双荧光素酶检测原理和方法总结

miRNA靶基因验证

实验原理：

哺乳动物中不含内源性荧光素酶，转录完成后生成有功能性的荧光素酶，其光产物具有交到的量子效率，检测灵敏度高，已被广泛应用于miRNA靶基因检测。

一般截取mRNA 3’UTR（野生型、突变型）区域100bp 长度构建到荧光素酶质粒上

实验方法：

1.质粒构建

预测mRNA与miRNA的结合位点后，截取结合位点前后100bp长度构建到pmirGLO 载体上，同时构建结合区域突变载体，如：pmirGLO-mRNA-3’UTR、pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR

2.合成miRNA mimics 及NC对照；

3.细胞转染, 细胞分组：（1）pmirGLO-mRNA-3’UTR + miRNA mimics

（2）pmirGLO-mRNA-3’UTR + miRNA mimics NC

（3）pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR + miRNA mimics

（4）pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR + miRNA mimics NC

4.化学发光检测细胞Luciferase表达活性；

5.数据分析。

操作流程：

1、细胞培养和转染

1)将指数期细胞传到孔板中，转染时细胞密度约为70%；

2)根据转染的孔的大小，按照一定比例混匀质粒；

3)取一个新的1.5ml离心管，加入lipofectamine 2000和Opti-MEM，轻轻混匀后室

温静置5min；

4)将4中的混合液加入3的EP管中，混匀；

5)室温静置20min，将lipofectamine 2000-质粒混合液滴到孔板中；

6)4h后换回含血清的完全培养基。

2、Luciferase活性检测

1)取出细胞，室温下吸去培养基，1xPBS洗一遍，每孔加入100ul 1×passive lysis

buffer。

2)把孔板放在摇床上摇15min，转移到EP管中用于后续实验或储存。

3)准备好底物，将LAR II 从-80℃中取出解冻；Stop and Glo：把50×Stop and Glo

substrate 用Stop and Glo buffer 配成1×；避光放置。

4)把细胞裂解液转移到标记好EP管中，瞬时离心；

5)标记好测量管，每管加入适量细胞裂解液；

6)按说明书设置程序；

7)每测量管加入100ul LAR II溶液，快速混匀，测量；

8)每测量管加入100ul Stop and Glo溶液，快速混匀，测量；

9)整理数据。

试剂：

1)Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent

2)Dual-Luciferase® Reporter Assay System

3)PBS缓冲液

4)培养基（GIBCO）