口蹄疫病毒抗原
抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测口蹄疫病毒的研究
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： ＢＡＬ Ｂ／ ｃ ｍｉ ｃ ｅ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｍｍｕ ｎ ｉ ｚ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｐ ｕ ｉ ｒ ｉｅ ｆ ｄ ｓ ｅ ｒ ｏ ｔ ｙ ｐ ｅ Ａｓ ｉ ａ ｌ Ｆ Ｍ ＤＶ ． Ｓ ｉ ｘ ｈ ｙ ｂ ｒ ｉ ｄ ｏ ｍａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎ ｅ ｓ ｔ ｈ ａ ｔ ｓ ｅ ｃ ｒ ｅ ｔ ｅ ｄ ｍｏ ｎ ｏ ｃ —
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Байду номын сангаас
毒Ｉ ｇ Ｇ为捕 获抗 体 ，选 择 一 株 单抗 （ １ Ｂ ４ ） 用辣 根 过 氧 化 物酶 标 记 （ Ｈ Ｒ Ｐ 一 １ Ｂ ４ ）作 为检 测 抗 体 ，建 立 了检 测 Ａ ｓ ｉ ａ ｌ 型Ｆ ＭＤ Ｖ 的抗 原捕 获 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 方 法。 该 方 法可检 出 ０ ． ５ ８ ５ ９ ｔ ｘ ｇ纯化 Ａ ｓ ｉ ａ ｌ 型Ｆ ＭＤ Ｖ 抗原 和 ２ ． ５×１ ０ Ｔ Ｃ Ｉ Ｄ ５ ０ 病 毒 ，对
ＺＨＯＵ Ｇｕ ｏ ． ｈｕ ｉ ，ＬＩ Ｗａ ｎ，ＺＨＡＯ Ｌｅ ｉ ，ＹＵ Ｌｉ
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猪口蹄疫症状及病原学诊断
猪口蹄疫症状及病原学诊断概述口蹄疫的临诊症状主要是口、鼻、蹄、乳头等部位出现水疱。
发疱初期或之前，猪表现跛行。
一般情况下主要靠这些临诊症状可初步诊断，但表现类似症状的还有猪水疱病、猪水疱疹(SVE)、水疱性口炎(VS)。
因此，最终确诊要靠实验室诊断。
病原学诊断1.病毒分离鉴定病毒分离鉴定的首选病料是未破裂或刚破裂的水疱皮(液)，对新发病死亡的动物可采取脊髓、扁桃体、淋巴结组织等。
将病料悬液冻融2次，4℃过夜(至少4h)浸毒。
以3000r/min离心15min，除菌后取上清接种细胞。
或加1/3体积氯仿混合摇振数分钟，以3000r/min离心15min，取上清液装入试管中，加棉塞，4℃过夜，氯仿挥发后，接种单层细胞。
每份样品接种2～4瓶细胞，另设对照2～4瓶。
37℃静止培养48～72h。
每天观察记录，对照细胞形态应基本正常或少有衰老。
接种了样品的细胞如出现FMD病毒典型病变(CPE)，要及时取出并置-30℃冻存。
无CPE的细胞瓶要观察至72h，其后置于-30℃冻存作为第1代细胞/病毒液再盲传，至少盲传3代。
凡出现CPE 的样品判定为阳性，无CPE的为阴性。
为了进一步确定分离病毒的血清型，将出现CPE的细胞/病毒液用间接夹心ELISA等检测方法定型。
2.补体结合试验(CFT)CFT是根据抗原-抗体系统和溶血系统反应时均有补体参与的原理设计的，以溶血系统作为指示剂，限量补体测定病毒抗原。
当病毒抗原与血清抗体发生特异反应形成复合物时，加入的补体因结合于该复合物而被消耗，溶血系统中没有游离补体将不发生溶血，试验显示阳性。
3.病毒中和试验(VNT)口蹄疫病毒血清型划分的依据是型间无交叉免疫保护性，VNT是型别鉴定的重要方法之一，其检测结果可靠，缺点是动用活毒，且用时较长，只能在专门的实验室中进行，无法推行于普通实验室。
4.反向间接血凝试验FMD反向间接血凝试验是将口蹄疫病毒抗体以化学方法偶联于醛化的绵羊红细胞上，当贴附于血细胞上的抗体与游离的抗原相遇时，形成抗原抗体凝集网络，绵羊红细胞也随之凝集，出现肉眼可见的红细胞凝集现象。
感染口蹄疫病毒猪的组织中抗原定位与超微结构变化
位， 以便 阐明 口蹄疫病 毒在 自然宿 主组 织 中复制 的
超微结构基础 。
１ 材 料 及 方 法
１１ 实验 动 物 的 感 染 ．
４月 龄 仔 猪 由本 室健 康 猪 组 提 供 ， ３组 各 用 分
薄切 片作 醋酸铀一 柠檬酸铅双染色 。 日立 Ｈ ７ ０ 一０ Ｈ
透射电镜下观察 ． ． １ ． 免疫 过 氧 化 物 酶 标 电镜 ３
微术 对 口蹄 疫病 毒感 染细胞 培养 物 的研究 已有一 些报道 ， 但对 该病毒感染 动物组织超微病 理学的 描 述 尚少 ， 尤其对感染猪 的研究还 未见报道 。
内蒙 古农 牧业 科 学 院百 年 院庆论 文 集—— 畜牧 特 刊
畜牧与饲料科学
２ １ ３ （— ） １ ０ ９ ０ ０， １６ ７ ：９ —１ １
感染 口蹄疫病毒猪的组织中抗原定位与超微结构变化
