不同实验中transwell小室的选择 和使用
(完整版)transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备1、无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜:用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。
2、有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 µl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。
但这一步并不就是必须的。
②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。
个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。
transwell实验原理与步骤
1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃ 30 min使Matrigel 聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
不同实验中transwell小室的选择和使用
不同实验中transwell 小室的选择和使用Transwell 小室在细胞实验中很常用,共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同.根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为 6 孔板小室、12 孔板小室和24 孔板小室以及和transwell 皿配套的75 mm 直径的小室；根据孔径的不同,从小孔径到大孔径又分为0。
4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。
小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,应该选择3μm 以下的孔径。
例如共培养实验和caco —2 细胞转运模型实验。
共培养实验：常用0。
4、34μm，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的影响.caco—2 细胞转运模型:选用0。
44μm 膜，将Caco-2 细胞以约l×10 个/mL,每孔0.5 mL 的密度接种在Transwell 内培养21d 左右，前 1 周隔天换液，1 周后每天换液.在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求.涉及到细胞迁移的实验：要用5。
0、8。
0、12。
0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。
趋化性实验：细胞 B 对细胞 A 的趋化作用，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室,可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用,将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
细胞迁移实验：常用8。
0、12。
0μm 膜，上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子,细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。
Transwell侵袭实验
Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。
1．实验用品：Transwell小室：多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。
这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。
BD也有已包被好的，价格不清楚。
Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。
下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。
linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm，用于肿瘤的侵袭实验。
iceyxy战友提供的价格：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。
梅林战友提供的BD价格： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的。
liguofan说国产的boyden30块一个。
jjyy提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到。
平均每个20元不到。
Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。
transwell小室实验原理
Transwell小室实验是一种常用于细胞学研究中的实验方法，主要用于研究细胞迁移、侵袭、成血管和细胞-细胞相互作用等细胞生物学现象。
本文将详细介绍Transwell小室实验的原理及其在细胞学研究中的应用。
一、Transwell小室实验原理Transwell小室实验是通过一种特殊的小室装置进行的，该装置由两个分隔的小室组成，上下两个小室之间通过一片具有微孔的多孔膜相连。
这片多孔膜的孔径可以根据实验需要进行选择，常见的孔径有3um、8um等。
在实验过程中，我们将需要观察的细胞或细胞外基质放置在上小室中，而下小室中则向其添加一定浓度的化学物质或药物。
待实验进行一定时间后，我们可以通过上下小室之间的多孔膜来观察细胞的迁移、侵袭或是其他相关现象。
在Transwell小室实验中，我们可以根据实验需要对多孔膜进行功能修饰，比如涂覆胶原蛋白、基质蛋白等物质，或是加入不同浓度的化学刺激物质，以模拟细胞在不同生理环境下的行为。
这种设置能够更真实地反映细胞在体内的生理活动，进一步帮助我们理解细胞的生理与病理过程。
二、Transwell小室实验在细胞学研究中的应用1.细胞迁移和侵袭研究Transwell小室实验广泛应用于细胞迁移和侵袭研究中。
我们可以将需要研究的细胞悬浮在上小室中，然后在下小室中添加诱导因子，比如趋化因子、血浆成分等，通过多孔膜对细胞进行筛选，并观察细胞在多孔膜上迁移扩散的情况。
