碘化丙啶PI染色液(50ugml)
PI染料（碘化丙啶,PropidiumIodide）
PI染料（碘化丙啶,PropidiumIodide）PI 染料(碘化丙啶, Propidium Iodide)PI 染料(碘化丙啶, Propidium Iodide)描述：PI (碘化丙啶, Propidium Iodide)是⼀种可对DNA染⾊的细胞核染⾊试剂，是⼀种溴化⼄啶的类似物，在嵌⼊双链DNA后释放红⾊荧光。
尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜⽽对核染⾊。
PI经常被⽤来与Calcein-AM、Hoechst 33258或 Hoechst 33342等荧光探针⼀起使⽤，能同时对活细胞和死细胞染⾊。
常⽤于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的检测，常⽤于流式细胞仪分析。
性质中⽂名称：3,8-⼆氨基-5-[3-(⼆⼄基甲氨基)丙基]-6-苯基啡啶⼆碘；碘化丙啶英⽂名称：3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridini-um diiodide；Propidium iodide；Propidium diiodide；PI分⼦式：C27H34I2N4分⼦量：668.39CAS：25535-16-4纯度：≥95%（HPLC）PI-DNA较⼤激发波长：535 nmPI-DNA较⼤发射波长：615 nmRNA酶;核糖核酸酶A（⽜胰）DMPA运输与保存⽅法：冰袋（wet ice）运输。
4 ºC避光保存。
使⽤⽅法1.⽤PBS或适当的缓冲液制备10～50µM的PI溶液。
2.将1/10培养基体积的PI溶液加⼊到细胞培养基中（也可以⽤1/10浓度的 PI缓冲液代替培养基）。
3.在37℃培养细胞10～20分钟。
⽤PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
4.⽤535nm激发波长，615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。
苏丹⿊染⾊液琼斯亮绿染⾊液天狼星红染⾊液⿊⾊素染⾊液肥⼤细胞染⾊液Van Gieson染⾊液核固红染⾊液纤维素染⾊液⾼铁⼆胺-爱先蓝（HID-AB）染⾊液钙盐染⾊液酸性磷酸酶染⾊液幽门螺杆菌染⾊液铜盐染⾊液微⽣物染⾊液吉姆萨染⾊液瑞⽒-吉姆萨染⾊液抗酸染⾊液荚膜染⾊液异染颗粒染⾊液麦格⽒染⾊液⼄型肝炎病毒染⾊液(地⾐红型)鞭⽑染⾊液乳酸棉酚蓝染液芽孢染⾊液(Moeller型)细胞染⾊液上⽪组织染⾊液迪夫快速细胞染⾊液⽹织红细胞染⾊液组织固定液脱钙液脱蜡透明液浸腊脱蜡透明液瑞⽒吉姆萨染⾊试剂盒TIMM染⾊试剂盒甲苯胺蓝O (toluidine blue O)TBO染⾊液氯化⾦溶液Gomori ⽒改良醛复红阿尔⾟蓝染⾊试剂盒FAA固定液FAA固定液(原位杂交⽤）20⽚⿊⾊原位杂交湿盒防脱⽚载玻⽚⼩编：wyf 07.20。
100PI染色液使用说明书
100×PI染色液使用说明书货号：SL7091规格：1ml保存条件：-20度保存，有效期1年。
产品内容：产品内容SL7091100×PI染色液（1mg/mL）SL7090-1ml说明书1份产品简介：碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种常用的细胞核荧光染料，作为一种溴化乙锭（EB）的类似物，能够嵌入碱基之间实现与DNA结合。
这种结合没有或者几乎无序列倾向性，大约每4-5个DNA碱基对结合一个染料。
PI也能与RNA结合，需要用核酸酶处理来区分DNA和RNA染色。
水溶液中PI的最大激发/发射波长是493/636nm。
一旦与核酸结合，荧光信号明显增强20-30倍，最大激发波长向红色波段迁移~30-40nm，最大发射波长向蓝色波段迁移~15nm，从而使其最大激发/发射波长变为535/617nm。
PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克司频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。
PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。
PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。
利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst33258或Hoechst33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。
也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。
PI 的单独染色也可以进行细胞周期的检测。
使用说明：可以用PBS稀释到1×使用，或与细胞悬液按照1:100的比例使用。
PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm,5min，弃上清液。
2、加入PBS1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
流式细胞术测定细胞周期
流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。
值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。
二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。
2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。
3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。
4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液PI染色缓冲液：50 μg/ml PI0.1 mg/ml RNase A0.05% Triton X-100总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。
5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。
碘化丙啶PI染色液(50ugml,含RNase)
碘化丙啶PI 染色液(50μg/ml,含RNase)简介：碘化丙啶染色(PI stain)可以对细胞周期与细胞凋亡进行分析。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA 和RNA 的碱基对中并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。
细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI 染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。
碘化丙啶PI 染色液(50μg/ml,含RNase)主要由PI 、破膜剂、RNase 等组成，经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测， 亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、细胞样品的制备：⑴贴壁细胞：① 离心使细胞沉到管底。
小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl 培养液，以免吸走细胞。
② 加入约1ml 提前预冷的PBS ，重悬细胞，并转移至1.5ml 无菌离心管。
③ 离心使细胞沉到管底。
⑵悬浮细胞：① 离心使细胞沉到管底。
② 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl 培养液，以免吸走细胞。
③ 加入约1ml 提前预冷的PBS ，重悬细胞，并转移至1.5ml 无菌离心管。
④ 离心使细胞沉到管底。
⑤ 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS ，以免吸走细胞。
2、细胞的固定：加入1ml 冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃条件下固定2h 或更长时间。
4℃固定12～24h 可能效果更佳。
3、细胞的清洗：① 离心使细胞沉到管底。
② 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl 溶液，以免吸走细胞。
③ 加入约1ml 提前预冷的PBS ，重悬细胞，并转移至1.5ml 无菌离心管。
④ 离心使细胞沉到管底。
编号 名称 DA0023 Storage PI Stain(50μg/ml,含RNase) 10ml -20℃ 避光 使用说明书 1份⑤小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞。
⑥轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
PI 细胞活性染色试剂对细胞进行检测 (1)
细胞损伤率的测定取培养至对数生长后期的待测菌液，加入2 MIC的大蒜提取物-茶多酚复合物，以蒸馏水代替提取物作为对照组。
37 ℃下150 r/min 摇床培养2 h，3000 r/min离心5 min弃上清，用生理盐水洗涤菌体两次并用生理盐水重新悬浮于同体积的碘化丙啶（propidine iodide，PI）染液中（PI 终浓度为50 μg/mL），置于4 ℃避光孵育30 min后，离心，PBS洗去多余的PI ，再用1 mL PBS重悬，过300目筛后上流式细胞仪检测PI 染色率。
设置未经PI 染色的菌悬液为阴性对照，以经过热处理（70 ℃，10 min）后染色的菌悬液为阳性对照。
原理：PI 细胞活性染色试剂对细胞进行检测。
PI是一种阳离子核酸染料，正常情况下不能进入具有完整细胞膜的活细胞，只有细菌在死亡或凋亡的情况下，生物膜的完整性被破坏后，PI才能掺入细胞的双链核苷酸中。
进入细胞内的PI增多，荧光强度就会增强，根据发出荧光的强弱即PI 染色率即可判断其细胞膜受损伤的程度，从而间接反映细胞的损伤状态。
（2013现代食品科技）脂肪酸组成的测定按照MIDI微生物快速鉴定系统说明书进行。
脂肪酸作为细菌细胞膜的重要组成成分对外界环境的变化十分敏感，常被用作评估微生物生存状态的指标[11]。
细胞膜的膜脂结构对于维持细胞膜的功能及对细胞的生长繁殖也有着十分重要的作用。