杨 玉莹 ， 国雄 杨成林 王潜渊 ， 靳 ， ， 其那 尔 焦团梅 其木格 ， ，
电镜样 品的制备 。健 康对照系活体取样 。
细胞 间 水 肿 细胞 溶 解 ， 致 了水 泡 的形 成 导 ．
关键 词 ： 口蹄 疫病 毒 ： ： 猪 超做 结 构
中 图 分 类 号 ：８ ２６ ￥Leabharlann ５ ．５ 文 献标 识 码 ： Ａ
．
文 章 顺 序 编 号 ：６ ２ ５ ９ （ ０ ０ ０ － １ ０ ０ １７ — １ ０ ２ １ ） ６ ０ ９ － ２
（． １内蒙 古农 牧 业科 学 院动 物 医学 研 究所 ， 内蒙 古 特 ０１０ ０） ０１ 呼和 浩 特 ０ ０ ３ ；． １ ０ １ ２内蒙 古分 析 测试 中心 电镜 室 ， 内蒙 古 呼 和浩
检测口蹄疫病毒抗原的方法
检测口蹄疫病毒抗原的方法（一）口蹄疫反向被动红细胞凝集试验（反向被动血凝）红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性，将提纯的口蹄疫抗体（IgG）在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞，当这种被致敏的红细胞（即红细胞表面均带有口蹄疫抗体），遇到相应的口蹄疫病毒抗原时，便产生抗原抗体的特异性反应，从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。
该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。
1．试验材料V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升规格）、玻璃中试管（内径15毫米，长度100毫米）、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（与血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD（猪水泡病）反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。
２．试验方法（１）稀释待检抗原取中试管8支，横列于试管架上，每管各加入稀释液1 毫升，取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管，混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管，此时待检抗原的稀释度依次为1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。
（２）稀释阴性抗原取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样，加入稀释液390微升，加入阴性抗原10微升，充分混匀，此时阴性抗原的稀释度为1：40。
（３）稀释阳性抗原取中试管20支，横列于管架标明“阳抗”字样，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。
每种阳抗第1管，加稀释液4.7毫升，第2~4管各加稀释液0.5毫升。
取O型阳性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混匀后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混匀，取出0.5毫升加入第1排的第3管混匀后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混匀。
其他阳性抗原均按上法稀释，注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管，切勿混杂以免影响反应的特异性。
口蹄疫疫苗说明书
口蹄疫疫苗说明书引言口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的急性传染病，主要影响偶蹄动物，如牛、羊、猪等。
口蹄疫疫苗是预防口蹄疫的重要措施之一。
本文档将介绍口蹄疫疫苗的使用方法、注意事项以及常见问题解答等内容。
1. 口蹄疫疫苗的简介口蹄疫疫苗是根据口蹄疫病毒的抗原特性制备而成的疫苗，主要包含活病毒疫苗和灭活病毒疫苗两种类型。
疫苗的接种可以增强动物对口蹄疫病毒的免疫力，降低发病率和死亡率。
2. 口蹄疫疫苗的使用方法口蹄疫疫苗的使用方法如下：2.1 接种时间根据动物的生长发育情况和流行病学调查结果，选择合适的接种时间。
一般建议在动物出生后的第三到六个月接种疫苗。
2.2 接种途径口蹄疫疫苗的主要接种途径为肌肉注射和皮下注射。
注射时要注意采用无菌注射器和针头，并保持注射部位的清洁。
2.3 剂量疫苗的剂量应根据动物的品种、体重和年龄确定。
一般情况下，成年牛每头接种5-10毫升的疫苗；幼畜每头接种3-5毫升的疫苗。
2.4 免疫程序一般建议进行初次接种后，随后再进行一到两次的加强免疫。
