烟草瞬时表达
烟草瞬时表达步骤 电子版
亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀•4℃，13000prm离心15min.•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
烟草瞬时表达
烟草瞬时表达
（1）挑起单个农杆菌菌落，接种到3ml LB液体培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜。
（2）将上述过夜培养菌液在常温，4000r下离心2min，收集菌体。
（3）用渗透培养液( 10 mmol MgCl2 )重新悬浮沉淀的农杆菌细胞（一般需要1~1.5mL渗透培养液）。
调节浓度OD600至0.5~1.0 (可大概估计)。
（4）烟草植株无一定大小要求，一般4~5叶期，已经生长一个月左右的本氏烟比较合适，注射前要充分吸水30min使其气孔张开，然后用1mL的无针头的注射器吸取悬浮有农杆菌的渗透培养液从烟叶背面注入叶片内。
（5）将处理过的烟草放回培养室，照常管理。
（6）制片，观察叶背面荧光表达情况。
[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法
![[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法](https://img.taocdn.com/s3/m/e8c47eb56f1aff00bfd51e41.png)
[植物科学领域]利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法Method for transient expression in vivo by infecting tobacco with Agrobacterium一、原理（Principle）烟草叶片的瞬时表达系统常用来进行基因的亚细胞定位监测，监测蛋白在细胞中分布的位置，从而对其功能进行预测。
通过基因翻译的蛋白与绿色荧光蛋白构成融合蛋白，在激光共聚焦仪器下观测绿色荧光的分布，判断蛋白表达的部位。
同时，还可根据荧光的光强度检测蛋白的表达量。
该过程是经根癌农杆菌介导的，进而将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
Tobacco leaf transient expression systems are often used to monitor the subcellular localization of genes, monitor the distribution of proteins in cells, and predict their function. The gene translated protein and green fluorescent protein constitute a fusion protein. The distribution of green fluorescence is observed under a laser confocal instrument to determine the protein expression site. At the same time, the expression level of the protein can also be detected based on the light intensity of the fluorescence. This process is mediated by Agrobacterium tumefaciens, which integrates the gene of interest into tobacco cells.二、材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. MES: 2-(N-吗啉代)乙磺酸6. 抗生素7. 注射器Materials and reagents1. Agrobacterium strain carrying an expression vector (usually the expression vector is driven by the 35S promoter)2. Tobacco plants for 2-4 weeks3.LB medium4.Acetosyringone5.MES: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid6.Antibiotics7. syringe三、仪器1. 50 ml 离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜Third, the instrument1. 50 ml centrifuge tube2. spectrometer3. UV lamp4. fluorescence microscope四、步骤1. 挑取单克隆于5 ml LB液体培养中，28~30°C震荡培养。
农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究_孙蔓莉 (1)
ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１５．０１．０２８
网 络 出 版 日 期 ：２０１５－０１－２０ 网 络 出 版 地 址 ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１２２０．Ｓ．２０１５０１２０．０９２０．００３．ｈｔｍｌ
植物通过２种防御机制响应病原菌的侵染， 一种是识别并响应病原菌特征分子或微生物特征 分子，另一种是直 接 或 间 接 地 响 应 病 原 菌 效 应 因 子 。 ［１２］ 前人在 研 究 亚 麻 对 亚 麻 锈 菌 抗 病 性 的 基 础上，提出 基 因 对 基 因 模 型［１３］，即 当 有 一 对 抗 病 基因和无毒基因 存 在 的 情 况 下，就 可 以 引 发 过 敏 性坏 死 反 应 （Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＨＲ），马 铃薯晚疫病抗病基因 ＲＢ 和致病疫霉菌效应基因 Ａｖｒｂｌｂ １ 互作可引发 ＨＲ［１４］。本研 究 利 用 ＲＢ 和 Ａｖｒｂｌｂ １ 为 报 告 基 因，ＧＵＳ 基 因 为 空 白 对 照，以 本氏烟和６个普 通 烟 草 品 种 为 材 料，采 用 农 杆 菌 介导的注射渗透 法，分 析 烟 草 的 基 因 瞬 时 表 达 的 最佳条件。