而细胞的膜脂结构与所含脂肪酸成分密切相关，脂肪酸组成的改变必然会影响相关膜蛋白活性和膜功能[12]。
通常细胞膜中的不饱和脂肪酸组分多少是与细胞膜的流动性相关的，饱和脂肪酸含量高，则会降低细胞膜的流动性。
细胞膜的流动性是膜结构的基本特征之一，其改变可严重影响细胞功能特性和凋亡通道的诱导效应[13]。
碘化丙啶 PI溶液的使用方及注意事项
碘化丙啶PI溶液的使用方及注意事项
货号：C0080
规格：1ml/1ml×10
保存：-20℃，有效期至少2年
产品说明：
碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂。
它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
PI不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染。
PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。
PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。
常用于流式细胞仪分析和显微镜观察，检测细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)。
本产品为PI水溶液，浓度为1mg/ml。
使用时根据实验不同直接将本产品用相应溶液稀释到工作浓度。
使用方法：（仅供参考）
培养细胞染色
1、取适量PI水溶液加到PBS中，制备成10-50µM（6.7-33.4µg/ml）的PI溶液。
2、将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。
3、在37℃培养细胞10-20分钟。
4、用PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。
5、置于荧光显微镜下观察，激发波长为535nm，发射波长为615nm。
注意事项：
1.PI被普遍认为具有致癌性，操作时应戴手套，并避免交叉污染。
2.本产品需避光，并尽量避免反复冻融。
DNA含量检测试剂盒( 细胞周期 )使用说明
DNA含量检测试剂盒（细胞周期）使用说明DNA Content Quantitation Assay(Cell Cycle)货号：CA1510规格：20T/50T保存：-20℃避光保存，一年有效。
产品说明：细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。
在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。
细胞周期又可以分为间期和有丝分裂期，细胞间期常划分为休眠期（G0），DNA合成前期（G1），DNA合成期（S），DNA合成后期（G2），整个周期可表示为G1→S→G2→M。
DNA周期检测可用来反应细胞周期的各个期的状况，即细胞增殖状况。
利用细胞内DNA能够和荧光染料（如碘化丙啶PI）结合的特性，细胞各个时期其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样。
细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩，核裂解，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化。
在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对90°角光散射的能力增加或没有变化。
在细胞凋亡的晚期，前向角和90°角光散射的信号均降低。
因此可以通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察凋亡细胞。
用PI对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA 量降低，于正常G0/G1细胞群前出现DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1）,即细胞凋亡群。
本试剂盒可应用于培养细胞（悬浮、贴壁）的DNA含量（细胞周期）检测。
试剂盒组成：试剂名称CA1510-20T CA1510-50T保存条件RNase A 2.0mL 5.0mL-20℃PI染色液8.0mL20.0mL-20℃避光使用方法：（仅供参考）1、用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞。
2、用PBS洗涤细胞一次，1500rpm，5min离心收集，调整细胞浓度为1×106/ml,取1ml单细胞悬液。
鱼类种质检验 第14部分：DNA含量的测定-最新国标
鱼类种质检验第14部分：DNA含量的测定1 2范围本文件规定了鱼类DNA含量测定的通用方法。
本文件描述了鱼类红细胞DNA含量测定的试剂与材料、仪器和设备、抽样方法和分析步骤。
本文件适用于鱼类种质鉴定与检测。
规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18654.2 鱼类种质检验第2部分：抽样方法3 4术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。
试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
4.1 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。
4.2 二个结晶水的磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）。
4.3 生理盐水：0.75% 氯化钠（NaCl）溶液。
4.4 固定液：3份甲醇加入1份冰醋酸，现配现用。
4.5 肝素溶液：浓度为500 IU/mL。
4.6 胰酶：浓度为5 mg/mL。
4.7 核糖核酸酶（RNase）：1 mg/mL。
4.8 碘化丙啶(PI)：浓度为50 g/mL。
4.9 0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS)：Na2HPO412.35 g，NaH2PO4•2H2O 20.3 g，蒸馏水定容至 1 L。
5仪器和设备5.1离心机：转速为5000 r/min，常温。
5.2流式细胞仪。
5.310 mL离心管及试管架。
5.4 5 mL试管及试管架。
5.5 吸管。
5.6 2 mL注射器。
5.7 5号针头。
5.8锦纶筛网（或涤纶筛网）：规格为80孔/cm。
5.9封口膜。
6抽样6.1试验鱼抽样按GB/T 18654.2的规定执行。
6.2样品数量达10尾以上。
6.3用酒精棉球将鱼体尾部待采血部位擦试消毒，用装有少量肝素溶液的注射器在尾动(静)脉处取0.2 mL～1.0 mL血液为试样。
另用注射器在小公鸡（Gallus sp.）翅静脉处取2 mL血液作对照用。
植物根系PI染色方法
水稻幼苗根尖PI染色一、原理PI：英文名：Propidium iodide 中文名：碘化丙啶染色原理：碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶（EB）的类似物。
PI在540nm波长（绿色光）的激发下，会在600nm（红色光）处发出明亮的荧光。
PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
它能与细胞壁上的碳水化合物共价结合，对细胞壁进行标记。
Standard confocal laser microscopy was performed using a Leica SP5laser point scanning microscope. propidium iodide was excited using the 488 nm argon laser, and fluorescence emissions were captured between 580 nm and 640 nm for propidium iodide.二、染色过程1 固定：材料置于固定液（50%甲醇+10%醋酸）中，4℃放置至少12h (最长可放置1个月)2 用水清洗材料，置于1%高碘酸溶液中，室温放置40min。
（使细胞壁上的碳水化合物形成醛基）3 用水清洗材料，置于希夫试剂（含PI）1-2h或直至肉眼可见材料染上红色为止（醛基与PI共价结合）希夫试剂(含PI)：焦亚硫酸100mMHCl 0.15NPI 100μg/ml（现加）4 取出样品置于载玻片上，用水合氯醛溶液覆盖样品，室温放置过夜（置于密闭容器中，防止溶液挥发）水合氯醛溶液：水合氯醛4g甘油1mlH2O 2ml5 除去多余水合氯醛溶液，滴数滴Hoyer’s solution，盖上盖玻片，放置3天后显微镜下观察。
Hoyer’s solution：水溶性阿拉伯胶30g水合氯醛200g甘油20gH2O 50ml三、注意事项：（1）由于PI可能具有致癌性，请小心操作。
（2）保存条件：4℃避光保存（3）对人体有刺激性，请注意适当防护。
PI单染检测细胞周期
PI单染检测细胞周期原理：碘化丙啶(Propidium ，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。
碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
操作步骤：1、对于悬浮细胞，直接离心收集细胞，弃上清，在4 ℃、1200rmp下用预冷的PBS洗细胞两次；对于贴壁细胞，先用不含EDTA的0.25%的胰酶消化再离心收集细胞；2、加入预冷的70%乙醇（PBS配制），于4℃固定过夜，或-20℃长期固定；3、离心收集细胞，以1 mL预冷的PBS洗细胞一次，加入预冷的PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1.0×106，取出100 ul细胞悬液，加入RNase A酶，使RNase A终浓度为1 mg/ml，混匀后37 ℃水浴30 min；4、加入PI综合染色液，使PI终浓度为50 ug/mL，混匀，4℃冰箱避光保存；5、300目尼龙网过滤后，上机检测。
注意事项：1、细胞浓度一定要≧1×106/ml，特别是阴性对照管细胞量要大一些，以便样品电压调节；2、必须保证被检测样品为单细胞悬液；3、如果样品细胞为培养的贴壁细胞，将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞），与不含EDTA的胰酶消化的细胞合并后离心收集细胞；4、在细胞固定时一定要将细胞吹开，吹成单细胞悬液；5、RNAse与PI综合染液分开的原因是RNAse的作用最适温度是37℃，而不是4℃，所以与教材有所不同；6、PI综合染液不能用蒸馏水配，否则细胞全部溶解，造成结果不可靠；7、4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料显示-20℃可以至少保存一个月；8、70%~75%的酒精都可以用于PI单染固定。
