组合生物合成
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二、聚酮类化合物
聚酮类化合物是由简单脂肪酸在聚酮合酶( Polyketide synthase, PKS) 催化下经过类似长链脂肪酸的合成途径生成的。 目前所发现的PKS可以归为三类: (1)Ⅰ型PKS也称为模块式 模块式PKS, 它由若干个多功能多肽组成, 每一个 模块式 多肽上都分别携带有独特的、非重复使用的催化结构域； (2)Ⅱ型PKS也称为迭代式 迭代式或芳香式PKS, 它是一个多酶复合体的迭代 迭代式 体系(至少包含KS 和ACP), 通过一套可重复使用的结构域在重复的反
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应步骤中多次用来催化酚聚酮结构的生成； (3) Ⅲ型PKS是可重复使用的同源双亚基蛋白, 属于查尔酮(chalcone) 合成酶类。 与前两类PKS 截然不同, 不依赖于ACP, 也不像前两类PKS 是通过ACP 活化酰基辅酶A的底物, 而是直接作用于酰基辅酶A活化 的简单羧酸。
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1、PKS模块或功能域的减少
运用组合生物合成方法对PKS 中某一个模块进行去除的操作中, 当 满足最后一个模块和具有环化功能的酶域可以识别非天然的中间 产物的前提时, 则减短后的PKS 仍然具有催化形成新的聚酮化合物 或其结构类似物的功能。如在红霉素生物合成途径中,分别将合 成红霉素PKS 原有的6 个模块减少至1 个、2 个、3 个或者5 个, 然 PKS 6 1 2 3 5 , 后将具有环化功能的硫酯酶(thioesterase, TE)结构域分别连于其后, 结果相应减短后的P K S 催化合成了二酮、三酮、四酮和六酮化合 物。这说明TE 具有广泛的底物特异性, 对聚酮体结构也有一定的 宽容性, 因此通过直接改变它的位置可以间接调整产生聚酮化合 物的链长度。
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3、Ⅲ型PKS
1999 年, Funa 等发现了一种类似苯基苯乙烯酮合成酶的PKS ( chalcone synthase-like PKS)———RppA,后来被称为Ⅲ 型PKS。 PKSⅢ的典型为查尔酮合成酶（chalconesyn-thaw，CHS）类， 是一种可重复使用的同源双亚基蛋白，在不需要ACP 的情 况下直接催化泛酞辅酶A 间的缩合，其主要负责单环或双 环芳香类聚酮化合物的生物合成，例如flavolin（淡黄霉 素）。与其他PKS 的最大差别在于直接以游离的丙二酸单 酞辅酶A 作底物，无论是PKSⅠ型或Ⅱ型均需要通过酞基转 移酶将丙二酸单酞辅酶A 或其衍生物转移至KS 上。
美国加州高新技术产业公司研制的埃波霉素(epothilone) 作为抗肿 瘤药物于2007年上市。霉素原来由纤维堆囊黏细菌产生, 其产量低, 繁殖时间长, 产品无法进行产业化生产。该公司利用基因组合技术 使纤维堆囊黏细菌的埃波霉素生物合成基因在链霉菌中得到表达, 并通过酰基转移酶功能域替换及羟基化酶基因的阻断, 获得了主要 产生埃波霉素中抗肿瘤活性最好组分的epothilone D 的基因工程菌。
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组合生物合成通过对天然产物代谢途径的遗传控制来生物 合成新型的复杂化合物： 一方面，特异性地遗传修饰天然产物的生物合成途径，以 遗传修饰 遗传修饰 此获得基因重组菌株，生产所需要的天然产物及其结构类 似物； 另一方面，将不同来源的天然产物生物合成基因进行重组 生物合成基因进行重组， 生物合成基因进行重组 在微生物体内建立组合的新型代谢途径，由此重组微生物 库所产生的新型天然产物构成了类似物库，有利于从中发 现和发展更具有应用价值的药物。
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acyltransferase (AT) , acyl carrier protein(ACP) , ketosynthase (KS) , dehydratase (DH), enoyl reductase(ER), and ketoreductase (KR)
