酶分子的化学修饰
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原酶PPL和修饰酶PA-PPL在20 ℃下存放时，酶活性的变化很小， 而在30 ℃下存放时酶活性明显降低，在40℃和50℃下存放时， 酶活性迅速降低．40℃ 时PA-PPL的半哀期为95min，较PPL的半 衰期延长了20min；50 ℃PA-PPL的半衰期为48 min，较PPL的半 衰期延长了1倍．可见原酶PPL经PA修饰后热稳定性也明显提高
实验步骤：脂肪酶PPL的PA修饰→PA.PPL修饰度 的测定→脂肪酶水解活性的测定→酶的pH稳定 性和热稳定性测定 细节注意：1.修饰度测定采用三硝基苯磺酸分光 光度法测定（确定酶已修饰） 2.酶活采用橄榄油乳化液法测 定．在40℃、pH 7.0的条件下，将每分钟从橄 榄油中释放1 umol脂肪酸的酶量定义为一个酶 活性单位(U）。
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
2）保护酶活性部位与抗抑制剂 部 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空 间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖” 了酶的活性部位。
3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
烷基化反应
酰基化反应
氧化还原反应
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
芳香环取代反应
试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
碘代： I 2＋ + HI
硝化： •(NO2)4C +
（四硝基甲烷）
+(NO2)3CH
三、研究进展
结论
脂肪酶经PA修饰前后，酶催化水解的最适反应 pH和最适反应温度均未发生改变，说明小分子 化学修饰反应温和，对酶分子活性区域的构象 影响不严重。 采用PA修饰脂肪酶PPL能有效提高酶的水解活 性、酸碱稳定性及热稳定性。
附：参考文献
王颖达，郭丽，钱世钧等；多聚唾液酸对L-天冬酰胺酶的修饰及修饰酶特 性研究[J] ；生物工程学报；2000-07,16(4)：517-520. 武忠亮, 郭亚利,唐云明; 烟草叶片蔗糖酶的化学修饰[J];西南师范大学学 报(自然科学版);2006-08,31(4):148-152. 齐敬总,王风山,张鸿伟等；低分子肝素修饰超氧化物歧化酶及修饰酶的理 化性质研究[J]；中国药学杂志；2006-01,41（2）：150-153. 江宁，刘吉全，左右田健次；脱卤酶化学修饰的研究[J];生物工程学报； 1994,12(3):318-321. 赵玮,袁均林,杨旭等；吐温修饰脂肪酶的研究[J];2005,10:14-16. 熊亚红,苏健鸿,刘小平;邻苯二甲酸酐修饰脂肪酶的性能研究[J];华南农业 大学学报;2011-04,32(2):122-124. 郭勇;酶改性技术研究[J];华南理工大学学报( 自然科版);200710,35(10):143-146.
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
实验结果分析： PA-PPL的pH稳定性——
在pH 5．0或6．0的条件下放置1 h，原酶PPL基本上失 去了活性，而修饰酶PA-PPL|失去了大部分活性，缓冲 液pH为7.0和8.0时，PPL 和PA-PPL的活性随时间变化 非常小，这说明它们的最佳存放pH是7.0-8.0。
实验结果分析： PA-PPL的热稳定性——
5、辅因子引入
Sinha等采用固相合成技术对核糖核酸酶S 的C-肽 的残基Phe8，用一种人工合成的氨基酸进行取代，其 中吡哆胺磷酸作为辅因子。这种辅因子导入的方法比 通常的修饰反应速度提高了70%。
酶化学修饰的应用 ——脂肪酶的化学修饰
脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，为了提高 脂肪酶在有机相中的催化活性、稳定性、溶解性及反 应选择性等，人们采用多种方法对脂肪酶的分子结构 进行了改造，其中化学修饰是提高和改善酶催化性能 的有效方法之一。 酶修饰的机制：脂肪酶分子中的赖氨酸残基末端的εNH2，由于具有较强的亲核性，使得ε-NH2成为化学修 饰的首选官能团. 邻苯二甲酸酐(PA)作为Lys的专一性 修饰剂,对脂肪酶侧链基团进行修饰,可引起副键的改 变，使酶分子空间结构发生某些改变，从而引起酶的 特性和功能的改变。 属于化学修饰方法中的酶蛋白侧链基团的修饰
3、小分子修饰
蛋白质表面的一半基团由非极性氨基酸利用小分 子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团 进行化学修饰，对酶的表面进行改造———改善酶的 分散性；提高酶的表面活性；使酶的表面产生新的物 理、化学、机械性能及新功能；改善酶与其它物质的
相容性。
4、单功能聚合物化学修饰
最近研究发现，一种比PEG 更好的修饰剂非离子型 两性聚氧乙烯十二烷基醚（Brij35）
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
一、概述 二、原理、方法及修饰剂 三、研究进展
四、应用
Βιβλιοθήκη Baidu
一、概述
1、酶化学修饰（ chemical modification ）： 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价 结构发生改变，是在酶分子一级结构水平上 的改造。 酶选择性化学修饰：
描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
一、概述
2、酶分子化学修饰的目的 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半 衰期）。 3）降低或消除抗原性（针对特异性反应 降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体 结合
b. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分 子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的 极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。
2. 修饰剂及修饰反应
修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝 素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
a. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解 酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键 免遭破坏。
b. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，