流式检测细胞凋亡
流式检测凋亡的讨论2010-07-15 14:28 来源：丁香园点击次数：15397 关键词：流式检测凋亡关于凋亡的流式检测wanhood一、PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
PI染色的讨论
关于PI（碘化丙啶）的讨论组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min －1h。
5 、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
碘化丙啶说明书
Revised: 05/17/99Product Information Propidium Iodide Nucleic Acid StainP-1304propidium iodideP-3566propidium iodide, 1 mg/mL solution in waterIntroductionPropidium iodide (PI) binds to DNA by intercalating between the bases with little or no sequence preference and with a stoichi-ometry of one dye per 4–5 base pairs of DNA.1 PI also binds to RNA, necessitating treatment with nucleases to distinguish be-tween RNA and DNA staining. Once the dye is bound to nucleic acids, its fluorescence is enhanced 20- to 30-fold, the fluores-cence excitation maximum is shifted ~30–40 nm to the red and the fluorescence emission maximum is shifted ~15 nm to the blue.2 Although its molar absorptivity (extinction coefficient) is relatively low, PI exhibits a sufficiently large Stokes shift to allow simultaneous detection of nuclear DNA and fluorescein-labeled antibodies, provided the proper optical filters are used.Propidium iodide is suitable for fluorescence microscopy, confo-cal laser scanning microscopy, flow cytometry and fluorometry.PI is membrane impermeant and generally excluded from viable cells. PI is commonly used for identifying dead cells in apopulation and as a counterstain in multicolor fluorescent tech-niques. The counterstaining protocols below are compatible with a wide range of cytological labeling techniques — direct or indi-rect antibody-based detection methods, mRNA in situ hybridiza-tion or staining with fluorescent reagents specific for cellular structures. These protocols can be modified for tissue staining.MaterialsStorage and HandlingUpon receipt, store the solid (P-1304) at room temperature,protected from light. The solid should be stable for at least a year. Store the solution of PI (P-3566) at 4°C, protected from light. To make a stock solution from the solid form, dissolve PI (MW = 668.4) in deionized water (dH 2O) at 1 mg/mL (1.5 mM)and store at 4°C, protected from light. When handled properly,solutions are stable for at least 6 months.Caution : PI is a known mutagen. Solutions containing PI should be poured through activated charcoal before disposal.The charcoal must then be incinerated to destroy the dye.Fluorescence Spectral CharacteristicsWhen bound to nucleic acids, the absorption maximum for PI is 535 nm and the fluorescence emission maximum is 617 nm (Figure 1). PI can be excited with a xenon or mercury-arc lamp or with the 488 line of an argon-ion laser. Molecular Probes offers high quality Omega Optical filter sets for fluorescence microscopy. Filter sets O-5725 and O-5729 are optimized to match the spectral properties of PI. Generally, PI fluorescence is detected in the FL2 channel of flow cytometers.Protocol for Counterstaining Adherent Cells for Fluorescence MicroscopySample PreparationUse the fixation protocol appropriate for your sample. PI stain-ing is normally performed after all other staining. Note that per-meabilization of the cells is required for counterstaining with PI.RNase TreatmentRNase treatment is required if samples are fixed in paraform-aldehyde, formaldehyde or glutaraldehyde. If samples are fixed with methanol/acetic acid or acetone, RNase treatment is usually not required.1.1 Equilibrate the sample briefly in 2X SSC (0.3 M NaCl,0.03 M sodium citrate, pH 7.0).Figure 1. Absorption and fluorescence emission profiles of propidium iodide bound to dsDNA.1.2 Incubate in 100 µg/mL DNase-free RNase in 2X SSC for20 minutes at 37°C.1.3 Rinse samples 3 times, 1 minute each, in 2X SSC. Counterstaining Protocol2.1 Equilibrate the sample in 2X SSC.2.2 Make a 500 nM solution of PI by diluting the 1 mg/mL (1.5 mM) stock solution 1:3000 in 2X SSC. About 300 µL is usually enough stain for one coverslip preparation. Incubate cells, covered with the dilute stain, for 1–5 minutes.2.3 Rinse samples several times in 2X SSC. Drain excess buffer from coverslip and mount in a medium with an antifade reagent such as provided in Molecular Probes’ SlowFade®Antifade Kit, SlowFade Light Antifade Kit or ProLong® Antifade Kit.2.4 View sample using a fluorescence microscope with appropri-ate filters (see Fluorescence Spectral Characteristics).Protocol for Counterstaining Cells in Suspension for Flow CytometrySample PreparationUse the fixation protocol appropriate for your sample, or use the following protocol.3.1 Collect a volume of cell suspension