这种实验能够模拟体内细胞在不同环境中的迁移和侵袭过程，帮助我们更好地理解细胞在肿瘤转移、炎症反应等生理和病理过程中的行为。
2.成血管研究Transwell小室实验也常用于细胞成血管相关的研究。
我们可以在上小室中培养内皮细胞或其他与血管生成相关的细胞，然后在下小室中添加适当的生长因子或细胞因子，观察细胞在多孔膜上形成管状结构。
这种实验方法有助于我们深入了解血管生成的分子机制，并为相关疾病的治疗提供新的思路。
3.细胞-细胞相互作用研究在细胞-细胞相互作用研究中，Transwell小室实验也具有重要的应用价值。
transwell迁移实验原理及步骤
transwell迁移实验原理及步骤细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
transwell迁移实验步骤：1. 材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster 和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2. transwell迁移步骤和流程：2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%PBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备1. ?无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN 的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min使Matrigel聚合成凝胶。
2. ?有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
transwell实验原理与步骤
一、Tran swell 小室制备1. 无基质胶Tran swell 小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。
另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Tran swell 小室制备Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
transwell小室边缘效应
transwell小室边缘效应Transwell小室边缘效应，指在进行细胞培养等实验时，小室边缘区域会出现细胞死亡、细胞树枝突起等现象，严重影响实验结果的准确性和可靠性。
这种现象是由于小室边缘区域的细胞受到了不均衡的培养条件（比如营养物质、氧气和CO2浓度的不均衡）而导致的。
下面将从几个方面来探讨如何避免或减轻Transwell小室边缘效应。
一、准备工作1.选择合适的Transwell小室，尽量避免小室边缘区域影响实验结果。
2.选用透气性好的滤膜，有利于保持小室内外氧气和CO2浓度的均衡。
二、培养基的制备1.培养基的pH值应该是均衡的，避免因pH的不均衡而造成了Transwell小室边缘效应。
2.加入适量的缓冲剂，用于维持培养基的pH值，保持培养基的稳定性并减少Transwell小室边缘效应的发生。
3.在培养基中加入适当的营养物质和氨基酸，有利于细胞生长和繁殖，同时也可以减轻Transwell小室边缘效应。
三、小室的处理方式1.将Transwell小室放于加热垫或温箱内，可以使小室内外温度均衡，避免因温度不均衡导致的效应出现。
2.在小室上下方各放置一张培养皿，可以使小室内外氧气和CO2浓度保持均衡，减少Transwell小室边缘效应的发生。
四、细胞的处理方式1.尽量避免或减少细胞接触小室边缘区域，可以通过在培养基中加入适量的润滑剂或防止细胞树突延伸的化学物质等方式实现。
2.适当调节细胞密度，可以在一定程度上减少Transwell小室边缘效应的发生。
通过以上的措施，可以有效地避免或减轻Transwell小室边缘效应的发生，从而保证实验结果的可靠性和准确性。
需要注意的是，不同实验条件下可能会有不同的影响因素，因此在具体进行实验前，需要根据实验条件和需要考察的样品等因素综合考虑，选用相应的措施进行处理，以避免出现影响实验结果的Transwell小室边缘效应。
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Transwell实验，也被称为细胞侵袭实验，是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。
其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，并将研究的细胞种在上室内。
由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。
在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
在肿瘤细胞侵袭实验中，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。
肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似）。
最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。
有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。
建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。
Transwell实验的具体操作步骤如下：1.实验前的准备工作：需要提前一天将Matrigel胶（一种人工合成的细胞外基质）从冰箱中取出，放置在冰盒上融化。
同时，将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。
2.基质胶铺板：将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合，然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部，注意要避免产生气泡。
铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟，使Matrigel胶凝固。
3.细胞处理：将需要研究的细胞进行传代或复苏，并用无血清培养基洗涤两次，然后用胰酶消化并计数。
4.接种细胞：将计数好的细胞用无血清培养基重悬，然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，注意要保证每个小室的细胞数量一致。