免疫程序的具体安排应根据动物的生长发育情况和流行病学调查结果确定。
3. 注意事项在使用口蹄疫疫苗时，需要注意以下事项：3.1 贮存条件疫苗应贮存在2-8摄氏度的阴凉处，避免阳光直射。
疫苗在贮存期限内，应定期进行免疫效力检测，并及时淘汰失效疫苗。
3.2 使用前检查使用疫苗前应检查疫苗瓶是否完整，是否有裂纹或渗漏现象。
如发现异常情况，应及时通知生产厂家。
3.3 免疫接种禁忌怀孕的母畜、患有严重系统性疾病的动物以及对疫苗成分过敏的动物禁止接种口蹄疫疫苗。
3.4 免疫反应观察接种疫苗后，应密切观察动物的免疫反应情况。
如发现不适，应及时就医。
4. 常见问题解答4.1 接种口蹄疫疫苗后，动物会出现副作用吗？一般情况下，动物接种口蹄疫疫苗后可能会出现局部红肿、发热等反应，少数个体可能会出现过敏反应。
如果情况严重或持续时间较长，应及时就医。
4.2 口蹄疫疫苗能真正预防口蹄疫吗？口蹄疫疫苗经过临床试验和大规模使用验证，具备较高的预防口蹄疫的效果。
口蹄疫病毒抗原表位和抗原位点的研究进展
口蹄疫病毒抗原表位和抗原位点的研究进展
吴磊;王建科;党江平;焦良奎
【期刊名称】《河南畜牧兽医（市场版）》
【年(卷),期】2017(038)002
【摘要】口蹄疫（Foot—and—Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot—and—Mouth Disease Virus，FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病。
侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其他家养和野生偶蹄动物。
【总页数】3页(P33-35)
【作者】吴磊;王建科;党江平;焦良奎
【作者单位】三门峡市动物疫病预防控制中心,河南三门峡472000;三门峡市动物疫病预防控制中心,河南三门峡472000;三门峡市动物疫病预防控制中心,河南三门峡472000;三门峡市动物疫病预防控制中心,河南三门峡472000
【正文语种】中文
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4.南非2型口蹄疫病毒结构蛋白抗原表位研究进展 [J], 李茜;代军飞;丁耀忠;李国
秀;侯谦;Ashenafi Kiros Wubshet;马炳;张永光;张杰
5.猪口蹄疫病毒抗原位点及其抗原性差异分析 [J], 何永强;盛祖恬;杜青云
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口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析
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A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备
性表 达 的 ＶＰ １融 合 蛋 白进 行 纯 化 ， 后 用 纯 化 的 蛋 白 免 疫 新 西 兰 大 耳 白兔 制 备 其 多克 隆 抗 体 ， Ｅ ＩＡ、 ｅｔｒ ｌｔ 间 然 以 Ｌ ｓ Ｗ ｓｅｎｂｏ 和 接 免 疫 荧 光 法 分 别 对 多克 隆 抗 体 进 行 鉴 定 。结 果 Ｓ － ＡＧ 电 泳分 析 显 示 ｐ Ｔ ３ ａＯｍｐ — ＶＰ ＤＳＰ Ｅ Ｅ －０— Ｔ Ａ １重 组 菌 经 诱 导 后 表 达 一
基础。
关键 词 ： 型 Ｉ 蹄 疫 病 毒 ； Ａ ＝ Ｉ 结构 蛋 白 ＶＰ ； 核 表 达 ； １原 可溶 性 ； ｍｐ 信 号 肽 Ｏ Ｔ 中 图分 类 号 ： ３ ２ １ 文 献 标 识 码 ： Ｒ ９ ．１ Ａ
Ｓ ｌ ｂ ｅ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｈ ｙ －ｐｅ ｉｉ ｎｔｇ ｎ ｏ ｏ ｕ ｌ ｘ ｅ ｓｏ ｆ ｔ ｅ ｔ ｐｅ ｓ ｃ ｆｃ ａ ｉ ｅ ｆ ＦＭ ＤＶ ｏ ｅ ｏ ｙ ａ ｅ ｒ ｔｏ ｆ ｉｓ ｐ ｌ ｃ ｏ ａ ｎ ｉ ｏ ｙ ｆｓ ｒ ｔ ｐｅ Ａ ｎｄ ｐｒ ｐａ ａ ｉ ｎ ｏ ｔ ｏ ｙ ｌ ｎ ｌａ ｔ ｂ ｄ
ＧＡＯ ｈ ｎ ｄ ａ ， Ｓ ａ — ｉｎ ＣＨＡＮＧ ｉ ｕ ＤＵ ｕ — ｈ ｎ ， Ｈｕ— ｎ， ｙ Ｊ ｎ ｚ ｅ ｇ ＣＯＮＧ ｏ ｚ ｅ ｇ， ＨＡＯ ｕ —ｕ ＬＩ ｎ Ｇｕ —ｈ ｎ Ｓ Ｊ ｎ ｊ ｎ， Ｎ Ｔｏ ｇ
（ ｙ Ｌ ｂ ｒ ｔｒ ｆ Ａｎｍａ ｒ ｌｇ ｆ ｉｉｔｙ ｏ ｒｃ ｌｕ ｅ ｔ ｔ ｅ Ｋｅ ａ ｏ ａｏ ｙ ｏ ｉ ｌＶｉｏｏ ｙ ｏ Ｍ ｎｓｒ ｆ Ａｇ ｉｕｔ ｒ ，Ｓ ａ ｅ ｙ Ｋ