corresponding to 2 × 105 to 1 × 106 cells. Pellet the cells by centrifugation. Discard the supernatant, tap the tube to resuspend pellet in the residual liquid and add 1 mL of phosphate-buffered saline (PBS) at room tem-perature.3.2 Transfer the full volume of resuspended cells to 4 mL of absolute ethanol at -20°C by pipetting the cell suspension slowly into the ethanol while vortexing at top speed. Leave in ethanol at -20°C for 5 to 15 minutes.3.3 Pellet the cells by centrifugation, discard the ethanol, tap the tube to loosen the pellet and add 5 mL PBS at room temperature. Allow cells to rehydrate for 15 minutes. Counterstaining Protocol4.1 Make a 3 µM solution of PI by diluting the 1 mg/mL(1.5 mM) stock solution 1:500 in Staining Buffer (100 mM Tris,pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.1% Nonidet® P-40). A 1 mL volume will be required for each cell sample.4.2 Centrifuge the cell suspension from step 3.3, discard the supernatant, tap to loosen the pellet and add 1 mL of PI-Staining Buffer. Incubate for 15 minutes at room temperature and analyze by flow cytometry in the presence of the dye. If the cells are to be viewed by fluorescence microscopy, centrifuge the sample, re-move the supernatant and resuspend the cells in fresh buffer. Apply a drop of the suspension to a microscope slide, cover with a coverslip and view.Protocol for Chromosome FISH Counterstaining Sample PreparationPrepare the specimen according to standard procedures.3,4 Briefly rinse the final preparations in dH2O before counter-staining to remove residual buffer salts from the slide. Air dry. This final rinse will help reduce nonspecific background staining on the glass.Counterstaining Protocol5.1 Make a 1.5 µM PI staining solution by diluting the 1 mg/mL (1.5 mM) stock solution 1:1000 in PBS. Pipet 300 µL of this staining solution directly onto the specimen. If necessary, RNaseA (freshly made) may be added to a final concentration of10 µg/mL. A plastic coverslip can be used to distribute the dye evenly on the slide.5.2 Incubate the specimen in the dark for 30 minutes at room temperature, or at 37°C if RNase is included.5.3 Remove the coverslip and rinse briefly with PBS or dH2O to remove unbound dye.5.4 Remove excess liquid from the slide by gently blotting around the sample with an absorbent tissue. Place a glass cover-slip on the slide, and seal the edges with wax or nail polish. Alternatively, the preparation can be mounted in an antifade re-agent according to the manufacturer’s directions.5.5 View sample using a fluorescence microscope with appropri-ate filters (see Fluorescence Spectral Characteristics).References1. J Mol Biol 13, 269 (1965);2. Meth Cell Biol 30, 417 (1989);3. Meth Enzymol 168, 741 (1989);4. Pardue, M.L. in Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,. B.D. Hames and S.J. Higgins, Eds., IRL Press, Oxford, England (1985).Product List Current prices may be obtained from our Web site or from our Customer Service Department.Cat #Product Name Unit Size P-7481ProLong® Antifade Kit................................................................................................................................................................ 1 kit P-1304pro pidium io dide........................................................................................................................................................................100 mg P-3566propidium iodide *1.0 mg/mL solution in water*........................................................................................................................10 mL S-2828SlowFade® Antifade Kit............................................................................................................................................................. 1 kit S-7461SlowFade®Light Antifade Kit..................................................................................................................................................... 1 kitContact InformationFurther information on Molecular Probes' products, including product bibliographies, is available from your local distributor or directly from Molecular Probes. Customers in Europe, Africa and the Middle East should contact our office in Leiden, the Netherlands. All others should contact our Technical Assis-tance Department in Eugene, Oregon.Please visit our Web site for the most up-to-date informationMolecular Probes, Inc.PO Box 22010, Eugene, OR 97402-0469Phone: (541) 465-8300 Fax: (541) 344-6504Customer Service: 7:00 am to 5:00 pm (Pacific Time) Phone: (541) 465-8338 Fax: (541) 344-6504 order@ Toll-Free Ordering for USA and Canada:Order Phone: (800) 438-2209 Order Fax: (800) 438-0228 Technical Assistance: 8:00 am to 4:00 