免疫荧光步骤(精)
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光1、吸干十二孔板中每孔中的培养基，用PBS洗三次，5min/次，注意摇床要缓慢。
2、吸干PBS，每孔加200~300μl固定液，室温固定20分钟。
3、若暂时不做荧光，吸干固定液，不洗，放-30℃保存。
4、需要做时，将十二孔板取出，稍微解冻之后，加适量的PBS，用钩针抠出要PBS洗三次，5min/次。
5、吸干PBS后，每孔加1ml的5‰Triton破膜液，室温下破膜15~20分钟。
6、吸干破膜液，室温下PBS洗3次，5min/次。
7、加BSA封闭液，30~50μl/爬片，室温下封闭30min。
8、吸干BSA封闭液，不洗，加一抗（一抗用PBS稀释比例为：1：50~1:100，浓度视具体情况而定，30~50μl/爬片）4℃过夜。
注意十二孔板保持平整，以免一抗流到爬片外。
9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板，PBST洗3次，3min/次，然后每孔加1:50稀释的FITC，室温下避光孵育1h。
10、PBST洗3次后，DAPI染核6分钟，30μl/爬片。
染核后PBST洗3次，5min/次。
11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液，即可镜下观察。
说明：①5‰Triton破膜液：例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。
②FTIC现配现用，用PBS稀释，比例为1：50~1:75，具体浓度依据荧光亮度来调整。
耗材：1、十二孔板2块，一块要求无菌（种细胞），另一块洁净（外用漂洗爬片）。
2、外用PBS3、固定液4、细胞爬片5、避光盒6、钩针7、5‰Triton破膜液8、BSA封闭液9、一抗10、PBST11、FITC12、DAPI13、GL YCEROL封片液。
免疫荧光步骤
1.用预温的PBS洗细胞两遍，可以不用摇；
2.加入4%多聚甲醛固定，1ML/well,10min,固定的时间也可以适当的增
长；在固定之前的步骤其实都要尽量轻而快，保证细胞固定之后不会缩太多，能够维持原有的细胞形态；
（4%多聚甲醛：现用现配。
0.4g多聚甲醛溶于9mlPBS中，加适量1M NaOH(~10微升)，可以在95°水浴中溶解，PH~7.2）
3.PBS洗至少4遍；
4.加入TBST，20min;这个过程是使得细胞膜变通透，可以使得抗体更
好的进入细胞；
（TBST配制：0.25% TritonX-100,150mM Nacl.50mM Tris-Hcl;）
例如：50ml TBST 配制方法：TritonX-100：125ul
5M Nacl:1.5ml
1M Tris-Hcl:2.5ml
PBS :45.875ml;
5.PBS洗4遍至少；
6.加入5% BSA封闭2小时；（5% BSA：0.5g BSA粉末，用9ml PBS 溶
解。
4℃存放。
）
7.加入一抗（用含4% BSA的TBST稀释溶解；）然后4℃过夜，不要摇，
放着就好；抗体在配制的时候不用太多，可以盖住底下的凹槽就可以了，体积大概200微升就够了；
8.次日，用PBS洗至少5遍；
9.加入二抗，配制方法和一抗相同，避光孵育1h;
10.避光洗至少4遍；然后加DAPI,2min后用荧光拍照；。
免疫荧光实验的实验操作步骤及注意事项
免疫荧光1.免疫荧光所用玻片的处理(1) 玻片的规格：圆形18mm×18mm可放入12孔盘；(2) 处理方法：将玻片一片一片的放入1M的盐酸中，65度浸泡过夜，每一遍均要一片一片的清洗，第一遍用流动的自来水冲洗，，其余在盆里清洗，要洗5次以上，再用蒸馏水洗，同样的方法洗5次以上，再用超声，低功率，一小时。
完后再用蒸馏水洗5遍，洗完以后放入95%的乙醇中长期保存。
临用时，在酒精灯上过一下，使玻片上残余的乙醇燃烧，干燥后放入12孔板。
2. 铺板子如细胞难以贴壁（如293T）或需观察细胞骨架的相关指标，需用多聚赖氨酸处理玻片。
多聚赖氨酸1ml，置于37度孵箱30-60min，吸干液体，用DDW洗三遍，吸干液体，紫外照射5-10min，晾干。
实验前一天将含2-3×10^4细胞的单细胞悬液铺种在放有盖玻片的十二孔盘中一个孔中（要保证有单个细胞）。
每个条件做两个复孔，待细胞贴壁12~24h后，用于实验分析；3. 固定用PBS洗涤细胞3 次(注意免疫荧光所用的PBS，均为常温的)，吸干，4%的PFA 1ml/ 孔于室温固定10min ；4. 防淬灭吸出PFA ，注意不能使细胞干燥，用PBS 洗3 次，加入1ml 的50mM 氯化铵于室温孵育10min，吸出氯化铵，PBS 洗3 遍，2-3min/次；(此步可省略)5. 通透加入1ml 的0.1%Triton X-100，10min，吸出Triton，用PBS 洗3 次，2-3min/次；6. 封闭加入1ml 3%的BSA（PBS配）封闭，室温1h，可在摇床上晃动，吸出BSA ，用PBS 洗10min；7. 一抗一般稀释比例为1：200-1：500，将抗体（BSA配；双染各加20μl ，单染加40μl ）加到封口膜上，将盖玻片从十二孔盘中取出，吸干多余的水分，有细胞的一面接触抗体，室温>1h 或4°C 过夜（效果好），将玻片重新放回到十二孔板中，有细胞的一面朝上，用PBS 洗4 次，10min/次；8.二抗稀释比例一般为1：400（BSA配），操作同一抗，避光室温反应1h, 将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；9. DAPI染细胞核一般浓度为1μg/ml，每个盖玻片需20ul ，操作同一抗，避光于室温反应10min，将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；10.封片把封片剂（mowoil）滴在载玻片上，每片15μl，将有细胞的面朝下，勿有气泡。
