抗氧化活性研究方法课件
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性 (antioxidant activity)描述了化学物质在抑制或减少氧化反应中所起的作用。
抗氧化物是一类具有亲电子的分子，它们容易被氧化，从而中和自由基。
抗氧化物具有重要的生物学和医学意义，因为氧化损害是许多疾病和老化的主要原因。
因此，抗氧化物活性测定方法是目前研究的热点之一，现将抗氧化物活性测定方法进行总结:1. DPPH法：该方法是一种常用的体外抗氧化测定方法。
含有DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）的溶液表现为紫色，DPPH自由基上的氢原子被抗氧化物夺取后，DPPH自由基变成无色，从而可以通过紫外可见光谱测定其吸光度的降低来表示抗氧化物活性。
2. ABTS法：该法通过测定2,2’-联氮双(3-乙基苯并咪唑啉硫酸铵) (ABTS)自由基的消除能力来测定抗氧化活性。
该法也是一种体外抗氧化测定方法，溶液发生颜色变化，从而通过紫外可见光谱测定其吸光度的降低来表示抗氧化物活性。
3. ORAC法：ORAC（氧化还原能力值）法对不同化学物质的体内抗氧化活性进行定量测定，其原理是将抗氧化剂加入与有氧气气氛接触的荧光染料溶液中，由于受到氧自由基的攻击，染料随着时间流逝会逐渐减少。
为了确定不同化学物质的抗氧化活性，十分重要的是应该不断输入氧自由基。
4. FRAP法：铁还原能力 (FRAP) 方法测量样品对Fe3+的还原能力，其原理是将含有Fe3+的试液与抗氧化剂反应后，Fe3+被还原为Fe2+，测试Fe2+的含量即可评估抗氧化剂的抗氧化性能。
5. TBARS法：该方法是用于评估脂质过氧化物含量，从而推断抗氧化剂的能力。
该评估方法是通过测定细胞膜上的脂质过氧化产物（丙二醛）来分析抗氧化剂活性。
6. Total Phenolic Content (TPC)法：该方法最初是用来测定葡萄酒和咖啡中酚类化合物含量的。
后来发现大多数植物成分含有大量的酚类化合物，故也用于测定植物中的酚类含量。
(完整版)抗氧化试验方法
一、试验方法1、DPPH自由基清除率的测定本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。
1.1实验原理1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。
当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。
1.2溶液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。
1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。
按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。
2、总的抗氧化活性的测定总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。
2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。
抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。
此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结引言：抗氧化物活性测定在食品、医药、化妆品以及生命科学等领域具有重要应用。
目前，常用的抗氧化物活性测定方法主要包括化学法、生物法和物理法。
本文将对这几种方法进行总结。
一、化学法1.1.DPPH自由基法该方法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、通过DPPH自由基与抗氧化物发生反应，使DPPH自由基得以还原为无色溶液，测定溶液的吸光度来评估抗氧化活性。
1.2.ABTS自由基法该方法通过生成具有特定吸光度的ABTS自由基，评估抗氧化物对自由基的清除能力。
与DPPH自由基法相比，ABTS自由基法具有更高的灵敏度和稳定性。
1.3.羟自由基清除法该方法利用特定的化学反应，测定样品对羟自由基的清除能力，评估其抗氧化活性。