pm (Pacific Time) Phone: (541) 465-8353 Fax: (541) 465-4593 tech@ Molecular Probes Europe BVPoortGebouw, Rijnsburgerweg 102333 AA Leiden, The NetherlandsPhone: +31-71-5233378 Fax: +31-71-5233419 Customer Service: 9:00 to 16:30 (Central European Time) Phone: +31-71-5236850 Fax: +31-71-5233419 eurorder@probes.nlTechnical Assistance: 9:00 to 16:30 (Central European Time) Phone: +31-71-5233431 Fax: +31-71-5233419 eurotech@probes.nlMolecular Probes products are high-quality reagents and materials intended for research purposes only. These products must be used by, or directly under the supervision of, a technically qualified individual experienced in handling potentially hazardous chemicals. Please read the Material Safety Data Sheet provided for each product; other regulatory considerations may apply.Several of Molecular Probes products and product applications are covered by U.S. and foreign patents and patents pending. Our products are not available for resale or other commercial uses without a specific agreement from Molecular Probes, Inc. We welcome inquiries about licensing the use of our dyes, trademarks or technologies. Please submit inquiries by e-mail to busdev@. All names containing the designation ® are registered with the U.S. Patent and Trademark Office.Copyright 1999, Molecular Probes, Inc. All rights reserved. This information is subject to change without notice.。
碘化丙啶溶液(1mg ml)说明书
北京索莱宝科技有限公司
碘化丙啶溶液（1mg/ml）说明书
货号：C0080
规格：1mL×1支/1mL×10支
保存：-20℃，有效期至少2年。
产品说明：
碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂。
它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
PI不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染。
PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。
PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。
常用于流式细胞仪分析和显微镜观察，检测细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)。
本产品为PI水溶液，浓度为1mg/ml。
使用时根据实验不同直接将本产品用相应溶液稀释到工作浓度。
使用方法：（仅供参考）
培养细胞染色
1、取适量PI水溶液加到PBS中，制备成10-50µM（6.7-33.4µg/ml）的PI溶液。
2、将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。
3、在37℃培养细胞10-20分钟。
4、用PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。
5、置于荧光显微镜下观察，激发波长为535nm，发射波长为615nm。
注意事项：
PI被普遍认为具有致癌性，操作时应戴手套，并避免交叉污染。
本产品需避光，并尽量避免反复冻融。
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Annexin V-FITC PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒说明书
Annexin V-FITC / PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒货号: P-CA-201规格: 20Assays / 50Assays / 100Assays / 200Assays产品编号产品名称20Assays 50Assays 100Assays 200Assays Storage P-CA-101 Annexin V-FITC 染色液100 μL250 μL500 μL 1 mL 2~8℃. 避光P-CA-151 Annexin V Binding Buffer(10×) 1.4 mL×2 5.5 mL 11 mL 11 mL×2 2~8°C 碘化丙啶(PI)染色液P-CA-161 100 μL250 μL500 μL 1 mL 2~8℃, 避光说明书一份保存条件2~8℃可保存1年。
Annexin V-FITC禁止冷冻保存。
实验原理Annexin V-FITC/PI 荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，可用于检测悬浮细胞和贴壁细胞的凋亡。
Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸(PS) 有高度亲和力。
当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS) 外翻到膜表面，而被荧光染料FITC标记的Annexin V结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。
由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。
本试剂盒检测喜树碱诱导的Jurkat细胞凋亡效果如下图所示：Jurkat细胞用 5 μM喜树碱（Camptothecin）(左) 或未加药(右) 处理4 h，本试剂盒染色后流式检测。
Annexin V-FITC单阳细胞为早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC和PI双阳细胞为坏死或晚期凋亡细胞，PI单阳细胞为裸核细胞。
碘化丙啶说明书
Revised: 05/17/99Product Information Propidium Iodide Nucleic Acid StainP-1304propidium iodideP-3566propidium iodide, 1 mg/mL solution in waterIntroductionPropidium iodide (PI) binds to DNA by intercalating between the bases with little or no sequence preference and with a stoichi-ometry of one dye per 4–5 base pairs of DNA.1 PI also binds to RNA, necessitating treatment with nucleases to distinguish be-tween RNA and DNA staining. Once the dye is bound to nucleic acids, its fluorescence is enhanced 20- to 30-fold, the fluores-cence excitation maximum is shifted ~30–40 nm to the red and the fluorescence emission maximum is shifted ~15 nm to the blue.2 Although its molar absorptivity (extinction coefficient) is relatively low, PI exhibits a sufficiently large Stokes shift to allow simultaneous detection of nuclear DNA and fluorescein-labeled antibodies, provided the proper optical filters are used.Propidium iodide is suitable for fluorescence microscopy, confo-cal laser scanning microscopy, flow cytometry and fluorometry.PI is membrane impermeant and generally excluded from viable cells. PI is commonly used for identifying dead cells in apopulation and as a counterstain in multicolor fluorescent tech-niques. The counterstaining protocols below are compatible with a wide range of cytological labeling techniques — direct or indi-rect antibody-based detection methods, mRNA in situ hybridiza-tion or