免疫荧光步骤(精)

胞免疫荧光步骤：

1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子

具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）

取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；

3.PBS漂洗5min；

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；

5.PBS漂洗2次，每次5min；

6.1%BSA封闭30min；

7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；

8.PBS漂洗2次，每次5min；

9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；

10.PBS漂洗2次，每次5min；

11.5ug/ml DAPI染色2min；

12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:

2.5% DABCO (w/v)

50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

内容仅供参考，希望对你有帮助！

抗荧光淬灭剂的作用

当荧光染料暴露在激发光下时，几乎都有漂白的现象（光漂白）。光漂白和以下因素有关：1）照射光的强度；2）照射光的照射时间； 3）其他影响荧光强度和荧光漂白的因素有pH、培养介质的性质，其他荧光淬灭的物质存在。

一种染料的光子产量代表染料被完全光漂白之前的激发周期的平均次数。平均光子产量是荧光量子效率（Qf）和漂白量子效率（Qb）的比。例如：荧光素对光很不稳定，在碱性溶液中 Qf /Qb 大约为 30K。Qf 和 Qb 都属于染料的性质，受染料环境的影响很大。主要影响 Qb 的因素是活性氧和自由基类物质。

一种抗荧光淬灭剂的主要目的是保持染料的荧光，使标本能用于更长时间的观察。抗荧光淬灭剂通常是通过抑制活性氧的产生和扩散来达到这一作用，因此降低了Qb，Qf并没有伴随着降低，荧光仍然保持不变。

DABCO = 1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷

DABCO抗荧光淬灭封片剂的配方

DABCO 储藏液

1．在60℃ 下，溶解 2 克 DABCO（抗荧光淬灭剂）于 90ml 甘油中，15-30 分

钟。

2．加 10 ml 1M Tris-HCl，pH 7.5

3．用 5M HCl 调节 pH 值到 8.0

4．冷却到室温

5．加 100 ml 20% thimerosal（溶解于水）

6．可选：加 50 ml PI （储液：溶于水的 1 mg/ml PI ）

7．4℃ 于棕色瓶或箔纸包裹的瓶子中避光保存

好运，祝你试验顺利。