浅析细菌内毒素检测方法及常见问题

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鲎试剂:利用鲎血液中的变性细胞,经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物, 能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应,反应 的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关,是体 外检测内毒素的敏感试剂。
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名词解释2—国家标准品及工作标准品
国家标准品: (单位:EU/ml)
光度法:
内毒素含量应小于0.005EU/ml;
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细菌内毒素检测之凝胶法
❖ 实验程序 1、试验准备:试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度,计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验(新药或新方法) 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
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❖ 实验材料及用具
1、仪器
名称
天平
电热干燥箱 恒温水浴箱
水银或酒精温度计
漩涡混合器
计时器
2、器具
器具分类
要求 感量0.1mg以下
~300℃ 37±1 ℃ ~100 ℃±1 ℃
/ 60min±1min
器具名称
反应试管
玻璃试管(外径10×75mm)、试管架、 小三角瓶或磨口瓶
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头
其他
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、
❖ 本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。
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鲎试剂与内毒素反应机理
内毒素
C因子
活化的C因子
B因子
活化的B因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白原
鲎凝血系统-酶联反应
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凝胶
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名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎:一种古老的栖身于沿海的海洋生物,节肢动物 门,在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。
2.不耐酸碱性
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故:玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
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❖ 主要特性(实验器材处理方法)
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水,本身不具挥发性,但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中,造成污染。
故:不可用湿热灭菌法处理实验器具
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❖ 主要特性(去除内毒素方法)
4.滤过性
原体积很小,约在1~5 nm之间,故能通过除 菌滤器而进入滤液中,但不能通过石棉滤板,也不 能通过半透膜。
5.吸附性
能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷,因而可被某些离子交换介质吸附。
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❖热原=内毒素 ?
热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物 等使人体发热的物质,不仅仅是细菌内毒素。


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EU/ml EU/ml





1 EU/ml
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热原检查法
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❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济; ❖ 重现性好、灵敏度高; ❖ 避免抗原的产生,克服生物测定的误差;
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法,逐渐替代了热源 法
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❖ 在药检中的应用
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法, 已经广泛的被世界各国药典收载。
但在药检的范畴,细菌内毒素是主要的热 原物质,可以说无内毒素就无热原,控制内毒
素就是控制热原。
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❖ 热原检查方法简介
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在 规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、 仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的 效价;
工作标准品:
经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符 复核、干扰试验及各种阳性对照;
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名词解释3—细菌内毒素检查用水
凝胶法:
内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水;
故:灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水
浅析细菌内毒素检测方法及常见 问题
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内容 ❖细菌内毒素简介
❖细菌内毒素检测方法
❖常见问题及解决方案
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一、细 菌 内 毒 素 简 介
❖ 主要内容
—— 来源 —— 特性 —— 与热源的关系 —— 在药检中应用
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❖ 主要来源
主要来自于革兰氏阴性杆菌,当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素,其化学成分主要是脂多糖, 这是一种大分子物质,分子量约为106,其粒径约 在1~ 5纳米 。
90EU/ml
0.2ml 1.6ml
10EU/ml 0.2ml 1.8ml
1EU/ml
1ml 1ml
1ml 0.0625EU/ml 1ml 0.125EU/ml
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1ml 1ml
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0.5EU/ml 1ml 1ml
0.25EU/ml
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0.2ml 0.2ml 1ml
1ml
1ml
1ml






细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中 含内毒素的量为1至100EU/ml。
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4
❖主要特性(实验器材处理方法)
1.耐热性
一般在100℃加热1小时无影响,120℃加热4 小时能破坏98%,180-200℃干热2小时或 250℃干热半小时才能完全破坏。
故:注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。
封口膜、记号笔
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❖ 试剂
1、鲎试剂:具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、75%乙醇
❖ 常用英文缩写
BET:细菌内毒素检查 BET水:细菌内毒素检查用水
MVD:供试品最大有效稀释倍数 NC:阴性对照
MVC:供试品最低有效浓度
PC:阳性对照
λ:鲎试剂灵敏度
L:供试品细菌内毒素限值
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❖ 灵敏度复核试验:每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度 复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平 条件进行验证。以证实操作正常无误,准确可靠和结果可信。
试验举例:内毒素工作标准品为90EU/支;
待测鲎试剂灵敏度λ=0.25EU/ml。
1、制备内毒素标准溶液:取工作标准品一支,轻弹瓶壁使粉 末落入瓶底,用砂轮在瓶颈出划痕,用75%酒精擦拭后启开, 加1mlBET水溶解,封口膜封住,置漩涡振荡器上混匀15min 后进行稀释,步骤如下(箭头下方为加入BET水量):
❖ 成品检查——药品安全性检查之一
❖ 半成品(生产过程)检查——事前质控手段,避 免造成药品成批报废
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二、细菌内毒素检测方法
❖ 《中国药典》批准使用方法:
凝胶法
测定
浊度法
方法
光度测定法
显色基质法
❖ 供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。但当测 定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。
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