Ｍｒ 为 ３ ０ 约 ３００的 ＶＰ １融 合 蛋 白， 与预 期 结 果 相 符 。 目的蛋 白纯 化 后 ， 电泳 图片 上 显 示较 为 清 晰 的 单 一条 带 。Ｗ ｅｔｒ ｌｔ 在 ｓｅｎｂｏ 分析结果显示， Ｐ Ｖ １蛋 白可 与豚 鼠抗 Ａ 型 口蹄 疫 病 毒 阳性 血 清 反应 。用 纯 化 ＶＰ １蛋 白免 疫 新 西 兰 大 耳 白兔 制 备 的 多克 隆抗 体 效 价 达 １： ２８ ０以上 ， 有较 高 的 型特 异 性 ， 且 可 与 同型 Ｆ １ Ｏ 具 并 ＭＤＶ 细 胞 培 养 物 中 的病 毒抗 原发 生 反 应 。结 论 制 备 了具 有 高 亲 和 性 和 特 异 性 的 兔 抗 Ａ 型 Ｆ Ｖ 结 构 蛋 白 ＶＰ ＭＤ １多克 隆抗 体 ， Ａ 型 Ｆ 为 ＭＤＶ 易 感 动物 的抗 体 筛 查 及 病 原 鉴 定 奠 定 了
口蹄疫
口蹄疫口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。
临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。
该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。
鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病之首。
目前，有三分之二的 OIE 成员国流行 FMD，时刻威胁着无 FMD 国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
1 病原口蹄疫病毒（FMDV）是引起口蹄疫的病原。
FMDV 为小RNA 病毒科（Picornaviri -dae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的成员。
FMDV 基因组为单股正链RNA，约有8 500 个核苷酸组成。
口蹄疫病毒共有7 个血清型：O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2和SAT 3 型。
从口蹄疫世界参考实验室所收到的检测样品来看，O 型的流行最为广泛(世界范围内)，其次为 A 型和Asia 1 型，C 型和南非三型非常罕见，通常只在特定区域流行。
A 型在非洲、西亚、南亚、中东和南美许多地区有流行。
下图为口蹄流行图。
2 流行病学2.1 传染源病牛是主要的传染源，康复期和潜伏期的病牛亦可带毒或排毒。
口蹄疫病毒主要存在于水疱皮、水疱液及淋巴液中；另外相关产品如肉、奶、血、内脏、分泌物和毛皮中也有病毒的存在。
病毒会随同奶牛的乳汁、唾液、尿液、粪便、精液和呼出的气体而排出体外。
有报道，奶牛在出现临床症状前的33小时，就已从奶液中排出病毒。
人和非易感动物也是重要的传染源。
当饲养员或兽医和奶牛接触后，被口蹄疫病毒污染的手、衣服、帽等是传染源。
病毒污染过的牛舍、运动场、器械、草料等也是可能性的传染源。
2.2 排毒时间当奶牛接触感染口蹄疫病毒后，排毒时间比人工感染排毒时间大大延长，乳汁和精液3－4天，唾液1－7天，咽部0－9天。
奶牛在发病开始的急性期，即水疱刚开始形成时，达到排毒的高峰期。
3-16 口蹄疫
蹄冠、蹄叉、蹄、鼻盘出现局部发红、微热、 敏 感等症状，不久形成小水疱。
病猪口腔中舌上和腭上、鼻盘、哺乳母猪的乳房 也有水疱和烂斑。
蹄冠上水疱破裂后，常有出血性溃疡面，不久结 成痂皮。 露出出血的皮下组织。
严重者蹄壳脱落，此时患肢不能着地或常卧地不 起或跪行。
有时病猪乳房上也出现烂斑，特别是哺乳母猪尤 为常见。
1、临床综合诊断： 口蹄疫常同时侵害多种偶蹄兽，传播迅速，呈流 行性或大流行性发生。
同时口腔及蹄部有特征性的水疱和烂斑。
死后剖检可见虎斑心和出血性胃肠炎症变。
2、实验室诊断： 采取病畜水疱液及水疱皮，或康复血清送检。 （1）动物接种分离病毒 （2）组织培养细胞分离
（3）中和试验（乳鼠血清保护试验）
五、流行病学
1、传染源：
患病动物和带毒动物（水泡液、排泄物、分 泌物、呼出气体、精液），病畜的水疱皮和水疱 液含毒量最多。污染的肉品、内脏、血、皮毛和 废水。
2、传播途径：
直接接触和间接接触传播。经消化道、伤口 甚至完整的皮肤粘膜、呼吸道、精液感染。空气 也是一种重要的传播媒介，可引起远距离跳跃式 传播。病愈动物可长期带毒。
头，病猪约30万头。 第四次：1975-1985年，前4年牛、猪同发，后6年以猪发 病为主。（85-98年流行间歇期：每年猪发病在几万头之 内）。 第五次：始于1999年，31个省都发生疫情，半数以上县 （1,261个）疫点多达32,704个。牛、羊、猪都发病，高 温季节也发生。
近十多年来我国周边国家发生FMD状况
1.基因组为单股正链RNA，长约8.5kb，VP1-VP4 四种结构蛋白装配成核衣壳。
2.VP1 大部分暴露于核衣壳表面，参与构成病毒 粒子的主要中和抗原位点。VP1 基因变异最频， 一旦发生突变就可改变病毒的抗原性。
口蹄疫病毒粒子检测方法
常用方法一、蔗糖/氯化铯梯度密度梯度超速离心法原理：146S抗原在特定条件下分布在特定浓度的介质中，于259nm处产生最大紫外吸收峰（用OD259表示），OD259与146S浓度成正比。
