几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较

【摘要】：蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常

用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford），Folin —酚试剂法（Lowry）杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高，比紫外吸收法灵敏10～20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以在本公司订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替，杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃），通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间

【关键词】：凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法

一、凯氏定氮法

1.1原理

凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。

1.2特点

凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。

凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。

二、双缩脲法(Biuret )

2.1原理

双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

2.2特点

双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响, 采用0.5 g 样品,40 mL 双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一,方法简便，但灵敏度差，测定范围为1～20 mg 蛋白质。适用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。

三、紫外吸收法

3.1原理

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280 nm 处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238 nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

3.2特点

最常用的紫外吸收法是280 nm 的光吸收法，含有核酸的蛋白质溶液使用280 和260 nm 的吸收差法较好。蛋白质的稀溶液采用215 与225 nm 的吸收差法。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。

缺点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸在紫外区也有强吸收，但通过校正可以消除。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。此外,进行紫外吸收法测定时, 由于蛋白质吸收高峰常因pH 的改变而有变化,因此要注意溶液的pH 值,测定样品时的pH 要与测定标准曲线的pH 相一致。

四、考马斯亮蓝法( Bradford)

4.1原理

Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm 变为595 nm, 蛋白质在1～1 000 μg 范围内, 蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。

4.2特点

考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合反应十分迅速而稳定,2 min 左右即达到平衡,其结合物室温下1 h内保持稳定，且在5～20 min 之间,颜色的稳定性最好。该法方法简便,易于操作,所用试剂较少,显色剂易于配制。干扰物质少,如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ- 球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer 定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。