减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 a. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂 形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
实验步骤：脂肪酶PPL的PA修饰→PA.PPL修饰度 的测定→脂肪酶水解活性的测定→酶的pH稳定 性和热稳定性测定 细节注意：1.修饰度测定采用三硝基苯磺酸分光 光度法测定（确定酶已修饰） 2.酶活采用橄榄油乳化液法测 定．在40℃、pH 7.0的条件下，将每分钟从橄 榄油中释放1 umol脂肪酸的酶量定义为一个酶 活性单位(U）。
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
2）保护酶活性部位与抗抑制剂 部 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空 间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖” 了酶的活性部位。
3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
烷基化反应
酰基化反应
氧化还原反应
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
芳香环取代反应
试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
碘代： I 2＋ + HI
硝化： •(NO2)4C +
（四硝基甲烷）
+(NO2)3CH
三、研究进展
结论
脂肪酶经PA修饰前后，酶催化水解的最适反应 pH和最适反应温度均未发生改变，说明小分子 化学修饰反应温和，对酶分子活性区域的构象 影响不严重。 采用PA修饰脂肪酶PPL能有效提高酶的水解活 性、酸碱稳定性及热稳定性。
附：参考文献
王颖达，郭丽，钱世钧等；多聚唾液酸对L-天冬酰胺酶的修饰及修饰酶特 性研究[J] ；生物工程学报；2000-07,16(4)：517-520. 武忠亮, 郭亚利,唐云明; 烟草叶片蔗糖酶的化学修饰[J];西南师范大学学 报(自然科学版);2006-08,31(4):148-152. 齐敬总,王风山,张鸿伟等；低分子肝素修饰超氧化物歧化酶及修饰酶的理 化性质研究[J]；中国药学杂志；2006-01,41（2）：150-153. 江宁，刘吉全，左右田健次；脱卤酶化学修饰的研究[J];生物工程学报； 1994,12(3):318-321. 赵玮,袁均林,杨旭等；吐温修饰脂肪酶的研究[J];2005,10:14-16. 熊亚红,苏健鸿,刘小平;邻苯二甲酸酐修饰脂肪酶的性能研究[J];华南农业 大学学报;2011-04,32(2):122-124. 郭勇;酶改性技术研究[J];华南理工大学学报( 自然科版);200710,35(10):143-146.
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
实验结果分析： PA-PPL的pH稳定性——
在pH 5．0或6．0的条件下放置1 h，原酶PPL基本上失 去了活性，而修饰酶PA-PPL|失去了大部分活性，缓冲 液pH为7.0和8.0时，PPL 和PA-PPL的活性随时间变化 非常小，这说明它们的最佳存放pH是7.0-8.0。
实验结果分析： PA-PPL的热稳定性——
5、辅因子引入
Sinha等采用固相合成技术对核糖核酸酶S 的C-肽 的残基Phe8，用一种人工合成的氨基酸进行取代，其 中吡哆胺磷酸作为辅因子。这种辅因子导入的方法比 通常的修饰反应速度提高了70%。
酶化学修饰的应用 ——脂肪酶的化学修饰
脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，为了提高 脂肪酶在有机相中的催化活性、稳定性、溶解性及反 应选择性等，人们采用多种方法对脂肪酶的分子结构 进行了改造，其中化学修饰是提高和改善酶催化性能 的有效方法之一。 酶修饰的机制：脂肪酶分子中的赖氨酸残基末端的εNH2，由于具有较强的亲核性，使得ε-NH2成为化学修 饰的首选官能团. 邻苯二甲酸酐(PA)作为Lys的专一性 修饰剂,对脂肪酶侧链基团进行修饰,可引起副键的改 变，使酶分子空间结构发生某些改变，从而引起酶的 特性和功能的改变。 属于化学修饰方法中的酶蛋白侧链基团的修饰
3、小分子修饰
蛋白质表面的一半基团由非极性氨基酸利用小分 子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团 进行化学修饰，对酶的表面进行改造———改善酶的 分散性；提高酶的表面活性；使酶的表面产生新的物 理、化学、机械性能及新功能；改善酶与其它物质的
相容性。
4、单功能聚合物化学修饰
最近研究发现，一种比PEG 更好的修饰剂非离子型 两性聚氧乙烯十二烷基醚（Brij35）
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
一、概述 二、原理、方法及修饰剂 三、研究进展
四、应用
Βιβλιοθήκη Baidu
一、概述
1、酶化学修饰（ chemical modification ）： 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价 结构发生改变，是在酶分子一级结构水平上 的改造。 酶选择性化学修饰：
描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
一、概述
2、酶分子化学修饰的目的 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半 衰期）。 3）降低或消除抗原性（针对特异性反应 降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体 结合
b. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分 子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的 极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。
2. 修饰剂及修饰反应
修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝 素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
a. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解 酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键 免遭破坏。
b. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，
减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 a. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂 形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除