操作步骤：将口蹄疫病毒样品置于蔗糖密度梯度中离心，在离心力的作用下，样品中的病毒粒子将沉降到相应的密度梯度层内，经紫外分光光度计259纳米检测时有最高吸收峰，而在其他级份层没有吸收峰。
收集146S吸收峰级份，用紫外分光光度计进行检测，即可对146S含量进行定量。
采用这种简单的方法可以快速测定出在紫外分光光度计图表中病毒峰区域的146S病毒粒子含量，并且可以用于监测生产过程中病毒和抗原的收获量，当然也可以用于成品疫苗中146S抗原含量的测定。
此法的优点是：简单，检测所需的成本低此法的缺点是：受人为影响大，不能分型检测，且操作较为复杂，对仪器设备有较高要求。
二、高效液相色谱法原理：以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入紫外检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
此法的优点是：设备自动化程度高，人为影响少，操作简便，重复性好，成本低且耗时短，可用于大批量连续检测。
此法的缺点是：不能区别不同血清型的抗原。
三、单克隆抗体夹心ELISA定量检测法原理：制备针对口蹄疫病毒146S特异位点的单克隆抗体，然后包被ELISA板，应用酶联免疫吸附原理，根据显色情况判定146S病毒粒子的含量。
此法的优点是：检测速度快，适合大批量检测。
此法的缺点是：制备单克隆抗体成本较高，且过程复杂。
针对不同毒株需要制备不同的单克隆抗体。
非常用方法四、blab/c小鼠免疫抗体测定法原理：给小鼠在注射抗原之后，免疫抗体水平的高低与146S抗体水平相关，使用液相阻断ELISA试剂盒检测抗体滴度。
此法的优点是：测定结果可以判断疫苗中不同血清型抗原的免疫应答，也可以评价疫苗成分，如佐剂、免疫增强剂等的对免疫应答的影响，是一种综合评价口蹄疫疫苗效力的方法此法缺点：本方法属于间接检测方法，且仍待完善，无法精确定量检测146S病毒粒子的含量。
口蹄疫
周边国家疫情对我国的威胁
印度:因贫困和宗教信仰，使FMD难以控制，O、A、C和Asia1 到处流行。巴基斯坦、尼泊尔、不丹等国情况相同。 马来西亚、缅甸、泰国、老挝、柬埔寨和越南流行O、A、和 Asia1流行。菲律宾1976年进口南美牛将C型带入。1996年印度 和菲律宾暴发发生C型口蹄疫，虽此后再未见有暴发，但C型的 潜在威胁不容忽视。 日本、南朝鲜、蒙古、俄罗斯于2000年发生O型FMD，毒株属O 型泛亚毒株。 前苏联解体后与我国相邻的国家，大多流行过或正在流行A型 口蹄疫。 2005年后，俄罗斯、越南等国与我国接壤的地区先后发生了 Asia1型口蹄疫。 不丹、伊朗、伊拉克、沙特阿拉伯和巴基斯坦疫情更为严重， 尤其是巴基斯坦疫情复杂，同时流行A、O和Asia1型，对我国威 胁最大。
渐好转；部分动物，特别是幼畜，会因恶性口蹄疫
而死亡；部分动物，特别是牛可转为持续性感染。
口蹄疫临床症状-牛
早期症状：奶牛产奶量突然减少，厌食、精神沉郁和发热。 1天后，口腔及周围、蹄部和乳房，乳头上可发现水泡。 在 8-12小时内随着液体的积聚变得更加凸起。在形成水泡的急性 病程中，口腔疼痛，感染牛的唇和下腭震颤，分泌过量唾液（ 流涎），在水泡破裂后流涎更明显严重，常出现白沫状口水， 粘稠的唾液。 舌面上皮逐渐坏死，并在1-2天内破裂，留下无表皮（露肉 ）的红色糜烂（烂斑），抓舌（检查）可加速破裂导致大片舌 皮脱落。 出现水泡的部位还有：鼻孔内和口鼻凸出部。鼻孔中的病损 通常很小，愈合后表面形成结痂。
周边国家疫情对我国的威胁
亚洲是口蹄疫的重灾区。多年以来，我国始终处于Asia I 型口蹄疫包围之中。据世界动物卫生组织（OIE，2002-2004 年度）公布的疫情资料显示，在我国周边的印度、巴基斯坦、
申联口蹄说明书
申联口蹄说明书首先，口蹄疫病毒的感染性非常强：1、传播途径多，可通过空气传播、接触传播、气溶胶的远距离传播；2、排毒量大，猪是口蹄疫病毒气溶胶的最大制造者，每天排出108感染单位，可使1000万头牛发病。
因此，并不是生物安全做好了，疫苗就可以不打了，特别是对于没有安装高效空气过滤器的猪场来说，疫苗免疫依旧是最有效的防控手段。
其次，口蹄疫病毒的血清型多达7种，目前国内流行的是O型和A型。
O型和A型又分出很多亚型，所以免疫过程中一定要分清楚国内猪群的流行毒株，及时更换。
第3个特点是病毒免疫原性弱。
免疫保护力取决于合理的抗原含量和匹配的毒株，并不是抗原含量越高保护力就越高。
国际上一般将口蹄疫疫苗中的抗原含量定为1-10μg/剂量，低于1.5μg/剂量不能诱导良好的免疫应答，高于9.2μg/剂量时中和抗体滴度并不因抗原量的增加而提高。
第4个特点是敏感，导致口蹄疫疫苗稳定性差。
疫苗中抗原含量的稳定性非常关键，在灭活疫苗中，完整FMDV粒子（146S粒子）是至关重要的免疫抗原，它的数量和稳定性决定了疫苗的免疫效果。
FMDV粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果将大幅降低。
