分子克隆技术实验讲义2016.3(最终版)

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分子克隆技术实验讲义

黑龙江大学生命科学学院

2016年3月

甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定

一、实验目的

1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。

2、学习和掌握质粒、T载体的特点。

3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。

4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。

5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。

6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。

7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。

8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。

二、相关知识

（一）T载体的制备

pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了Eco RⅤ识别位点，用Eco RⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。

（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）

把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。

相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。

（三）大肠杆菌感受态细胞的制备

外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。

相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。

（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定

将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降

解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组DNA 分子。

所谓的重组子（recombinant）也叫做转化子（transformant）是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中（如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段）分离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选（screening）。根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。