该方法适用于抗氧化物活性测定和体外抗氧化活性评价。
1.4.过氧化物清除法该方法测定样品对过氧化物的清除能力，通过测定生成的不稳定的自由基产物的分解速率，评估抗氧化活性。
该方法适用于测定生物样品的抗氧化活性。
二、生物法2.1.脂质过氧化抑制能力测定法该方法通过测定样品对脂质过氧化的抑制能力，评估其抗氧化活性。
常用的指标包括丙二醛生成量、硫代巴比妥酸反应物（TBA）生成量等。
2.2.DNA损伤保护能力测定法该方法通过测定样品对DNA损伤的保护能力，评估其抗氧化活性。
常用的指标包括DNA链断裂率、碱基损伤率等。
2.3.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定法该方法测定样品中SOD的活性，评估其清除超氧自由基的能力。
常用的指标包括抑制率、相对酶活等。
2.4.过氧化氢酶（CAT）活性测定法该方法测定样品中CAT的活性，评估其清除过氧化氢的能力。
常用的指标包括催化剂浓度、酶单位等。
三、物理法3.1.相对电子自旋共振法该方法通过测定样品中的自由基产物的电子自旋共振信号的强度，评估抗氧化物的活性。
常用的指标包括g值、线宽等。
3.2.高温氧化法该方法利用样品在高温条件下的氧化反应，评估其抗氧化活性。
抗氧活性的测定
园艺科学研究方法——园艺植物育种研究Ⅱ抗氧活性的测定 一、实验目的：1、掌握FRAP 法测抗氧化活力的方法；2、常见水果、蔬菜的抗氧化能力比较。
二、实验原理：Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)三、仪器、耗材：离心机、离心管、离心管，移液器、分光光度计、水浴锅、塑料比色杯、试剂瓶，吸水纸，枪头、量筒、大研钵； 苹果、青椒、葡萄、胡萝卜、番茄、芒果。
四、实验内容：1.不同果、蔬抗氧化物质的提取用自来水、蒸馏水反复冲洗干净后，分离果肉称取1～5 g ，在研钵内按1：9比例加入蒸馏水，研磨成匀浆液，10 000 r ／min 离心10 min ，取上清按下述FRAP 法测定抗氧化活性，每份样品重复测定5次。
2.FRAP 测定方法操作Fe2+-TPTZ 样品中总抗氧化能力抗氧化剂antioxidant 593nm 测定取适量样品上清(必要时稀释)，加入FRAP试剂，混匀后37℃反应10 min，593 nm 测定吸光度，以1.0 mM FeSO4为标准．样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示。
（1）FRAP试剂准备100 ml醋酸缓冲液+ 10 ml TPTZ溶液+ 10 ml三氯化铁溶液+ 12 ml双蒸水，混匀，37℃保温。
（1）2 ml FRAP试剂+双蒸水1 ml，4 min后593 nm调零。
（2）2 ml FRAP试剂+100 ul 提取液+双蒸水900 ul，4 min后593nm 测量。
五、数据整理：三次重复的不同浓度Fe2+对应的吸光度Fe2+浓度（mM）吸光度(A) 平均值（A）第一次第二次第三次1.0 1.181 1.182 1.177 1.180 0.8 1.198 1.196 1.185 1.193 0.6 1.195 1.192 1.185 1.191 0.4 1.167 1.168 1.163 1.166 0.2 1.006 1.021 1.009 1.012 0.1 0.631 0.620 0.623 0.625 各种材料FRAP法抗氧化活性的测定重测量值一测量值二测量值三平均值（A) 抗氧化活性种类青椒 1.170 1.294 1.257 1.240 ＞1.00胡萝卜0.266 0.366 0.456 0.363 0.04苹果0.912 1.039 1.011 0.987 0.16葡萄0.739 0.703 0.729 0.724 0.12番茄 1.021 1.012 1.034 1.022 0.21芒果 1.071 1.069 1.067 1.069 0.23六、结果分析由表格得，胡萝卜的抗氧化活性最低，青椒的抗氧化活性最高。
艾叶中总黄酮的提取及其抗氧化活性研究
艾叶中总黄酮的提取及其抗氧化活性研究艾叶是常用的中药材之一，其具有多种药理活性，如抗氧化、抗肿瘤、治疗高血压等。
其中，艾叶中的总黄酮是一种重要的活性成分，具有较强的抗氧化活性。
因此，提取艾叶中的总黄酮，并研究其抗氧化活性，对于探索艾叶的药理作用具有重要意义。