免疫荧光步骤
免疫荧光步骤
1.脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min； 2）无水乙醇中浸泡5min； 3）95%乙醇中浸泡5min； 4）70%乙醇中浸泡5min；（动作要快，减少暴露在空气中中的时间）
2.PBS洗两次各5min。
（整个过程中注意切片不能干）
3.抗原修复，用于多聚甲醛固定的石蜡包埋组织芯片。
煮沸热修复电炉或者水浴锅加热 0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
4.PBS洗3次每次5min。
5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。
6.滴加一抗（根据说明书的比例稀释，一般为1:100），室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。
7.PBS洗3次每次5min。
8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。
（注意抗体针对的种属，使用浓度，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。
）
9.PBS洗3次每次5min。
10. DAPI染色：把DAPI滴在片上，将切片覆盖，50ul/片，染色10min。
11. PBS洗3次每次2 min。
12.封片：抗荧光淬灭封片剂封片，再拍照。
免疫荧光技术操作步骤
免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4 的PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液1 份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4 的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4 的PBS 冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4 的PBS 三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 到数小时，一般30 min 已足够。
三种细胞免疫荧光染色操作步骤
三种细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
免疫组织荧光步骤
免疫组织荧光步骤免疫组织荧光是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定抗原在细胞或组织中的分布情况。
该技术利用荧光标记的抗体与目标抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而获得关于抗原分布的信息。
下面将介绍免疫组织荧光的步骤。
第一步：固定和切片在进行免疫组织荧光实验之前，首先需要将待检测的组织固定并制备成切片。
固定可以保持组织结构的完整性，并固定其中的蛋白质，以便后续的抗体结合。
切片是将组织切割成非常薄的片段，以便于抗体的渗透和荧光信号的观察。
第二步：抗原解表为了提高抗体的结合效率和信号强度，需要对组织切片进行抗原解表处理。
抗原解表通过一系列化学或物理方法，使组织中的蛋白质结构发生变化，使得抗体能够更容易地与目标抗原结合。
第三步：抗体孵育在进行免疫组织荧光实验时，需要选择与目标抗原特异性结合的抗体，并将其与组织切片一起孵育。
抗体可以是来自动物（如兔子、小鼠）的多克隆抗体或来自细胞培养的单克隆抗体。
在孵育过程中，抗体会与目标抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
第四步：洗涤为了去除无效的抗体和非特异性结合物，需要对组织切片进行洗涤。
洗涤过程中使用缓冲液，可以有效地去除孵育过程中产生的杂质和未结合的抗体。
第五步：二抗孵育为了增强信号的强度，需要使用荧光标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。
二抗是针对来自第一步孵育的抗体的抗体，可以与其特异性结合。
二抗通常标记有荧光物质，如荧光素、荧光蛋白等，通过观察荧光信号可以确定抗原在组织中的分布情况。
第六步：洗涤与第四步类似，需要对组织切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和杂质。
第七步：荧光显微镜观察在洗涤完毕后，将组织切片放置在荧光显微镜下观察。
荧光显微镜可以通过激发荧光标记的抗体产生荧光信号，并将其放大和记录下来。
通过观察荧光信号的强度和位置可以确定抗原在组织中的分布情况。
免疫组织荧光技术广泛应用于生命科学研究领域，可以用于检测疾病标志物、研究细胞功能以及探索生物过程的机制。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton: 30min. 配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，his1；400 ４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时８.４度PBS洗净，３min＊５次９.二抗３７度小于一小时加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽（100ug/ml储存液）室温染色30-60分钟１０.３７度PBS洗净，３＊５minDAPI 1：200凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）我的实验检测X射线照射鼻炎癌细胞后γH2AX的数量变化预实验步骤：1）辐照结束后，弃去旧培养液，4%多聚甲醛4℃固定15分钟。
