产纤维素酶细菌的筛选及培养

产纤维素酶细菌的筛选及培养

一、筛选步骤

1、菌种的采集

采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。

2、菌种初筛

（1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。

（2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。

（3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）加入1号试管，加无菌水。混匀后吸取加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。

（4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液于CMC 培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。

（5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。

（6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。

（7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。

（8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。

3、菌种复筛

（1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。

（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min 下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。

二、培养方法

1清洗实验器具

2灭菌

3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基）

4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床）

5稀释菌样

6涂布平板或平板划线

7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了

8观察记录（数量、分布等）

三、培养基种类及其组成

1、初筛

CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨 1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25 g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。

刚果红培养基： (NH4)2S04 2 g，MgS04·7H20 0.5 g，K2HP04 1 g，NaCl 0.5 g，微晶纤维素2 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL。

无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加水1000mL，加棉塞与CMC培养基一起灭菌20 min。另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用。

2、复筛

基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KH2PO419，MgSO4 0．29，Nacl 10g水1000mL，pH调至7，121℃灭菌20min

3、培养

纤维素培养基:硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钠0.5g，纤维素粉20.0g，刚果红0.2g，琼脂20.0g,在，25℃条件下灭菌。

宋扬

生技1212

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