一、艾叶中总黄酮的提取方法1. Sohxlet提取法将粉碎的艾叶样品放入芦笼中，加入乙醇和水的混合溶液，进行Sohxlet提取，直至提取液中没有可见的黄色物质为止。
然后进行浓缩和溶剂去除，得到艾叶总黄酮。
2. 超声波提取法将粉碎的艾叶样品放入贝克瓶中，加入乙醇和水的混合溶液，进行超声波提取，直至提取液中没有可见的黄色物质为止。
然后进行浓缩和溶剂去除，得到艾叶总黄酮。
二、艾叶中总黄酮的抗氧化活性研究方法1. DPPH自由基清除法将一定量的DPPH溶液与一定量的样品溶液混合，放置一段时间后，测量混合液的吸光度，并将其与DPPH自由基的吸光度进行比较，计算出样品对DPPH自由基的清除率，从而评估其抗氧化活性。
2. 过氧化氢清除法将一定量的过氧化氢溶液与一定量的样品溶液混合，放置一段时间后，测量混合液的吸光度，并将其与过氧化氢的吸光度进行比较，计算出样品对过氧化氢的清除率，从而评估其抗氧化活性。
三、艾叶中总黄酮的研究结果通过Sohxlet提取法和超声波提取法分别提取艾叶中的总黄酮，并将两种提取方法得到的总黄酮进行比较，结果表明超声波提取法的提取效率更高，提取得到的总黄酮含量也更高。
通过DPPH自由基清除法和过氧化氢清除法对艾叶总黄酮的抗氧化活性进行了研究，结果表明艾叶总黄酮具有较强的抗氧化活性，可以清除自由基并保护细胞免受氧化损伤。
综上所述，艾叶中的总黄酮是一种重要的抗氧化成分，具有良好的应用前景。
本研究通过比较不同提取方法和不同抗氧化活性测定方法，为深入探索艾叶的药理作用提供了一定的基础。
骨碎补中总黄酮的提取含量测定及抗氧化活性研究的答辩PPT课件
黄酮清除O2-·自由基能力的实验结果
28
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清除率 (%)
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18
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0.0
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0.4
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0.8
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图5 提取浓度与清除率的关系曲线
由图5可知：在实验浓度范围内，骨碎补中黄酮类化合物对清 除O﹣2·自由基的效果随黄酮浓度的增加而加强。
骨碎补中总黄酮的提取含量测定及抗氧化活性研究的答辩 PPT课件
黄酮清除·OH自由基能力的实验结果
20
18
16
清除率 (%)
14
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6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
图6 提取浓度与清除率的关系曲线
由图6可知：在一定的浓度范围内，骨碎补中黄酮类化合物对 清除·OH自由基的效果随黄酮浓度的增加而加强。
（3）测定黄酮对自由基的清除能力来研究骨碎补中 总黄酮抗氧化活性 。 并 且 骨碎补中黄酮类化合物 在浓度实的验增浓加度而范加围强内。清除O2-·、·OH效果都随黄酮
骨碎补中总黄酮的提取含量测定及抗氧化活性研究的答辩 PPT课件
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骨碎补中总黄酮的提取含量测定及抗氧化活性研究的答辩 PPT课件
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2.实验部分
黄酮的提取工艺
采用乙醇热回流法提取。 工艺流程：
骨碎补粉碎→过筛（40目）→石油醚脱酯→ 乙醇热回流提取→过滤→滤液浓缩→总黄酮提取 液
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抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
抗氧化活性测定方法