研究发现，灭活的口蹄疫病毒146S在4℃时相对稳定，但在37℃及以上的温度下稳定性较差，即使在几个小时内，146S损失也会很大；当pH值低于6.8时，146S很容易裂解，最稳定的pH值范围为7.5-8.0。
为了解决口蹄疫疫苗稳定性的问题，一般选择添加抗原保护剂。
传统的抗原保护剂有氨基酸类、蛋白质类、多羟基类等，不同的配比组合形成抗原保护剂，各有优缺点。
王江辉介绍，申联生物目前创新运用独创的分子书钉i-MolSta--双向抗原保护技术，可有效解决疫苗降解难题。
防控需要做好疫苗免疫和生物安全口蹄疫的有效防控离不开生物安全和疫苗免疫。
王江辉表示，生物安全不需要多复杂，关键是要执行到位。
而疫苗免疫方面，必须坚持打苗，选对血清型，选对种毒，并且选择含量稳定的疫苗才能起到保护效果。
一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存的方法[发明专利]
![一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/945506df4bfe04a1b0717fd5360cba1aa8118c1c.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710114633.9(22)申请日 2017.02.28(71)申请人 中国科学院过程工程研究所地址 100190 北京市海淀区中关村北二条1号(72)发明人 张松平 杨延丽 苏志国 马光辉 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司11332代理人 巩克栋 侯桂丽(51)Int.Cl.C12N 7/04(2006.01)C12N 7/02(2006.01)(54)发明名称一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存的方法(57)摘要本发明涉及一种口蹄疫灭活病毒分离纯化或储存的方法。
该方法通过在口蹄疫灭活病毒分离纯化或储存过程中加入含有多元羟基的化合物，提高色谱分离和膜分离过程中有效抗原的收率，并极大地提高口蹄疫灭活病毒在储存过程中的稳定性，防止病毒的降解和破碎。
本发明的方法简单，所用物质为生物相容性好的试剂，效果明显，安全有效，提高了分离纯化的收率，降低了生产成本。
此外本发明降低了疫苗对保存的温度条件要求，方便纯化、储存和运输，提高灭活病毒的稳定性，延长疫苗产品的存放时间。
权利要求书1页 说明书9页 附图2页CN 108504638 A 2018.09.07C N 108504638A1.一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存的方法，其特征在于，在纯化或储存过程中加入多元羟基化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多元羟基化合物选自糖类、多元醇或聚乙二醇中的任意一种或至少两种的混合物；优选地，所述糖类选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖或鼠李糖中的任意一种或至少两种的混合物；优选地，所述多元醇选自甘油、山梨醇、甘露醇或肌醇中的任意一种或至少两种的混合物；优选地，所述聚乙二醇选自分子量为400～20000Da的聚乙二醇中的任意一种或至少两种的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多元羟基化合物加入后的质量/体积浓度为1％～50％，优选10％～30％；优选地，所述糖类加入后的质量/体积浓度为5％～30％，优选10％～20％；优选地，所述多元醇加入后的质量/体积浓度为5％～30％，优选10％～20％；优选地，所述聚乙二醇加入后的质量/体积浓度为1％～10％，优选1％～5％。
荧光定量RT-PCR测定口蹄疫病毒悬液内病毒颗粒抗原含量方法研究
检测周期 长 ， 检测条件 要求 高 ， 不 利 于 疫 苗 生 产 企 业 在 批 量
度 测 定 是 准 确 检 验 有 效 抗 原 含量 的 唯 一 方 法 。但 是 ， 此 方 法
含 １ ＴＭＢ的二 甲基 亚 砜 溶 液 和 ３ 的双 氧 水 。 主 要 仪 器 ： 荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ仪 （ ７ ５ ０ ０ Ｆ ａ ｓ ｔ ， Ａ Ｂ Ｉ 公 司） 、 酶标 仪 （ ＡＢ Ｉ 公司） 、 超低温 冰 箱 （ Ｓ ＡＮＹ Ｏ 公 司） 、 Ｍａ ｇ Ｍａ ｘ － ９ ６ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ高 通 量