5.添加培养液：在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基，上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。
6.培养细胞：将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时，具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。
Transwell
Transwell实验：小室，24孔板，基质胶，无血清培养基，有血清培养基，单独的细胞，黄枪头，蓝枪头，大枪头
1.取出基质胶置于冰上，待其融化（时间较长）。
2.每个小室内加50ul基质胶，但领的胶是5*的，铺在小室内的是1*的，所以要用无血清培养基稀释，即10ul胶+40ul无血清培养基，提前在EP管中配好，稍多配点，加入小室，注意胶是否铺满小室底部，注意不要戳破小室膜，加完后置于37℃培养箱2h，待胶凝固。
3.2h后将无血清培养基加热，吸200ul无血清培养基加入小室，水化基质胶，置于37℃培养箱30min,其间消化细胞，用无血清培养基吹打，计数，准备每个小室加10的5次方个细胞。
4.30min后将小室中的培养基吸出，将细胞加入小室，总量200ul，不足量用无血清培养基补齐，如果量太大则只能加200ul，（细胞数计好后，少加20-50ul左右）。
5.加完后，从小室的侧孔加500ul有血清培养基，加入下室。
加完后置于37℃培养箱24-36h 后处理。
6.约30h后，将小室取出用PBS洗2遍，放入干净孔中，再用4%多聚甲醛（上室加100ul,下室加500ul）固定1h。
7.1h后用PBS洗涤2遍，再放入孔中，加结晶紫染色90min（上室加100ul,下室加500ul）。
8.90min后，取出用PBS洗涤，再用显微镜拍照，用棉签将上室膜轻轻拭去，拍出的照片即为侵袭过去的细胞。
Transwell小室实验
Transwell小室实验Transwell小室实验：(1) 在转染前一天，在6孔板内铺上5-8F、HONE1和HNE2细胞，2ml无抗生素完全培养基培养过夜，到转染时使细胞达到60-80%的融合度。
(2) 将pIRESneo3（对照组）和pIRESneo3 Flag-LPLUNC1（过表达组）重组质粒分别溶于50ul Opti-MEM 培基中，加入3ul p3000，混合均匀。
每组设置两个重复孔。
(3) 将适量3ul Lipofectamine 3000溶于50ul Opti-MEM 培基中，混合均匀。
在室温下孵育5min。
(4) 将上述两种混合物混合（总体积约100ul），并在室温下静置10min。
(5) 6孔板中每孔加入100ul的复合物，混合均匀。
(6) 37℃、5%CO2培养箱中继续培养36-48h。
(7) 将冻存于-20℃的BD Matrigel胶取出于4℃过夜，使其融化成液态，稀释胶用的tip、EP管放在-20 ℃过夜已备用。
(8) 基质胶的稀释：取10ul Matrigel胶，加入80ul无血清培养基，充分混匀，(4℃条件下操作)，加入各Transwell板上室中，10ul ／室，放入37℃培养箱中，孵育2-3h。
当出现“白色层”时，说明Matrigel胶已经变为固态。
注：基质胶和无血清培养基按1:8 稀释（也有1:2稀释后，10ul/室）(9) 消化转染后的实验细胞，用无血清培基洗涤2 次，再用无血清培基重悬细胞，细胞计数，调整细胞数为2×104 ~ 1×105/ml。
(10) 下腔室中加入800ul含有20％FBS条件培养基，将上室放入不能产生气泡，每孔上室中加入200ul细胞悬液。
37℃培养箱中，孵育约24~48h。
(11) 取出Transwell板，用生理盐水洗两遍，10％甲醛浸洗10min，用清水洗3遍。
(12) 用0.1%结晶紫染色或Giemsa染色，室温5min，生理盐水洗两遍。
transwell小室实验原理 -回复
transwell小室实验原理-回复小室实验是一种常用的细胞迁移和侵袭性研究的实验方法。
它利用一个特殊的细胞培养装置，被称为Transwell小室，来模拟细胞在体内穿过细胞外基质和血管内膜的过程。
本文将逐步回答Transwell小室实验的原理。
第一步：概述Transwell小室实验Transwell小室是一种由可透过细胞的，可移动的多孔膜隔离的实验装置。
它由两个相互连接的细胞培养室组成，分别称为上室和下室。
上室通常用于培养细胞，而下室则用于放置吸引因子和培养基。
细胞通过小孔的膜迁移到下室，以模拟细胞在体内跨越组织间隙和穿越血管壁的能力。
第二步：Transwell小室的构造Transwell小室通常由两个相同尺寸的组件组成。
每个组件都有一个培养室，上室和下室之间通过一个细胞可穿过的多孔膜分隔开来。
这个多孔膜可以是薄酯膜、聚碳酸酯膜或仿生膜。
根据实验需要，孔的直径可以选择在3-8微米之间。
第三步：Transwell小室实验的步骤1. 准备Transwell小室：将Transwell小室的上室和下室分别放入培养皿或96孔板中。
确保它们紧密贴合，并将下室中的培养基预先加热至37C。
2. 细胞培养：将待测细胞悬浮液加入上室中，通常在上室加入细胞数目的同时也添加上室培养基。
将培养皿或96孔板放入细胞培养箱中，以适合细胞生长的条件孵育。
3. 添加吸引因子：在下室中加入吸引因子和适当的培养基。
4. 细胞迁移到下室：细胞将通过上室中的多孔膜迁移到下室。
迁移的细胞数量和时间的长短取决于细胞类型和实验目的。
5. 细胞染色和观察：移除上室中的细胞，可以通过用PBS洗涤或抹除的方式。
然后，在下室中加入染色剂，如甲洛红素或荧光染料，以可视化迁移的细胞。
在显微镜下观察和计数染色的细胞数量。
第四步：数据分析和结果解释通过Transwell小室实验可以获得一系列结果，如细胞的迁移率和侵袭性。
这些结果可以进一步用于研究细胞迁移和侵袭的受调控机制，以及发展和评价抗转移和抗侵袭的治疗策略。
Transwell小室简介和应用
应用
• 共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过， 因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳 酸酯膜，则应选择3.0um以下孔径。常用0.4、3.0um。将 细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或 代谢产生的物质对细胞A的影响。