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换、阻断、重组等)来改变生物合成途径产生新 的代谢旁路, 利用天然产物生物合成机制 利用天然产物生物合成机制获得大 量新的“非天然”天然产物的方法。
1985 年, Hopwood 教授在世界首次报道用遗传工程的手段合成 “非天然”的天然产物isochromanequinone, 为后来的组合生物合 成奠定了基础。这一领域成为天然产物代谢工程研究中最活跃的 领域, 许多微生物次级代谢研究的专家都加入这一领域的工作, 因 为组合生物合成有潜力制造出很多先导化合物。
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聚酮类(Polyketides)和非核糖体聚肽类(Non-Ribosomal Polypeptides)在天然产物中占了相当大的比例，如：
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2、Ⅱ型PKS
PKSⅡ又称迭代或芳香（iterative）类PKS，其主要合成芳香 族的化合物，如蒽环类及四环类化合物等。大部分PKSⅡ型 基因由编码最小单位PKS 的3 个阅读框架组成，即KS/AT、 ACP 和CLF（链长决定因子）。在生物合成芳香族化合物过 程中它们被重复使用，因此又称为迭代型PKS（iterative PKS）；此外还有KR、芳香化酶（aromatase）、环化酶 （cyclase）等的参与。属于PKSⅡ的聚酮化合物有放线紫红 素（actinorhodin，act）、四并菌素（tetracenomycinc， tcm） 和富伦菌素（frenolicin，fren）等。
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三、PKS的组合生物合成
聚酮化合物中碳链骨架的构成单位与催化其形成 的PKS 模块之间有着一一对应的关系。因此, 聚 酮化合物中骨架结构的改进( 如更改链长度、环 体系等)可以通过组合生物合成方法改变相应的 PKS模块来实现。此外, 利用异源单元可以增加聚 酮体的多样性, 这样的改变一般并不影响聚酮体 链的环化和PKS 的后修饰, 可以得到新的终产物。
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2. PKS中模块或功能域的增加
Rowe 等以合成红霉素和雷帕霉素的PKS 为研究对象, 首 次成功地实现了模块添加 模块添加的设想。方法是将合成雷帕霉 模块添加 素的PKS 中模块2 和模块5 分别插入到减短后的DEBS1-TE 的模块1 和模块2 之间, 结果得到了在相应位置多出一个 结构单位的四酮化合物(图1); 将合成雷帕霉素的PKS中模 块2和模块5分别插入到全长的合成红霉素的PKS 中模块1 和模块2之间, 结果得到了在相应位置多出一个结构单位 的十六元环的聚酮化合物。
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类似地, Kao 等将合成红霉素PKS 模块2 的KR 结构域 替换为合成西罗莫司PKS 模块1 的DH-ER-KR 结构域, 得到了一个新的八元环化合物。
Байду номын сангаас
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3、模块或功能域的替换
在红霉素D E B S 1 的N 端有一个称为荷载域(loading domain, LD)的 AT 和ACP 域。已知不同的LD 对底物的选择性不同, 利用LD对底物 的宽容性, 用异源替换原LD可以改变所接受的起始单元, 从而获得 新的聚酮化合物。Marsden 等用阿维菌素的LD 替换红霉素的LD, 在 构建的糖多孢红霉菌(Saccharopilyspora erythraea)突变体中, 产生了 以阿维菌素生物合成起始单位异丁酸和2-甲基丁酸为起始物的红 霉素衍生物, 添加不同的前体则可合成C-13位为异丙基、2- 丁基等 红霉素A、B 和D 衍生物。由于有许多支链羧酸可以成为阿维菌素 的前体, 因此利用阿维菌素LD 广泛的底物特异性可以获得多种红霉 素衍生物。
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组合生物合成
一、定义
组合生物合成 组合生物合成（Combinatorial Biosynthesis）： 生物合成 是在微生物次级代谢产物生物合成基因和酶 学基础上形成的, 通过对微生物代谢产物合成途 径中涉及到的一些酶的编码基因进行操作(如替 (