2）PBS洗涤，5分钟×3次。
3）体积分数为0.2%Triton-X 100 4℃破膜15分钟。
4）PBS洗涤，5分钟×3次。
5）羊血清工作液室温封闭2小时。
6）PBS洗涤，5分钟×3次。
7）0.21µg/ml一抗（梯度1:500 1:750 1：1000）37℃孵育细胞2小时。
8）PBS洗涤，5分钟×3次。
9）2.1µg/ml 二抗（1：200）37℃避光孵育细胞1小时。
10）PBS洗涤，5分钟×3次。
11）1µg/ml DAPI染色15分钟，使用时避光。
12）PBS 洗涤，5分钟×3次。
13）以及分数90%甘油封片，盖玻片细胞面朝下。
14）荧光显微镜下观察。
活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
免疫荧光步骤
免疫荧光步骤免疫荧光就是利用特异性抗原与抗体相互结合的特性，通过标记抗原或抗体上荧光物质的方法，来检测和定位抗原或抗体在生物样本中的存在和分布情况。
免疫荧光技术已被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
下面是免疫荧光的步骤：步骤一：制备标本免疫荧光的首要步骤是制备待检测的标本。
这可能涉及从活体中采集组织样本（如活检），或者培养细胞，并在适当的时间点收集细胞。
步骤二：固定标本固定是将标本固定在载玻片或离心管中的过程。
通常使用化学固定剂（如甲醛或乙醇）或特定的固定和渗透缓冲液来保持标本的形态完整性，并防止标本中的抗原或抗体被破坏或丢失。
步骤三：透化标本透化是为了使荧光染料能够渗透到被固定的细胞或组织中。
这可以通过使用洗涤剂（如Tween-20）或透明质酸酶等物质来达到。
透化可以提高荧光染料与标本中抗原或抗体的结合能力，从而提高免疫反应的灵敏度。
步骤四：抗体染色免疫荧光需要使用特异性抗体来标记待测的抗原。
在此步骤中，将特定的抗体与标本中的抗原结合。
有两种常用的方法可以实现这一步骤：1.原位染色：将标本与抗体混合，并在恰当的条件下孵育。
抗体将与标本中的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
这种方法可以用于检测细胞表面的分子或组织切片中的特定分子。
2.间接染色：在原位染色的基础上，引入第二抗体（标记抗体）。
标记抗体是与染料结合的抗体，通常是荧光染料。
该标记抗体与形成的抗原-抗体复合物结合，并形成二抗-抗原-抗体复合物。
步骤五：荧光显微镜观察完成抗体染色后，可以使用荧光显微镜来观察标本中荧光信号的存在和位置。
荧光显微镜配备有特殊的滤光片（荧光滤光片），可以选择性地捕捉特定荧光染料发出的荧光信号。
步骤六：图像捕获和分析使用相机或图像捕捉系统来记录荧光显微镜下观察到的图像。
这些图像可以进一步通过图像分析软件进行定量分析和图像处理，以评估抗原或抗体在标本中的分布和表达水平。
免疫荧光技术可以提供高灵敏度和高空间分辨率的分子生物学信息，并被广泛应用于癌症诊断、抗体研究、细胞成像和组织学研究等领域。
细胞免疫荧光步骤
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2）固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min.（3）通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.（4）封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.（5）一抗结合。
室温孵育1h或者4℃过夜。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min.（6）二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗。
室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。
DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。
DAPI溶液用水配制。
推荐DAPI工作浓度为0.5-10μg/ml。
（一）细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。
免疫荧光步骤
免疫荧光步骤免疫荧光是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量特定抗原或抗体的存在，以及其在细胞或组织中的分布情况。
免疫荧光技术被广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物研发和疾病治疗等领域。
免疫荧光技术步骤一般包括抗原/抗体的固定、非特异性结合物的洗脱、荧光标记的抗体的结合和荧光检测。
下面是免疫荧光的详细步骤：1.细胞/组织的固定：首先，需要将要研究的细胞或组织进行固定处理，以保持其形态和结构。
常用的固定剂包括甲醛和乙酸乙腈酯等。
固定处理后，可以通过透射电镜或荧光显微镜等方法观察到细胞的染色。
2.非特异性结合物的洗脱：由于细胞和组织在固定过程中会产生非特异的结合物，如蛋白质、核酸和脂质等，需要进行洗脱处理以减少非特异性的背景信号。