staining with fluorescent reagents specific for cellular structures. These protocols can be modified for tissue staining.MaterialsStorage and HandlingUpon receipt, store the solid (P-1304) at room temperature,protected from light. The solid should be stable for at least a year. Store the solution of PI (P-3566) at 4°C, protected from light. To make a stock solution from the solid form, dissolve PI (MW = 668.4) in deionized water (dH 2O) at 1 mg/mL (1.5 mM)and store at 4°C, protected from light. When handled properly,solutions are stable for at least 6 months.Caution : PI is a known mutagen. Solutions containing PI should be poured through activated charcoal before disposal.The charcoal must then be incinerated to destroy the dye.Fluorescence Spectral CharacteristicsWhen bound to nucleic acids, the absorption maximum for PI is 535 nm and the fluorescence emission maximum is 617 nm (Figure 1). PI can be excited with a xenon or mercury-arc lamp or with the 488 line of an argon-ion laser. Molecular Probes offers high quality Omega Optical filter sets for fluorescence microscopy. Filter sets O-5725 and O-5729 are optimized to match the spectral properties of PI. Generally, PI fluorescence is detected in the FL2 channel of flow cytometers.Protocol for Counterstaining Adherent Cells for Fluorescence MicroscopySample PreparationUse the fixation protocol appropriate for your sample. PI stain-ing is normally performed after all other staining. Note that per-meabilization of the cells is required for counterstaining with PI.RNase TreatmentRNase treatment is required if samples are fixed in paraform-aldehyde, formaldehyde or glutaraldehyde. If samples are fixed with methanol/acetic acid or acetone, RNase treatment is usually not required.1.1 Equilibrate the sample briefly in 2X SSC (0.3 M NaCl,0.03 M sodium citrate, pH 7.0).Figure 1. Absorption and fluorescence emission profiles of propidium iodide bound to dsDNA.1.2 Incubate in 100 µg/mL DNase-free RNase in 2X SSC for20 minutes at 37°C.1.3 Rinse samples 3 times, 1 minute each, in 2X SSC. Counterstaining Protocol2.1 Equilibrate the sample in 2X SSC.2.2 Make a 500 nM solution of PI by diluting the 1 mg/mL (1.5 mM) stock solution 1:3000 in 2X SSC. About 300 µL is usually enough stain for one coverslip preparation. Incubate cells, covered with the dilute stain, for 1–5 minutes.2.3 Rinse samples several times in 2X SSC. Drain excess buffer from coverslip and mount in a medium with an antifade reagent such as provided in Molecular Probes’ SlowFade®Antifade Kit, SlowFade Light Antifade Kit or ProLong® Antifade Kit.2.4 View sample using a fluorescence microscope with appropri-ate filters (see Fluorescence Spectral Characteristics).Protocol for Counterstaining Cells in Suspension for Flow CytometrySample PreparationUse the fixation protocol appropriate for your sample, or use the following protocol.3.1 Collect a volume of cell suspension corresponding to 2 × 105 to 1 × 106 cells. Pellet the cells by centrifugation. Discard the supernatant, tap the tube to resuspend pellet in the residual liquid and add 1 mL of phosphate-buffered saline (PBS) at room tem-perature.3.2 Transfer the full volume of resuspended cells to 4 mL of absolute ethanol at -20°C by pipetting the cell suspension slowly into the ethanol while vortexing at top speed. Leave in ethanol at -20°C for 5 to 15 minutes.3.3 Pellet the cells by centrifugation, discard the ethanol, tap the tube to loosen the pellet and add 5 mL PBS at room temperature. Allow cells to rehydrate for 15 minutes. Counterstaining Protocol4.1 Make a 3 µM solution of PI by diluting the 1 mg/mL(1.5 mM) stock solution 1:500 in Staining Buffer (100 mM Tris,pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.1% Nonidet® P-40). A 1 mL volume will be required for each cell sample.4.2 Centrifuge the cell suspension from step 3.3, discard the supernatant, tap to loosen the pellet and add 1 mL of PI-Staining Buffer. Incubate for 15 minutes at room temperature and analyze by flow cytometry in the presence of the dye. If the cells are to be viewed by fluorescence microscopy, centrifuge the sample, re-move the supernatant and resuspend the cells in fresh buffer. Apply a drop of the suspension to a microscope slide, cover with a coverslip and view.Protocol for Chromosome FISH Counterstaining Sample PreparationPrepare the specimen according to standard procedures.3,4 Briefly rinse the final preparations in dH2O before counter-staining to remove residual buffer salts from the slide. Air dry. This final rinse will help reduce nonspecific background staining on the glass.Counterstaining Protocol5.1 Make a 1.5 µM PI staining solution by diluting the 1 mg/mL (1.5 mM) stock solution 1:1000 