总黄酮测定方法仪器与设备：1.恒温混匀仪BG-200 (杭州朗基科学仪器有限公司)2.移液枪(p1000, p200)3.分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220日本岛津）4.15×150 mm 玻璃试管5.具塞玻璃试管, 10 mL6.容量瓶, 1000, 100, 10 mL7.紫外-可见分光光度计（UV-1800 日本岛津）试剂：1.硼氢化钠(成都市科隆化工试剂厂, NaBH4, FW 37.83, 粉末, 分析纯,≥97.0%) 避光干燥保存。
2.三氯化铝(天津博迪化工股份有限公司，AlCl3·6H2O, FW 165,分析纯，晶体, ≥99.0%)3.四氯苯醌(FW245.88,Aladdin Industrial Corporation 中国上海，FW245.88≥98%,分析纯)4.乙醇(EtOH) (成都市科隆化工试剂厂，FW46.07，无水乙醇, ≥99.7%,分析纯)5.四氢呋喃(THF) (广东广华科技股份有限公司，FW 72.11，≥99.0%,分析纯)6.冰乙酸(成都市科隆化工试剂厂, FW60.05, 99.8%,分析纯)7.盐酸(成都市科隆化工试剂厂,36.0%-37% w/v, 12 M,分析纯)8.槲皮素(国药集团化学试剂有限公司，FW302.24, ≥ 98%, 生化试剂BR)9.香兰素(天津博迪化工股份有限公司, FW152.15, ≥ 99.0%,分析纯)试剂配制：1.0.3, 0.5, 1.0,2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 mM 槲皮素溶液，溶剂为四氢呋喃：乙醇（THF:EtOH）=1:1。
配制10 mM 槲皮素标准溶液：准确称取151.12 mg槲皮素，用上述溶剂定溶至50mL容量瓶。
2.50.0 mM NaBH4乙醇溶液：称取189.2 mg NaBH4, 无水乙醇溶解，定容100mL容量瓶。
实验四 水果抗氧化活性的研究
实验四水果抗氧化活性的研究一、实验目的：通过用分光光度法测定常见水果所含有的抗氧化性物质的量并作比较，寻找当中较有助于抗衰老的水果种类，为大众通过食用水果抗衰老提供参考。
二、实验原理：（1）KMnO4具有强氧化性，能与还原性（即抗氧化性）物质反应，而各种水果汁中含有不等量的抗氧化物质，能与KMnO4反应。
通过测出KMnO4与各种0.10mL水果汁反应后吸光度A1，然后测0.40mL KMnO4标准溶液稀释至50mL，后的吸光度A3，后者的吸光度减去前者的吸光度，并将计算得出的吸光度代入线性方程y=a+bx (y为吸光度，x为KMnO4的质量)，求出KMnO4质量的变化值，即得出每0.10mL水果汁液消耗的KMnO4的量m1，消耗KMnO4越多，则代表该水果中所含的抗氧化性物质越多。
三、实验试剂：去离子水、KMnO4（AR）、Na2C2O4（AR）、H2SO4(3 mol/L)、纱布。
电炉、烧杯（250mL、100mL）、台式离心机、电子分析天平、722型分光光度计（比色皿）、移液管（1mL）、容量瓶（50mL）、锥形瓶（250mL）、量筒（50mL）、洗耳球，滤纸、温度计、棕色酸式滴定管（25mL）、电炉、试镜纸。
四、实验步骤：1、0.01mol/L KMnO4标准溶液的配制及标定将0.79g KMnO4置于大烧杯（500mL）中，加蒸馏水至500mL，煮沸约1小时，静置冷却后用漏斗过滤，滤液装入棕色细口瓶中，贴上标签，一周后标定,保存备用。
准确称取0.055～0.075 g基准物质草酸钠3份，分别置于250mL 的锥形瓶中，加约30mL水和3mol/L H2SO410mL，水浴慢慢加热到70～80℃（锥形瓶口出现水珠，逐份加热），趁热用KMnO4溶液滴定。
根据草酸钠的质量和消耗KMnO4溶液的体积计算KMnO4浓度，并用同样方法滴定其他2份草酸溶液。
2MnO4-+5C2O42-+16H+=2Mn2++10CO2+8H202、KMnO4溶液最大吸收波长的确定将已知浓度的KMnO4溶液放进722型分光光度计中，以蒸馏水作参比，从波长为400nm到610nm，测定KMnO4溶液的吸光度，取最大吸收波长。
常见体外抗氧化实验方法-抗氧化试验-抗氧化活性实验方法-抗氧化测定法-李熙灿Xican Li