方法 ， 结合 应 用 口蹄 疫 １ ４ ６ Ｓ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 抗 原 定 量技 术 定 量 的 抗 原 作 为 荧光 ＲＴ — Ｐ Ｃ Ｒ定量 的标准对 照抗原 ， 利 用 两 种 方 法 分 别 检 测 倍 比稀 释 的 标 准 抗 原 ， 研究 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ ｃ ｔ 值与Ｉ ： ７ 蹄疫病毒 １ ４ ６ Ｓ抗 原 含 量 的 相 关 关 系。 研 究 结 果 表 明 ， 口 蹄疫 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ的 ｃ ｔ 值 与 口蹄 疫病 毒 １ ４ ６ Ｓ抗 原 含 量 ｌ ｏ ｇ ２ 的 对 数 值 间呈 负 线性 相 关 关 系。 荧 光 定 量 Ｒ Ｔ— Ｐ Ｃ Ｒ可 以用
生产 过 程 中及 时 、 准确地掌握病毒含量 。 实时荧光定量 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ（ Ｒ ｅ ａ ｌ ｔ ｉ ｍｅ Ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ Ｑｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ａ —
实验操作指南
实验操作指南一、亚洲I型口蹄疫抗体检测液相阻断ELISA（LB-ELISA）试验液相阻断ELISA主要用于检测抗体。
应用于两个方面的目的：⑴检测FMD病毒感染，广泛用于国际贸易中；⑵监测免疫抗体，评价FMD疫苗免疫效力，也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻击能力。
1、反应原理预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了FMD型特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，亦与随后加入的豚鼠搞血清中的抗体结合，再通过兔抗豚鼠IgG酶结合物和底物溶液显色。
按试验孔呈现的颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。
抗体滴定以能阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。
2、主要试剂与耗材⑴主要试剂①捕获抗体：口蹄疫146S兔抗血清②检测抗体：口蹄疫病毒146S豚鼠抗血清③酶结合物：兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物④病毒抗原及病毒对照抗原：用BEI灭活的病毒细胞培养物⑤标准阳性血清和阴性血清⑥底物溶液：邻苯二胺（OPD）/H2O2溶液（具体配制溶化后，再加2片OPD片剂，充分溶解，分装成5 ml或10 ml/瓶，避光-20度保存。
用前避光溶化，临用时每10 ml上述溶液加100ul配备的3%的双氧水）⑦终止液：1.25mol/LH2SO4⑧缓冲液包被缓冲液：0.05MNa2CO3/NaHCO3，PH9.6稀释液：0.05%（V/V）Tween-20加入0.01MPBS，PH7.4（PBST）豚鼠抗血清稀释液：5%脱脂奶粉-PBST洗涤液：0.01MPBST，PH7.4⑵主要仪器材料①ELISA板：96孔平底聚苯乙烯ELISA板。
②抗原抗体反应板：96孔U形夜工聚丙微量板。
③移液器：0.5-20ul，5-40 ul，50-200 ul，200-2000 ul可调节移液器各一把，8道或12道移液器一把，移液槽5-6个，各配套移液枪尖若干。
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口蹄疫病毒抗原ELISA、病毒分離及RT-PCR敏感性之比較
報告人：黃郁珳 助理研究員（豬瘟研究組）
壹、緒言
口蹄疫(Foot and mouth disease；FMD)是㆒種急性偶蹄類動物傳染病，會造成嚴重之經濟損失。
口蹄疫病毒(FMDV)是屬於正股單鏈RNA病毒，歸類於小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)、口瘡病毒屬(Aphthovirus)。
FMDV共㈲O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等㈦種血清型，各血清型病毒間無交叉免疫保護作用。
而口蹄疫的實驗室診斷以抗原鑑定為主，目前本所使用的口蹄疫抗原鑑定方法包括病毒分離(Virus isolation)、抗原-酵素結合免疫吸附試驗(antigen enzyme-linked immunosorbent assay；Antigen-ELISA)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction；RT-PCR)等。
病毒分離是根據世界動物衛生組織（O.I.E）出版的「陸生動物的診斷測試及疫苗手冊」㆗口蹄疫的抗原診斷方法進行，以單層BHK21及EBK等㈱化細胞分離試材㆗的口蹄疫病毒。