• 趋化性实验：可用5.0、8.0、12.0um膜，上室细胞可穿过 聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室 成分对上室细胞的趋化能力。①细胞B对细胞A的趋化作用： 将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌 或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用 ②趋化因子对细胞 的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子， 可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
使用方法
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内 盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可 以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运 动等的影响。
• 肿瘤细胞迁移实验：常用8.0、12.0um膜，上室种肿瘤细 胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向 营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤 细胞的迁移能力。 • 肿瘤细胞侵袭实验：常用8.0、12.0um膜，原理与肿瘤细 胞迁移实验类似。不同点在于，侵袭实验会在小室的滤膜 上涂一层基质胶，增强细胞迁移的阻力，进一步确认肿瘤 细胞的侵袭能力。
Thank you！
Tra，其主要材料是Transwell小室，其外形为一个 可放置在孔板里的小杯子。其关键部分是杯子底层的通透性可支持物（滤 膜），而杯子其余部分的材料与普通的孔板（聚苯乙烯）是一样。滤膜有三 种材料：聚酯（PC）、聚碳酯（PET）和胶原包被的聚四氟乙烯（PTFE）。一 般常用的是聚碳酸酯膜，膜上的孔径大小范围是0.1－12.0um。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)迁移实验（cellmigrationassay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：摄影显微镜，Transwell细胞，孔径8μm。
Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板未涂有胶水（Coster和Corning也常用）。
细胞培养板应与购买的Transwell培养箱相匹配。
基质凝胶，无血清DMEM，（1%胎牛血清）DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可添加20%血清），无菌PBS，棉签，胰蛋白酶，4%聚甲醛固定溶液或甲醇，结晶紫染料（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和过程2.1基质铺胶板：用bd公司的matrigel1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被transwell 小室底部膜的上室面，置37℃30min使matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液① 在制备细胞悬浮液之前，可将细胞从血清饥饿状态下移除12-24小时，以进一步消除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用pbs洗1－2遍），用含bsa的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞① 取细胞悬液100μL加入Transwell培养箱。
②24孔板下室一般加入600μl含20?s的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
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不同实验中 transwell 小室的选择和使用
Transwell 小室在细胞实验中很常用，共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同。
根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为6 孔板小室、12 孔板小室和 24 孔板小室以及和 transwell 皿配套的 75 mm 直径的小室；根据孔径的不同，从小孔径到大孔径又分为0.4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。
小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，应该选择3μm 以下的孔径。
例如共培养实验和 caco-2 细胞转运模型实验。
共培养实验：常用 0.4、34μm，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的影响。
caco-2 细胞转运模型：选用0.44μm 膜，将Caco-2 细胞以约l×10个/mL，每孔 0.5 mL 的密度接种在 Transwell 内培养 21d 左右，前 1 周隔天换液，1 周后每天换液。
在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求。
涉及到细胞迁移的实验：要用 5.0、8.0、12.0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。
趋化性实验：细胞 B 对细胞 A 的趋化作用，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用，将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
细胞迁移实验：常用 8.0、12.0μm 膜，上室种细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。
细胞侵袭实验：常用8.0、12.0μm 膜，原理与细胞迁移实验类似。
上室
种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，但与细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。
计数进入下室的细胞量可反映细胞的侵袭能力。