常见体外抗氧化实验方法(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3①DPPH·自由基清除法 2 Array②ABTS·+自由基清除法 5③ FRAP法(铁还原法) 811④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自氧化法)⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23⑩抗氧化产物的预测26①DPPH·自由基清除法/DPPH法原理：DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。
当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。
实验操作[1]:1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。
该DPPH溶液避光保存，4h内用完。
（注意：如果是用分光光度计．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。
1.3 预试取DPPH溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
中草药抗氧化活性
丹参中的酚酸类化合物能够清除自由基，抑制脂 质过氧化，保护细胞膜和DNA免受氧化损伤。
3
丹参抗氧化活性的应用
丹参在防治心血管疾病、抗炎、抗肿瘤等方面具 有广泛应用，其抗氧化活性是发挥疗效的重要机 制之一。
案例二：灵芝抗氧化活性研究
灵芝的抗氧化活性成分
灵芝中含有多种抗氧化成分，如灵芝多糖、 灵芝三萜等，具有显著的抗氧化活性。
药成分的分解或活性的降低。
05 中草药抗氧化活 性应用与前景
中草药抗氧化在医学领域的应用
要点一
预防和治疗疾病
要点二
药物研发
中草药抗氧化活性成分具有强大的抗氧化作用，可以清除 体内的自由基，预防和治疗多种疾病，如癌症、心脏病、 中风等。
中草药抗氧化活性成分可以作为药物研发的灵感来源，帮 助科学家发现新的药物分子。
黄芩抗氧化活性的机制
黄芩中的黄芩苷和黄芩素能够清除自由基，抑制脂质过氧 化，保护细胞膜和DNA免受氧化损伤。
黄芩抗氧化活性的应用
黄芩在防治呼吸道感染、肝炎、糖尿病等疾病方面具有广 泛应用，其抗氧化活性是发挥疗效的重要机制之一。
THANKS
感谢观看
该方法广泛应用于中草药抗氧化活性的初步筛选，可快速评价中草药的抗氧化能力。
基于脂质过氧化抑制的评价方法
原理
许多疾病如癌症、心血管疾病等都与脂 质过氧化有关。中草药如果能够抑制脂 质过氧化，则具有抗氧化活性。该方法 通过测量脂质过氧化产物丙二醛的含量 来评价中草药的抗氧化活性。
VS
应用
该方法广泛应用于中草药抗氧化活性的初 步筛选，可快速评价中草药的抗氧化能力 。
抗氧化活性物质包括黄酮类、酚酸类、鞣质类、皂苷类、多 糖类等。
鱼肉抗氧化能力及活性成分之探讨课件.ppt
Antioxidant Properties from Enzymatic Hydrolysates of Tilapia. CHIA-NAN ANNUAL
BULLETIN, 35, 141-151.
9、Halliwell, B. a. G., J. M. C. (1984). Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition
8
魚肉游離胺基酸、胜肽組成及抗氧化效果
87.5％
9
抑制亞麻油酸自氧化
10
還原力試驗
11
螯合金屬離子
12
分析步驟
取吳郭魚肉250克以500克蒸餾水均質2分鐘，各添 加3種商業酵素(Protease A、Protease N、 Papain)1.25克在50℃下水解0、3、6、9個小時。
↓ 在水解完後添加沸水反應10分鐘使酵素失活。
2
飲食中添加抗氧化物質，可幫助還原氧化物質， 避免疾病的發生。(Wu, 2006)
魚類具有高量之肌肽（carnosine）和甲肌肽 （anserine）等雙胜肽類物質，已知與 pH 緩衝功 能能有關。(Johnson et al, 1989)
3
旗魚
旗魚(Xiphias gladius，swordfish)屬於大洋洄游性 魚類，廣布於世界各溫、熱帶海域，台灣周邊海 域亦可發現它的蹤跡，尤其是以東部黑潮暖流經 過的海域最多。 (曾等，2008)
傳統水產加工原料是以海洋魚業之魚貨物為主， 而旗魚在國內加工上常用於冷凍加工品、罐頭、 煉製品等。(蕭，2005)
oxidation in rat skeletal muscle. LIPIDS, 29(7), 461-466.