in PBS. Pipet 300 µL of this staining solution directly onto the specimen. If necessary, RNaseA (freshly made) may be added to a final concentration of10 µg/mL. A plastic coverslip can be used to distribute the dye evenly on the slide.5.2 Incubate the specimen in the dark for 30 minutes at room temperature, or at 37°C if RNase is included.5.3 Remove the coverslip and rinse briefly with PBS or dH2O to remove unbound dye.5.4 Remove excess liquid from the slide by gently blotting around the sample with an absorbent tissue. Place a glass cover-slip on the slide, and seal the edges with wax or nail polish. Alternatively, the preparation can be mounted in an antifade re-agent according to the manufacturer’s directions.5.5 View sample using a fluorescence microscope with appropri-ate filters (see Fluorescence Spectral Characteristics).References1. J Mol Biol 13, 269 (1965);2. Meth Cell Biol 30, 417 (1989);3. Meth Enzymol 168, 741 (1989);4. Pardue, M.L. in Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,. B.D. Hames and S.J. Higgins, Eds., IRL Press, Oxford, England (1985).Product List Current prices may be obtained from our Web site or from our Customer Service Department.Cat #Product Name Unit Size P-7481ProLong® Antifade Kit................................................................................................................................................................ 1 kit P-1304pro pidium io dide........................................................................................................................................................................100 mg P-3566propidium iodide *1.0 mg/mL solution in water*........................................................................................................................10 mL S-2828SlowFade® Antifade Kit............................................................................................................................................................. 1 kit S-7461SlowFade®Light Antifade Kit..................................................................................................................................................... 1 kitContact InformationFurther information on Molecular Probes' products, including product bibliographies, is available from your local distributor or directly from Molecular Probes. Customers in Europe, Africa and the Middle East should contact our office in Leiden, the Netherlands. All others should contact our Technical Assis-tance Department in Eugene, Oregon.Please visit our Web site for the most up-to-date informationMolecular Probes, Inc.PO Box 22010, Eugene, OR 97402-0469Phone: (541) 465-8300 Fax: (541) 344-6504Customer Service: 7:00 am to 5:00 pm (Pacific Time) Phone: (541) 465-8338 Fax: (541) 344-6504 order@ Toll-Free Ordering for USA and Canada:Order Phone: (800) 438-2209 Order Fax: (800) 438-0228 Technical Assistance: 8:00 am to 4:00 pm (Pacific Time) Phone: (541) 465-8353 Fax: (541) 465-4593 tech@ Molecular Probes Europe BVPoortGebouw, Rijnsburgerweg 102333 AA Leiden, The NetherlandsPhone: +31-71-5233378 Fax: +31-71-5233419 Customer Service: 9:00 to 16:30 (Central European Time) Phone: +31-71-5236850 Fax: +31-71-5233419 eurorder@probes.nlTechnical Assistance: 9:00 to 16:30 (Central European Time) Phone: +31-71-5233431 Fax: +31-71-5233419 eurotech@probes.nlMolecular Probes products are high-quality reagents and materials intended for research purposes only. These products must be used by, or directly under the supervision of, a technically qualified individual experienced in handling potentially hazardous chemicals. Please read the Material Safety Data Sheet provided for each product; other regulatory considerations may apply.Several of Molecular Probes products and product applications are covered by U.S. and foreign patents and patents pending. Our products are not available for resale or other commercial uses without a specific agreement from Molecular Probes, Inc. We welcome inquiries about licensing the use of our dyes, trademarks or technologies. Please submit inquiries by e-mail to busdev@. All names containing the designation ® are registered with the U.S. Patent and Trademark Office.Copyright 1999, Molecular Probes, Inc. All rights reserved. This information is subject to change without notice.。
细胞生物学实验-细胞凋亡观察
色加深，或核染色质聚集于核膜一边，呈新月状；晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小 不等的原形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。 ⑤ AO（吖啶橙）和EB（溴化乙锭）双染色：AO可以透过细胞膜完整的细胞而嵌入 核DNA呈绿色，EB只能透过细胞膜破损的细胞而嵌入核DNA呈红色。显微镜下 观察，活细胞为荧光深浅不一的结构样特征，核染色质为绿色；凋亡细胞染色强， 亮度高，核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体 或均匀一致的圆状或固缩团状结构。 ⑥ 透射电镜观察：凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形， 核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”，同时可以观察到凋亡 小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬。