本研究分析菌悬液od600值遗传背景烟草品种及其生长时期并对根癌农杆菌介导的烟草基因瞬时表达影响因素进行分析确认od60006和08时agl1gv3101和c58c1农杆菌菌系在本氏烟上介导的瞬时表达rb和avrblb1的效率较高且一致表现在烟草叶片均出现明显的坏死斑对照gus基因未出现坏死现象注射不含菌液成分溶液即注射重悬液mes后不表现任何反应
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。
可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。
二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。
但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。
用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。
为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。
三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。
使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。
2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。
烟草瞬时转化之欧阳文创编
本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、二、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.710nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会。
烟草瞬时表达原理
烟草瞬时表达原理烟草瞬时表达原理是指烟草植株在生长发育过程中，通过信号传导途径，调控基因表达和代谢途径，从而快速响应外界环境变化，实现瞬时适应和生存优势的一种生理机制。
烟草植株在面对环境胁迫、病虫害和营养物质供应等外界压力时，能够快速调整生长发育和代谢途径，以适应环境变化，保证植株的生存和繁衍。
烟草瞬时表达原理的核心是信号传导途径。
烟草植株通过感知外界环境信号，如光照、温度、湿度、营养物质浓度等，启动内部信号传导途径，进而调控基因表达和代谢途径。
这一过程涉及多种信号分子和信号通路的参与，包括激素信号、离子信号、氧化还原信号等。
这些信号分子在植物体内形成复杂的信号网络，通过相互作用和调控，最终影响基因表达和代谢途径的调控。
烟草瞬时表达原理的实现依赖于基因表达和代谢途径的调控。
烟草植株在面对外界环境变化时，会启动特定的基因表达途径，调控相关基因的表达水平，以实现对环境的快速适应。
同时，烟草植株还会调整代谢途径，重新分配营养物质和能量，以满足生长发育和抵御外界压力的需要。
这些调控过程涉及到多种基因和代谢产物的参与，形成复杂的调控网络。
烟草瞬时表达原理的研究对于揭示植物生理机制、改良烟草品种、提高烟草产量和质量具有重要意义。
通过深入研究烟草瞬时表达原理，可以发掘植物在面对环境胁迫时的生理适应机制，为培育抗逆烟草品种提供理论依据和实践指导。
同时，还可以通过调控烟草瞬时表达原理，提高烟草产量和品质，促进烟草产业的可持续发展。
总之，烟草瞬时表达原理是烟草植株在面对外界环境变化时的一种生理适应机制，涉及信号传导途径、基因表达和代谢途径的调控。
通过深入研究和理解烟草瞬时表达原理，可以为烟草品种改良和产业发展提供重要的理论和实践支持。
不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性
列 的１ ． ５ 倍： Ｕ ｂ ｉ ． Ｕ ４ ． Ｃ ａ Ｍ Ｖ ３ ５ Ｓ 复合启动 子附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列驱动 ＧＵ Ｓ 基因表达水平 最高 ， 其表 达效 率是双Ｃ ａ Ｍ Ｖ ３ ５ Ｓ 启动子 附
￣Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列调控 下 ＧＵＳ 表达效率 的３ 倍， 为Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ 独 立作用 时的 １ ０ 倍。
维普资讯
植 物学通报 Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｂ ｕ ｌ ｌ ｅ ｔ ｉ ｎ ｏ ｆ Ｂ ｏ ｔ ａ ｎ ｙ ２ ０ ０ ７ ， ２ ４（ ４ ） ： ４ ５ ２ － ４ ５ ８ ， ｗ ｗ ｗ ・ ｃ ｈ ｉ ｎ ｂ ｕ ｌ ｌ ｂ ｏ ｔ ａ ｎ ｙ ・ ｃ ｏ ｍ
通过 叶盘转化法转 化烟草 叶片， 检测 瞬时表达 活性 ， 研 究不 同调控序列 对外源基 因表达 的调控 作用 。结 果表 明： Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ 启 动子 附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列后使 ＧＵ Ｓ 活性 比独立使 用Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ提高 了近２ 倍： ￣Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ 启 动子附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列 驱动 ＧＵＳ 基 因的 表达 活性与单 Ｃ ａ ＭＶ ３ ５ Ｓ附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序 列相当 ： 烟草 泛素启动 子附￣ Ｈ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列 的表达活性 为Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ 启 动子 附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序