其生物合成是由PKS或NRPS蛋白催化、按照功能 结构域和催化模块的排列顺序来指导化学结构的 形成，编码这些酶（或结构域）的基因通常特征 性地成簇分布于染色体的某一区域而构成一个基 因簇。 这预示研究者们可以通过结构域和模块的功能重 排构建重组的PKS或NRPS蛋白，从而控制聚酮或 聚肽骨架结构的合成逻辑，以生产新型结构的 “非天然”天然聚酮或聚肽化合物。
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延伸完成的长链由硫酯酶（thioesterase，TE）功能域催化环化成红霉 素的前体6-脱氧红霉内酯B（6-deoxyerythronolide B,6-DEB)
Analogous enzymatic logic used by the AT domain in modular PKSs. The acyltransferase (AT) and acyl carrier protein(ACP) domains are present in all modules. The ketosynthase (KS) domain is present in all chain extension modules. The dehydratase (DH), enoyl reductase(ER), and ketoreductase (KR) domains are optional domains.
1、Ⅰ型PKS
Ⅰ型PKS 研究最为透彻, 主要由酮基合成酶(ketosynthase, KS) 、酰基 转移酶(acyltransferase, AT)、酰基载体蛋白(acyl-carrier protein, ACP)、 脱氢酶(dehydratase, DH)、烯酰还原酶(enoyl reductase, ER)和酮基还 原酶(ketoreductase, KR) 等功能域（结构域）组成。这些结构域组成 模块化结构。KS、AT、ACP是链延伸反应的“最小PKS”，由AT选择 一个延伸单元，通常是乙酸或丙酸，连接到链上，由KS催化缩合反 应，ACP吸住链并接受从AT来的延伸单元以备下一步缩合反应。 如合成红霉素的PKS由3 条多肽链(DEBS1、DEBS2 和DEBS3)7 个模块 组成; 合成雷帕霉素的PKS 由3 条多肽链(RAPS1、RAPS 2 和RAPS 3)14 个模块组成。
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McDaniel 等将合成红霉素PKS模块2的KR结构域替换为来自 于合成西罗莫司PKS 模块4 的DHKR结构域, 与原模块的结构 域相比相当于增加了一个DH 结构域, 得到了一个含有C=C 双键的化合物。
二、聚酮类化合物
聚酮类化合物是由简单脂肪酸在聚酮合酶( Polyketide synthase, PKS) 催化下经过类似长链脂肪酸的合成途径生成的。 目前所发现的PKS可以归为三类: (1)Ⅰ型PKS也称为模块式 模块式PKS, 它由若干个多功能多肽组成, 每一个 模块式 多肽上都分别携带有独特的、非重复使用的催化结构域； (2)Ⅱ型PKS也称为迭代式 迭代式或芳香式PKS, 它是一个多酶复合体的迭代 迭代式 体系(至少包含KS 和ACP), 通过一套可重复使用的结构域在重复的反
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应步骤中多次用来催化酚聚酮结构的生成； (3) Ⅲ型PKS是可重复使用的同源双亚基蛋白, 属于查尔酮(chalcone) 合成酶类。 与前两类PKS 截然不同, 不依赖于ACP, 也不像前两类PKS 是通过ACP 活化酰基辅酶A的底物, 而是直接作用于酰基辅酶A活化 的简单羧酸。
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1、PKS模块或功能域的减少
运用组合生物合成方法对PKS 中某一个模块进行去除的操作中, 当 满足最后一个模块和具有环化功能的酶域可以识别非天然的中间 产物的前提时, 则减短后的PKS 仍然具有催化形成新的聚酮化合物 或其结构类似物的功能。如在红霉素生物合成途径中,分别将合 成红霉素PKS 原有的6 个模块减少至1 个、2 个、3 个或者5 个, 然 PKS 6 1 2 3 5 , 后将具有环化功能的硫酯酶(thioesterase, TE)结构域分别连于其后, 结果相应减短后的P K S 催化合成了二酮、三酮、四酮和六酮化合 物。这说明TE 具有广泛的底物特异性, 对聚酮体结构也有一定的 宽容性, 因此通过直接改变它的位置可以间接调整产生聚酮化合 物的链长度。