细胞凋亡检测
保留的细胞
不健康的细胞
细胞开 始收缩
细胞崩 溃分解 成碎片
不健康的细胞已被除去， 组织内附近的细胞进行 有丝分裂，合上缺口
细胞凋亡检测
细胞凋亡的诱导试剂：
名称 Actinomycin D
Aphidocolin A23187 Caffeine
Camptothecin Cycloheximide Dexamethasone
溶剂 甲醇 二甲亚砜 二甲亚砜 沸水 二甲亚砜
水 乙醇
水
二甲亚砜， 热水 水
二甲亚砜 二甲亚砜 磷酸盐缓冲液
甲醇
细胞凋亡检测
细胞凋亡的检测方法：
PI(碘化丙啶)测细胞周期
PI(碘化丙啶)测细胞周期实验准备：配置70%乙醇存于-20℃冰箱。
PBS预冷在4℃冰箱。
每孔需PBS 4ml，需70%乙醇1ml，需胰酶0.3ml。
A.种板：细胞种6孔板（105-106/孔,1-2ml完全培养基/孔），培养24小时（或过夜）。
B.同步化：过夜后吸去完全培养基，每孔加入1ml无血清培养基，37℃培养12-18小时同化。
C.加药培养：同化后吸去培养液，加入含不同浓度药物的培养液（完全）培养24小时后收集细胞。
D. 收集细胞: 对于贴壁细胞，小心收集细胞培养液到1.5ml离心管内备用。
1mlPBS洗2遍。
300uL/孔胰酶消化细胞2min，加入1.0ml前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
再次收集到1.5ml离心管内。
300g 左右离心3-5分钟，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液。
E.制作细胞悬液：加入约1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml 离心管内。
再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
F. 细胞固定：加入1ml冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或过夜。
300g离心3-5分钟，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇。
加入约1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞。
再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
G.碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘H. 染色：每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min。
随后可以4℃或冰浴避光存放。
染色完成后宜在24h 内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。
I. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法1、????形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2（3（42、DNA细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA 电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；234结合’4用途3、常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
应用价值流式细胞仪检测具有以下特点：1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2)、可以做许多相关性分析3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期（1）检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常利用（2）DNA1、原位缺口转移（insitunick-translation,ISNT)技术，它是利用DNA 多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3?－OH端2、原位缺口末端标记技术（insituendlabellingtechnique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3?-OH端。
研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。
（3）检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。
磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的可以有高光素因此VV过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。
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碘化丙啶染色液(50μg/ml)
简介：
碘化丙啶染色(PI stain)可以对细胞周期与细胞凋亡进行分析。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA 和RNA 的碱基对中并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。
碘化丙啶与双链DNA 结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA 的含量成正比。
细胞内的DNA 被Propidium Iodide 染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA 含量测定，然后根据DNA 含量的分布情况
Leagene 碘化丙啶染色液(50μg/ml)主要由PI 、破膜剂等组成，经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测， 亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。
Leagene PI 染色液工作浓度为20～50μg/ml ，不含RNase ，推荐用于RNA 染色，细胞检测含量范围一般为0.1～1×106之间。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、细胞样品的制备：
⑴贴壁细胞：
① 小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。
② 用胰蛋白酶消化细胞至可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
③ 收集上述细胞悬液到离心管内。
④ 4℃，离心，使细胞沉到管底。
小心吸取上清并丢弃，可留大约培养液，以免吸走细胞。
⑤ 加入约提前预冷的PBS ，重悬细胞，并转移至1.5ml 无菌离心管。
⑥ 4℃，离心，使细胞沉到管底。
⑦ 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS ，以免吸走细胞。
⑧ 轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
⑵悬浮细胞：
① 4℃，离心，使细胞沉到管底。
② 小心吸取上清并丢弃，可留大约培养液，以免吸走细胞。
编号 名称 DA0022 Storage PI Stain(50μg/ml) 10ml -20℃ 避光 使用说明书 1份
③加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管。
④4℃，离心3，使细胞沉到管底。
⑤小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞。
⑥轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2、细胞的固定：加入1ml冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃条件下固定2h或更长时间。
4℃固定12～24h可能效果更佳。
3、细胞的清洗：
离心使细胞沉到管底。
小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl溶液，以免吸走细胞。
加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管。
离心，使细胞沉到管底。
小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
4、PI染色：在每个待检细胞样品中加入配制好的PI染色工作液，轻轻重悬细胞沉淀，置
于37℃避光水浴。
在24h内进行染色或流式细胞仪分析。
5、检测与分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。
采用适当分析软件进行细胞DNA或RNA含量分析和光散射分析。
染色结果：凋亡细胞G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型，在光散射谱上，前向光散射低于正常，侧向光散射高于正常。
注意事项：
1、荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。
2、为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。
3、在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当
提高离心力或延长离心时间。
4、如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化后，制备成单细胞悬液，
才可以进行检测。
5、细胞凋亡时，凋亡细胞的标志之一是DNA可染行降低，但这种情况并是绝对的，DNA
含量的降低或者DNA与染料结合能力下降也会导致DNA可染行降低，在分析的时候应特别注意。
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