洗脱的方法包括用生理盐水或缓冲液溶液进行洗涤，以去除固定剂和非特异性结合物。
3.抗原/抗体的结合：将特异性的一抗加入到样品中，与目标抗原或抗体发生特异性结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
一抗的选择要根据研究的目的和样品的特点来确定。
4.主抗体的荧光标记：荧光标记的抗体是免疫荧光技术的重要步骤之一、常用的荧光标记剂包括荧光染料（如荧光素和罗丹明）、荧光蛋白（如绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白）以及金纳米颗粒等。
荧光标记的抗体具有高度特异性和灵敏度，可通过荧光显微镜等设备直接观察到荧光信号。
5.荧光检测：将样品置于荧光显微镜下观察和记录荧光信号。
根据需求，荧光显微镜可以具备单波长或多波长荧光检测功能，以获得更准确和详细的结果。
可以通过调节显微镜的荧光通道、滤光器和放大倍数，调整荧光信号的亮度、对比度和分辨率，以获得最佳的图像质量。
以上就是免疫荧光的基本步骤。
在实际应用中，还可以根据实验的需要和条件，进行一些细微的改进和优化，如双标染色、组织切片、蛋白质印迹等。
免疫荧光技术的优点包括高度特异性、灵敏度高、操作简便和快速等。
在生物医学研究中，免疫荧光技术被广泛应用于肿瘤标记、病毒检测、免疫组织化学等方面，对于探索基础科学、疾病发病机制和药物研发具有重要意义。
四种抗体免疫荧光染色操作步骤
四种抗体免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色听起来就很厉害的样子呢，其实操作起来也没有特别难啦。
一、样本准备。
咱得先把要染色的样本处理好哦。
如果是细胞样本的话，要把细胞好好地培养在载玻片或者盖玻片上，让它们长得美美的，可不能有太多杂质或者状态不好。
要是组织样本呢，就得把组织切成薄片，这个切的时候可得小心啦，就像对待小宝贝一样。
二、固定。
固定这个步骤超重要的。
一般用多聚甲醛来固定样本，把样本泡在里面一段时间，就像给细胞或者组织来个“定身术”，让它们保持原来的样子，这样后面染色的时候才不会变形。
这个时间要掌握好哦，太久或者太短都不太好。
三、通透。
接下来就是通透啦。
用一些通透剂，像Triton X - 100之类的，让抗体能够顺利地进入细胞里面去找到它们要结合的目标。
这就像是给抗体开了个小通道，让它们能自由穿梭。
四、封闭。
封闭就像是给样本穿上一层保护衣。
用正常血清或者牛血清白蛋白之类的东西把样本上那些非特异性结合的位点给占住，这样抗体就不会乱结合啦，只会乖乖地去找自己的目标。
五、一抗孵育。
现在轮到一抗上场啦。
把我们准备好的四种抗体按照合适的比例稀释好，然后加到样本上。
这个时候样本就像是一个小舞台，一抗们就开始在上面寻找自己的舞伴（抗原）啦。
孵育的时间也要注意，要让它们有足够的时间去结合。
六、洗涤。
一抗孵育完了，就得把没结合上的一抗给洗掉，就像打扫舞台一样，只留下那些成功结合的一抗。
用缓冲液轻轻冲洗样本，多洗几次，这样才能保证后面的结果准确。
七、二抗孵育。
二抗是带着荧光标记的哦。
把二抗按照比例稀释后加到样本上，二抗就会去找一抗，然后紧紧地抱住它。
这时候就像给一抗穿上了一件会发光的衣服，超酷的。
八、再次洗涤。
和之前一样，把多余的二抗给洗掉，让舞台又变得干干净净的。
九、封片。
最后一步就是封片啦。
用封片剂把样本封起来，这样样本就可以好好保存，等着我们去观察它在荧光显微镜下的美丽模样啦。
免疫荧光染色就这么一步步来，每一步都很关键，就像搭积木一样，少了一块都不行呢。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。
2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。
6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。
10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。
11.次日取出切片，室温下复温30分钟。
12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。
14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。
贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。
2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
6.使用1% BSA室温封闭30分钟。
7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
免疫荧光实验步骤
免疫荧光实验步骤 Revised as of 23 November 2020免疫荧光实验步骤1. 直接免疫荧光法测抗原（1）基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
（2）试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ 碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
（3）实验步骤① 滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS冲洗后，再按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