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3、Ⅲ型PKS
1999 年, Funa 等发现了一种类似苯基苯乙烯酮合成酶的PKS ( chalcone synthase-like PKS)———RppA,后来被称为Ⅲ 型PKS。 PKSⅢ的典型为查尔酮合成酶（chalconesyn-thaw，CHS）类， 是一种可重复使用的同源双亚基蛋白，在不需要ACP 的情 况下直接催化泛酞辅酶A 间的缩合，其主要负责单环或双 环芳香类聚酮化合物的生物合成，例如flavolin（淡黄霉 素）。与其他PKS 的最大差别在于直接以游离的丙二酸单 酞辅酶A 作底物，无论是PKSⅠ型或Ⅱ型均需要通过酞基转 移酶将丙二酸单酞辅酶A 或其衍生物转移至KS 上。
美国加州高新技术产业公司研制的埃波霉素(epothilone) 作为抗肿 瘤药物于2007年上市。霉素原来由纤维堆囊黏细菌产生, 其产量低, 繁殖时间长, 产品无法进行产业化生产。该公司利用基因组合技术 使纤维堆囊黏细菌的埃波霉素生物合成基因在链霉菌中得到表达, 并通过酰基转移酶功能域替换及羟基化酶基因的阻断, 获得了主要 产生埃波霉素中抗肿瘤活性最好组分的epothilone D 的基因工程菌。
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acyltransferase (AT) , acyl carrier protein(ACP) , ketosynthase (KS) , dehydratase (DH), enoyl reductase(ER), and ketoreductase (KR)
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1985 年, Hopwood 教授在世界首次报道用遗传工程的手段合成 “非天然”的天然产物isochromanequinone, 为后来的组合生物合 成奠定了基础。这一领域成为天然产物代谢工程研究中最活跃的 领域, 许多微生物次级代谢研究的专家都加入这一领域的工作, 因 为组合生物合成有潜力制造出很多先导化合物。
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聚酮类(Polyketides)和非核糖体聚肽类(Non-Ribosomal Polypeptides)在天然产物中占了相当大的比例，如：
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2、Ⅱ型PKS
PKSⅡ又称迭代或芳香（iterative）类PKS，其主要合成芳香 族的化合物，如蒽环类及四环类化合物等。大部分PKSⅡ型 基因由编码最小单位PKS 的3 个阅读框架组成，即KS/AT、 ACP 和CLF（链长决定因子）。在生物合成芳香族化合物过 程中它们被重复使用，因此又称为迭代型PKS（iterative PKS）；此外还有KR、芳香化酶（aromatase）、环化酶 （cyclase）等的参与。属于PKSⅡ的聚酮化合物有放线紫红 素（actinorhodin，act）、四并菌素（tetracenomycinc， tcm） 和富伦菌素（frenolicin，fren）等。
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三、PKS的组合生物合成
聚酮化合物中碳链骨架的构成单位与催化其形成 的PKS 模块之间有着一一对应的关系。因此, 聚 酮化合物中骨架结构的改进( 如更改链长度、环 体系等)可以通过组合生物合成方法改变相应的 PKS模块来实现。此外, 利用异源单元可以增加聚 酮体的多样性, 这样的改变一般并不影响聚酮体 链的环化和PKS 的后修饰, 可以得到新的终产物。
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2. PKS中模块或功能域的增加