而抗原-酵素結合免疫吸附試驗則是利用抗原抗體間專㆒性鍵結的㈵性，檢測所稀釋試材㆗的口蹄疫病毒抗原，且鑑定其血清型別。
反轉錄聚合酶連鎖反應是利用㆒對方向相反的寡核苷酸引子，先利用反轉錄酶將待測RNA轉錄成cDNA，再經由DNA聚合酶的作用，反覆進行變性作用、煉合作用及延展作用等㆔步驟，而將㈵定的DNA片段大量複製，從而提升檢測病毒核酸之敏感性達百萬倍之多。
由於口蹄疫疫情的控制，首重快速而準確的診斷。
本所目前使用的㆔種口蹄疫診斷技術均是世界動物衛生組織（O.I.E）出版的「陸生動物的診斷測試及疫苗手冊」㆗所列舉之檢測方法，但是該手冊㆗並未針對其敏感性詳加描述，然而，在初步的診斷結果㆗，敏感性與診斷的準確度相關，若敏感性太低，將造成假陰性的診斷結果。
因此，為了解此㆔種口蹄疫診斷技術之敏感性，乃進行此㆒實驗。
貳、材料與方法
本實驗，我們選擇㆒㈱源㉂細胞培養的口蹄疫病毒及㆒㈱口蹄疫病毒感染的㈬疱㆖皮組織10倍乳劑，分別以含2%胎牛血清之細胞培養液，進行10倍連續稀釋㉃10-8，再分別進行病毒力價回歸試驗、病毒分離、抗原-酵素結合免疫吸附試驗及反轉錄聚合酶連鎖反應等檢測。
㆒、病毒力價回歸試驗
將各稀釋階之病毒及BHK 21㈱化細胞同時加入96孔平底細胞培養盤，置於37℃含5% CO2之細胞培養箱㆗培養兩㆝，再以顯微鏡觀察細胞病變作用(CPE)產生情形，紀錄各稀釋階病毒所產生之CPE數目，再依據Reed 及Muench方法，計算病毒力價。
㆓、病毒分離
將各稀釋階病毒分別接種㉃BHK 21及EBK等㈱化細胞，先置於培養箱㆗感作㆒小時，以磷酸緩衝液(PBS)清洗後加入細胞培養液，置於37℃含5% CO2之細胞培養箱㆗培養，逐㈰觀察㈲無細胞病變作用(CPE)產生。
㆔、抗原-酵素結合免疫吸附試驗
首先將具㈲專㆒性之抗體被覆（coating）於96孔免疫反應盤㆖，再分別加入各稀釋階之病毒，使病毒抗原與免疫反應盤㆖的抗體進行專㆒性鍵結，反應後經以PBS清洗㈥次，再加入另㆒種對病毒抗原專㆒鍵結之檢測抗體，與待測抗原進行鍵結。
之後加入帶㈲酵素之結合體抗體，與檢測抗體鍵結，最後加入酵素受質使之呈色，以肉眼初判其呈色結果後，再以ELISA判讀機讀取反應之吸光值。
當待測試材的平均吸光值減去空白對照組的平均吸光值大於0.1，即表示待測試材為口蹄疫抗原陽性。
㆕、反轉錄聚合酶連鎖反應
取0.2ml各稀釋階病毒分別置入微量管㆗，加入Trizol核醣核酸(RNA)萃取試劑，依據試劑的操作說明進行RNA核酸萃取。
核酸再依據Vangrysperre等1996年發表之方法進行RT-PCR 檢測，反應產物以洋菜凝膠進行電泳分析，再以 UV 燈照射檢視結果，並拍取照片。
參、結果與討論
病毒力價回歸試驗結果，計算後細胞培養口蹄疫病毒其病毒力價為104.89 TCID50/0.05ml，組織10倍乳劑之病毒力價為104.67TCID50/0.05ml；在病毒分離部份，以EBK細胞進行病毒分離，在10-5稀釋階仍出現CPE陽性，且最早可在感染後12小時即可觀察到CPE（表㆒）；而以BHK 21細胞進行病毒分離時，只能檢測到10-4稀釋階，並且在感染後24小時才觀察到CPE（表㆓）；另Antigen-ELISA方法所檢測之吸光值，經計算後，最高僅能檢測㉃10-1稀釋階（表㆔），意即Antigen-ELISA方法能檢測之力價，在細胞培養口蹄疫病毒之力價為103.89TCID50/0.05ml，在組織10倍乳劑之力價為104.67TCID50/0.05ml；而在RT-PCR方法㆗，不論是以Trizol或Qiagen之商品化核酸萃取套組進行病毒核酸萃取，均可檢測㉃10-6（圖㆒與圖㆓）。
由此結果顯示，本所目前使用的㆔種口蹄疫診斷技術㆗，以RT-PCR的方法最敏感，其次是病毒分離，而以Antigen-ELISA最不敏感。
表㆒、EBK細胞病毒分離結果
-2 -3 -4 -5 -6 C 12hrs ＋ ＋ － － － － 24hrs ＋ ＋ ＋ ＋ － － 36hrs ＋ ＋ ＋ ＋ － － 48hrs ＋ ＋ ＋ ＋ － － C：表示細胞對照組；＋：表示CPE陽性；－：表示CPE陰性。
表㆓、BHK-21細胞病毒分離結果
-2 -3 -4 -5 -6 C 12hrs － － － － － － 24hrs ＋ ＋ ＋ － － － 36hrs ＋ ＋ ＋ － － － 48hrs ＋ ＋ ＋ － － － C：表示細胞對照組；＋：表示CPE陽性；－：表示CPE陰性。
表㆔、口蹄疫病毒及組織10倍乳劑以Antigen-ELISA檢測之判讀吸光值
口蹄疫病毒 組織10倍乳劑 稀釋倍數
原液
10-10.29750.0975
10-20.0425 0.029
10-30.0225 0.0105
10-4-0.0002 0.012
10-50.0002 0.0075
10-60.0006 -0.0055
10-70.0105 0.0055
10-80.018 0.007
圖㆒、RT-PCR檢測結果（以Qiagen之商品化核酸萃取套組萃取病毒核酸）。
圖㆓、RT-PCR檢測結果（以Trizol試劑萃取病毒核酸）。