在烟草中瞬时表达迷迭香酸的研究
在烟草中瞬时表达迷迭香酸的研究梁童瑶;邢丙聪;张治海;麻鹏达;梁宗锁;韩蕊莲【摘要】遗传转化一直以来都是研究药用植物次生代谢物调控的重要手段,虽然具有重现性好的优势,但获得稳定转化的毛状根体系或转基因植株往往费时费力,该方法无法满足大批量药用植物次生代谢调控相关基因的研究需求.农杆菌介导的瞬时转化以其易操作、低成本、短周期的优势,已被广泛应用于植物功能基因的研究中.然而目前药用植物的功能基因研究还常使用稳定遗传转化,或一些高成本、高难度的瞬时转化方法(如基因枪、原生质体转化等).因此,本研究利用pEAQ载体在本氏烟草叶片中高效表达了一个或多个外源基因,这将为外源基因在烟草中快速有效的表达提供新途径,也为进一步探究其功能提供了一条思路.多个外源基因的高效共表达也为在本氏烟草中异源构建次生代谢途径提供了可能.【期刊名称】《西北林学院学报》【年(卷),期】2017(032)001【总页数】5页(P179-183)【关键词】瞬时转化;烟草;pEAQ;异源代谢;迷迭香酸【作者】梁童瑶;邢丙聪;张治海;麻鹏达;梁宗锁;韩蕊莲【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨陵712100;中国科学院水利部水土保持研究所,陕西杨陵712100;陕西省安塞县果业发展局,陕西安塞717499;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨陵712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨陵712100;中国科学院水利部水土保持研究所,陕西杨陵712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨陵712100;中国科学院水利部水土保持研究所,陕西杨陵712100【正文语种】中文【中图分类】S572瞬时转化系统已经成为可以替代稳定转化的一种手段[1]。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)是植物遗传转化的常用工具，因其具有低成本、易操作、成功率高的优点，已应用于包括基因表达检测、基因沉默、亚细胞定位、蛋白互作分析、抑制子功能鉴定等多种研究当中[2]。
烟草基因相互作用实验步骤
瞬时表达本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。
1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。
注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。
需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。
2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。
挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。
3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：0.5M MES 1ml20mM Na3PO4 1mlD-葡萄糖50mg1M 乙酰丁香酮1ul水（一般情况下最先加入）补齐至10ml注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。
乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。
注射缓冲液需要现配现用。
4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。
注射缓冲液重悬。
5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。
利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。
注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。
利用烟草瞬时表达系统高效表达禽流感Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的方法[发明专利]
![利用烟草瞬时表达系统高效表达禽流感Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/487d70110242a8956aece43c.png)
专利名称：利用烟草瞬时表达系统高效表达禽流感Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的方法
专利类型：发明专利
发明人：谭小力,王秋叶,侯继波,王政,张志燕,陈克平,唐应华,郑香峰
申请号：CN201210075997.8
申请日：20120321
公开号：CN102643837A
公开日：
20120822
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于基因工程和蛋白质表达领域，涉及一种利用烟草瞬时表达系统表达禽流感病毒血凝素（HA）基因。
所述的Re-5疫苗株血凝素（HA）基因，序列如SEQIDNO.1所示。
通过基因工程方法，该基因在烟草叶片中表达。
发现HA主要在烟草的细胞间隙表达，三个含目的基因的构建都能表达Re-5疫苗株血凝素（HA）基因，Kozak-HA-6×His-pB2GW7.0(DelateBar)表达载体Re-5疫苗株血凝素（HA）基因的表达量最高。
本发明还发现烟草注射Kozak-HA-6×His-
pB2GW7.0(DelateBar)表达载体后，Re-5疫苗株血凝素（HA）基因在第六天表达量最高。
申请人：江苏大学
地址：212013 江苏省镇江市学府路301号