Rowe 等以合成红霉素和雷帕霉素的PKS 为研究对象, 首 次成功地实现了模块添加 模块添加的设想。方法是将合成雷帕霉 模块添加 素的PKS 中模块2 和模块5 分别插入到减短后的DEBS1-TE 的模块1 和模块2 之间, 结果得到了在相应位置多出一个 结构单位的四酮化合物(图1); 将合成雷帕霉素的PKS中模 块2和模块5分别插入到全长的合成红霉素的PKS 中模块1 和模块2之间, 结果得到了在相应位置多出一个结构单位 的十六元环的聚酮化合物。
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类似地, Kao 等将合成红霉素PKS 模块2 的KR 结构域 替换为合成西罗莫司PKS 模块1 的DH-ER-KR 结构域, 得到了一个新的八元环化合物。
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3、模块或功能域的替换
在红霉素D E B S 1 的N 端有一个称为荷载域(loading domain, LD)的 AT 和ACP 域。已知不同的LD 对底物的选择性不同, 利用LD对底物 的宽容性, 用异源替换原LD可以改变所接受的起始单元, 从而获得 新的聚酮化合物。Marsden 等用阿维菌素的LD 替换红霉素的LD, 在 构建的糖多孢红霉菌(Saccharopilyspora erythraea)突变体中, 产生了 以阿维菌素生物合成起始单位异丁酸和2-甲基丁酸为起始物的红 霉素衍生物, 添加不同的前体则可合成C-13位为异丙基、2- 丁基等 红霉素A、B 和D 衍生物。由于有许多支链羧酸可以成为阿维菌素 的前体, 因此利用阿维菌素LD 广泛的底物特异性可以获得多种红霉 素衍生物。
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一、定义
组合生物合成 组合生物合成（Combinatorial Biosynthesis）： 生物合成 是在微生物次级代谢产物生物合成基因和酶 学基础上形成的, 通过对微生物代谢产物合成途 径中涉及到的一些酶的编码基因进行操作(如替 (
其生物合成是由PKS或NRPS蛋白催化、按照功能 结构域和催化模块的排列顺序来指导化学结构的 形成，编码这些酶（或结构域）的基因通常特征 性地成簇分布于染色体的某一区域而构成一个基 因簇。 这预示研究者们可以通过结构域和模块的功能重 排构建重组的PKS或NRPS蛋白，从而控制聚酮或 聚肽骨架结构的合成逻辑，以生产新型结构的 “非天然”天然聚酮或聚肽化合物。
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延伸完成的长链由硫酯酶（thioesterase，TE）功能域催化环化成红霉 素的前体6-脱氧红霉内酯B（6-deoxyerythronolide B,6-DEB)
Analogous enzymatic logic used by the AT domain in modular PKSs. The acyltransferase (AT) and acyl carrier protein(ACP) domains are present in all modules. The ketosynthase (KS) domain is present in all chain extension modules. The dehydratase (DH), enoyl reductase(ER), and ketoreductase (KR) domains are optional domains.
1、Ⅰ型PKS
Ⅰ型PKS 研究最为透彻, 主要由酮基合成酶(ketosynthase, KS) 、酰基 转移酶(acyltransferase, AT)、酰基载体蛋白(acyl-carrier protein, ACP)、 脱氢酶(dehydratase, DH)、烯酰还原酶(enoyl reductase, ER)和酮基还 原酶(ketoreductase, KR) 等功能域（结构域）组成。这些结构域组成 模块化结构。KS、AT、ACP是链延伸反应的“最小PKS”，由AT选择 一个延伸单元，通常是乙酸或丙酸，连接到链上，由KS催化缩合反 应，ACP吸住链并接受从AT来的延伸单元以备下一步缩合反应。 如合成红霉素的PKS由3 条多肽链(DEBS1、DEBS2 和DEBS3)7 个模块 组成; 合成雷帕霉素的PKS 由3 条多肽链(RAPS1、RAPS 2 和RAPS 3)14 个模块组成。
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