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。
因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。
直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。
下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。
1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。
（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。
实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。
b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。
c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。
d.使上述反应在37℃下进行10分钟。
e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。
f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。
（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。
实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。
b.分别加入适量的SOD样品。
c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。
d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。
2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。
（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。
实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。
讲座 抗氧化研究方法
10 October 2014
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第二节 化学与抗氧化研究
2.1 自由基的发生与检测 2.2 氧化损伤的检测
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2.2 自由基发生与检测实验模型
2.2.1 自由基发生体系 2.2.2 自由基的检测 2.23自由基的清除试验
10 October 2014
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2.2 自由基发生与检测实验模型
自由基与肺气肿
自由基与缺血后再灌注损伤
自由基与眼病
自由基与炎症
自由基与贫血
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氧自由基对人类的影响
自由基与疾病 自由基与免疫
自由基与衰老
自由基与营养
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研究发现机体中的一些过渡金属能加剧自由基 反应的进行，从而表现出一定的毒性。 Fe2+、Cu+参与Fenton反应； Pb2+、Co2+、Hg2+、Ni2+、Mo3+、Cd2+可增加细 胞的脂质过氧化，并进一步损伤组织。 另外，其它金属对环境的污染及和自由基的 关系也有一些报导。
H2O2+Fe2+
· OH-+OH-+Fe3+
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1.2
1.2.1 1.2.2
氧化损伤
自由基与氧化损伤 机体自由 基的形成
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1.2.1 自由基与氧化损伤
实际上所有的内源化合物都是毒物潜
在的靶标，然而毒理学上相关的靶标 是大分子，如核酸（特别是DNA）和 蛋白质。在小分子中，膜脂质最为常 见。
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VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲线
（相关系数）
反应时间t为30min的量效曲线
实验步骤
（2）一般方法——紫外分光光度计法 将样品用甲醇配制成一系列浓度，取0.1mL样品加入3.5 mL DPPH甲醇溶液 (0.06 mmol/L)，混合30min后测定515 nm处吸光度。每份样品平行操作3次。 计算公式为:清除率(％)=[A(溶剂)- A(样品)]/A（溶剂）x100％
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• 计算公式为:清除率(％)=[A(溶剂)- A(样品)]/A（溶剂）x100％
VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲线
30min
10-120min内,随着 作用时间的延长 VitE抗DPPH作用增 强，但在3.931.2μmol·L- 1范 围内，各时间点的 药效变化不明显， 62.5-500μmol·L-1 浓度范围，随着浓 度增加，各时间点 的药物作用曲线逐 渐分离，并在 500μmol·L-1，各 时间点量效趋于平 稳。从图中可以看 出，在这些时间点 中，30min的量效曲 线基本呈斜线上升 。
ABTS法优缺点
3.优缺点
简便，快速，适合于大量样品的检测。 ABTS在与氢原子供体的反应中选择性差是此法的一个不足，它可与任何羟 基化的芳香族化合物反应，这与它们的实际抗氧化能力关，因此,TEAC值也 包括对抗氧化不起作用的羟基。
六.TBARS法
简介
脂质体系中氧化反应抑制或中止的判断主要通过测量被氧化物的浓度，氧 的去除或氧化产物的形成。因此，反应物(不饱和脂肪酸，自由基等)的消失 ，氧化产物的定量可能是判断氧化阶段的最合适方法。通过直接或者间接检 测氧的消失和自由基的电子自旋光谱，适用于氧化过程的初始阶段。通常采 用TBARS法来评价脂质的过氧化.