国籍：CN
代理机构：南京知识律师事务所
代理人：卢亚丽
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烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花[发明专利]
![烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/5a6261ff964bcf84b8d57b13.png)
专利名称：烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花
专利类型：发明专利
发明人：高玉龙,谢贺,肖炳光,李永平
申请号：CN201210462131.2
申请日：20121116
公开号：CN103045609A
公开日：
20130417
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，具体涉及烟草FT(Flowering locus T)基因NtFT1及其在诱导烟草早花中的应用，属于分子生物学中的基因领域。
本发明公开了源自烟草的控制植物开花时间的NtFT1基因全长编码序列及其编码的蛋白序列。
NtFT1基因是通过同源序列搜索，从中国烟草基因组测序计划数据中经Blastn比对及剪切位点分析得到的。
以此序列涉及出一对NtFT1基因特异引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了该基因。
本发明还构建了NtFT1基因的PVX病毒表达载体，构建的病毒表达载体经农杆菌渗滤侵染烤烟品种红花大金元、云烟87和K326，能诱导这些品种早花，证明该基因具有诱导烤烟早花的功能。
将NtFT1基因的PVX 病毒瞬时表达系统用于烟草育种，可缩短烟草生育期、加快育成烟草新品种的年限。
申请人：云南省烟草农业科学研究院
地址：653100 云南省玉溪市红塔区南祥路14号
国籍：CN
代理机构：昆明今威专利商标代理有限公司
代理人：赛晓刚
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烟草瞬时表达实验原理
烟草瞬时表达实验原理利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。
在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。
BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。
如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。
试剂：500 mM MES (pH5.6)、100 mM MgCl2、100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、LB 培养基、50 mg/mL Kana (母液)、25 mg/mL Rif (母液)、100 mg/mL Amp (母液)。
仪器：一次性注射器、恒温摇床、分光光度计、普通离心机、激光共聚焦显微镜。
配方：500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。
100 mM 乙酰丁香酮：称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
烟草瞬时转化
-----WORD格式--可编辑--专业资料-----本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.7 10nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
烟草瞬时表达步骤 电子版
亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀•4℃，13000prm离心15min.•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
烟草瞬时表达人表皮细胞生长因子(hEGF)
烟草瞬时表达人表皮细胞生长因子(hEGF)薛萍;柳月英;付宏岐;于欣;董健伟;刘秀明;官丽莉【摘要】构建人表皮细胞生长因子(hEGF)病毒表达载体,为实现hEGF在烟草中瞬时表达提供理论和实验依据.PCR扩增获得hEGF基因,将其连接到马铃薯病毒表达载体pGR107上,利用农杆菌介导法感染烟草叶片,对其进行转录水平和翻译水平检测.根据GFP的表达确定收获hEGF时间为病毒侵染叶片后第7天;RT-PCR检测的结果表明hEGF基因在转录水平有表达;Western blotting、ELISA和MTT结果表明感染烟草叶片中有hEGF蛋白表达,表达量为总可溶蛋白的0.0103%,且具有生物活性.【期刊名称】《陕西农业科学》【年(卷),期】2016(062)002【总页数】5页(P20-24)【关键词】烟草;瞬时表达;人表皮生长因子(hEGF)【作者】薛萍;柳月英;付宏岐;于欣;董健伟;刘秀明;官丽莉【作者单位】渭南职业技术学院食品检测中心,陕西渭南 714000;吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118;吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118;渭南职业技术学院食品检测中心,陕西渭南 714000;东北师范大学附属中学,吉林长春 130028;渭南职业技术学院食品检测中心,陕西渭南 714000;吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118;吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118【正文语种】中文表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)于1962年首次在小鼠的颌下腺中发现的一种小分子多肽[1]，在人体内广泛存在，由53个氨基酸残基组成，相对分子量为6.045Da，它具有促进多种上皮细胞的分裂增殖和血管生成的生物活性，临床上用于创伤、溃疡、神经损伤、新生儿呼吸窘迫综合症[2]等治疗。