④ 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
⑤ 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
（4）注意事项1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。
免疫荧光步骤
免疫荧光步骤
1.脱蜡和水化
脱蜡前,应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min;1组织芯片置于二甲苯中浸泡10min,更换二甲苯后再浸泡10min；2无水乙醇中浸泡5min；395%乙醇中浸泡5min；470%乙醇中浸泡5min；动作要快,减少暴露在空气中中的时间2.PBS洗两次各5min;
整个过程中注意切片不能干
3.抗原修复,用于多聚甲醛固定的石蜡包埋组织芯片;煮沸热修复电炉或者水浴锅加热 0.01M柠檬酸钠缓冲溶液pH6.0至95℃左右,放入组织芯片加热10min,必须等缓冲液冷却后,方能将切片取出;
4.PBS洗3次每次5min;
5.滴加5%正常山羊血清,室温封闭30min,甩去多余液体;
6.滴加一抗根据说明书的比例稀释,一般为1:100,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时4℃过夜后在37℃复温45min;
7.PBS洗3次每次5min;
8.滴加荧光标记的二抗,室温避光孵育1h;注意抗体针对的种属,使用浓度,用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光;
9.PBS洗3次每次5min;
10.DAPI染色：把DAPI滴在片上,将切片覆盖,50ul/片,染色10min;
11.PBS洗3次每次2min;
12.封片：抗荧光淬灭封片剂封片,再拍照;。
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胞免疫荧光步骤：
1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。
爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。
一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。
培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子
具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）
取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。
最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。
爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。
2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；
3.PBS漂洗5min；
4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；
5.PBS漂洗2次，每次5min；
6.1%BSA封闭30min；
7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；
8.PBS漂洗2次，每次5min；
9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；
10.PBS漂洗2次，每次5min；
11.5ug/ml DAPI染色2min；
12.抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂:
2.5% DABCO (w/v)
50mM Tris(pH8.0)
90%甘油
内容仅供参考，希望对你有帮助！
抗荧光淬灭剂的作用
当荧光染料暴露在激发光下时，几乎都有漂白的现象（光漂白）。
光漂白和以下因素有关：1）照射光的强度；2）照射光的照射时间； 3）其他影响荧光强度和荧光漂白的因素有pH、培养介质的性质，其他荧光淬灭的物质存在。
一种染料的光子产量代表染料被完全光漂白之前的激发周期的平均次数。
平均光子产量是荧光量子效率（Qf）和漂白量子效率（Qb）的比。
例如：荧光素对光很不稳定，在碱性溶液中 Qf /Qb 大约为 30K。
Qf 和 Qb 都属于染料的性质，受染料环境的影响很大。
主要影响 Qb 的因素是活性氧和自由基类物质。
一种抗荧光淬灭剂的主要目的是保持染料的荧光，使标本能用于更长时间的观察。
抗荧光淬灭剂通常是通过抑制活性氧的产生和扩散来达到这一作用，因此降低了Qb，Qf并没有伴随着降低，荧光仍然保持不变。
DABCO = 1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷
DABCO抗荧光淬灭封片剂的配方
DABCO 储藏液
1．在60℃ 下，溶解 2 克 DABCO（抗荧光淬灭剂）于 90ml 甘油中，15-30 分
钟。
2．加 10 ml 1M Tris-HCl，pH 7.5
3．用 5M HCl 调节 pH 值到 8.0
4．冷却到室温
5．加 100 ml 20% thimerosal（溶解于水）
6．可选：加 50 ml PI （储液：溶于水的 1 mg/ml PI ）
7．4℃ 于棕色瓶或箔纸包裹的瓶子中避光保存
好运，祝你试验顺利。