二.自由基的产生及抗氧化的重要性
自由基对人体造成的伤害 抗氧化剂
天然植物
三.检测方法
• 目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于以下机理： • (1)在特定条件下，样品对检测体系中脂类物质的氧化抑制能力反映被测物
的抗氧化活性；（TBARS法） • (2)在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力反映被测物的抗氧
酶标法优势
3.酶标法优势
抗氧化微孔板实验方法的优势：①耗材量少，试剂量以微升计；②试剂种 类少，部分试剂配制可交互使用；③方法简便，耗时短；④可重复性强，可 以广泛应用于药物筛选，特别是高通量药物筛选研究。
五.ABTS法
1.原理
以水溶性的ABTS+自由基引发剂为显色剂。 特点：ABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝/绿色阳离子自 由基ABTS+，最大吸光波长为734nm。 向ABTS+其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分， 则该物质会与ABTS+发生反应而使反应体系褪色，然后在 ABTS+这种自由基的734nm吸光波长下检测吸光度的变化来 反映物质的抗氧化能力。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验步骤
2.实验步骤
• 将样品用甲醇配制成一系列浓度,取0.15mL样品加入2.85mLABTS自由基工作 液，混合，放置10min后,在734nm处测定吸光度。每份样品平行操作3次。
• 计算公式为：清除率(％)=[A(溶剂)- A(样品)] /A（溶剂）× 100％ • A2（.8溶5剂m）LA为BT2S.溶85液m与LA0B.T1S5溶mL液样与品0混.1合5m后L甲的醇吸混光合度后。的吸度，A（样品）为
化活性；（DPPH自由基的清除） • (3)在特定条件下，测定样品的还原能力反映被测物的抗氧化活性。（还原
Fe3+）
四.DPPH法
1.原理
DPPH(二苯代苦味酰基自由基) 是一种以氮为中心的稳定 自由基。 特点：醇溶液呈紫色，波长为517nm下具有最大吸收。 具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，有自由基 清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅， 在最大光吸收波长处的吸光值下降,吸光度水平的降低表 明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力 。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化 性越强。
七.铁离子还原能力(FRAP)
原理
FRAP的原理是基于氧化还原反应的比色法。在酸性条件下，Fe3+一 TPTA(Fe3+—三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成Fe2+一TPTZF，溶液变成深蓝色， 并且在593nm处有强吸收。FRAP法具有快速、简便、重复性好等优点。该法 不仅用于检测食物及饮料的抗氧化活性。也可用于检测纯天然抗氧化剂的活 性。
实验步骤
2.实验步骤
（1）酶标法检测——酶标仪 • 取96孔细胞培养板，各孔分别加入150μmol·L- 1的DPPH溶
液180μL,各浓度梯度样品溶液20μL,终浓度分别为3.9 ~500μmol·L- 1，反应总体积200μL,以溶剂作对照。加样 后，振荡混匀。封板胶封板后，室温下避光静置。分别在 10~120min时间范围内于517nm处测定各孔吸光度值。观察 样品抗DPPH的时效量效变化过程，确定实验的稳定性和最 佳实验反应时间。
抗氧化活性研究 方法
以酶标法清除DPPH自由基为主
目录 • 一.检测抗氧化活性的原因 • 二.自由基的产生及抗氧化的重要性 • 三.检测方法 • 四.DPPH法（原理，一般方法，酶标法） • 五.ABTS法 • 六.TBARS法 • 七.铁离子还原能力(FRAP)
一.检测抗氧化活性的原因
1.天然植物中许多化学物质具有抗氧化活性 2.抗氧化剂有延缓衰老等功效，越来越受到人们关注 3.据文献记齐墩果酸型三萜有较好的抗氧化活性 4.抗氧化活性测试简单，快捷，经济