开，贮于内 质网的Ca2+释放入细胞质内，使胞质Ca2+浓度升高，引起一 系列效应。如:平滑肌收缩等.
+生理水平上被活化。蛋白激酶C为 77kd , 催化区抑制调节区 ,当DAG结合到蛋白激酶C上，解除酶的调节区的抑制作用，使 酶发20挥20/1催0/22化活性。
2020/10/22
4）cGMP依赖的蛋白激酶 (cGMP dependent protein kinase,,GPK)
1963年从肾脏首次发现cGMP
2020/10/22
• 跨膜结构区：是连接受体细胞内、外两部分，镶 嵌在细胞膜中的结构，在靠近膜内侧C端常常是由 碱性氨基酸形成簇状结构。
• 胞内活性区：保守性较高，由三个不同的部分组 成。与跨膜区相连的近膜区包括41-50个氨基酸， 可能是RPTK活性的功能的调节部位。第二部分为 活性位点所在的催化区，其氨基酸组成具有很高 的保守性。该区含有ATP结合位点和底物结合位点 ，可能是不同类型RPTK底物特异性的决定区域。 第三部分是多变的C末端，包括70-200个氨基酸， 主要是由小分子量氨基酸组成的亲水性结构，具
多种激活剂与质膜上特异受体结合→磷脂酶C →肌醇磷脂（PIP2） 水解
三磷酸肌醇（IP3）&aM―PK←Ca2+↑←胞内Ca2+池
一系列细胞蛋白磷酸化
PKC
磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）的两个 酶解 产物：肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）。C激酶（PKC）是 依赖于Ca2+的蛋白质激酶。由于IP3所引起的细胞质Ca2+浓度升高，导致C激酶从胞 质转运到靠原生质膜内侧处，并被DAG和Ca2+的双重影响所激活。
2020/10/22
根据是否有调节物来分又可分成两大类： 信使依赖性蛋白质激酶（messenger-dependent protein
kinase），包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激 素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；非信使依赖型蛋白激酶。
2020/10/22
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1、Ser/Thr蛋白激酶 蛋白磷酸化是蛋白激酶将磷酸基因转移到特定底物蛋白上的共价修
饰过程，调控蛋白质的酶学活性或生物学功能，分为: ①cAMP依赖的PK ②Ca2+/磷脂依赖的PK ③ Ca2+/ （CaM）钙调蛋白依赖的PK ④cGMP依赖的PK ⑤近年发现新成员——DNA依赖的PK
⑴cAMP依赖的蛋白激酶（ cAMP dependent protein kinase.PKA） cAMP-依赖蛋白激酶是一种四聚蛋白酶，含有两个调控亚基和两个催
具有受体功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, RPTK)。包括三个结构域 ：胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白 激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构。 胞外配体结合区：RPTK的N端大约500-850个氨 基酸组成亲水性胞外配体结合区域，氨基酸序列 变化较大，是不同RPTK与相应配体特异性结合 的结构基础。
2020/10/22
结构与功能 • 2个调节亚基（R）+2个催化亚基（C）→PKA全酶复合体（R2C2
）（无cAMP时，无活性） • cAMP与特异R亚基结合→构象变化→成为R亚基二聚体+2个有活
性C亚基,各种哺乳动物细胞可不同水平表达3种C亚基亚型 (CαCβCγ)和4种R亚基亚型(RⅠ α RⅠ β RⅡ α RⅡ β) →结 合成全酶PKA Ⅰ型和 Ⅱ型.
2020/10/22
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2) Ca2+ /磷脂依赖的蛋白激酶（ Ca2+/phospholipid dependent protein kinase）
经第二信使Ca2+ 、甘油二酯DG或磷脂酰丝氨酸刺激而激活的蛋白激酶称为 Ca2+ /磷脂依赖的蛋白激酶，是肌醇磷脂信号传导通路的关键环节。
5）DNA依赖的蛋白激酶( DNA dependent protein kinase,DNA-PK)
是一类存在于细胞核内，能被DNA激活的特异的 Ser/Thr PK ，可引起多种核结合蛋白磷酸化
2020/10/22
2. 酪氨酸蛋白激酶
对于许多生长因子受体的研究表明，跨膜的酪 氨酸蛋白激酶在信息传递过程中起着重要作用。