高效液相色谱法测定不同品种辣椒药材中辣椒碱的含量

*基金项目：广东省2015年建设中医药强省科研课题（20152070）①广东省珠海市斗门区侨立中医院（广东省珠海市第二中医院） 广东　珠海　519125通信作者：郑创钦高效液相色谱法测定不同品种辣椒药材中辣椒碱的含量*郑创钦① 【摘要】　目的：探讨不同品种辣椒药材中辣椒碱的含量的测定方法。

方法：采用高效液相色谱法，色谱柱选择Hanbon Sci.& Tech.Lichrospher C18（250.0×4.6 mm，5 μm）进行分离，流动相为甲醇：0.1%磷酸水溶液（65%~90%，0~45 min）梯度洗脱，检测波长为280 nm，柱温为28 ℃。

结果：辣椒碱的线性回归方程为：Y =11.918×106X-3.925×103（r =0.9997），辣椒碱在1.0007~4.0261 μg 范围内呈良好的线性关系，辣椒碱的平均回收率为99.93%，RSD=1.32%。

结论：高效液相色谱法用于测定辣椒中辣椒碱的含量，成分分离效果好，系统稳定性高，操作简单，同时适用于不同品种辣椒药材中辣椒碱的含量测定，不同品种不同成熟度的辣椒中辣椒碱的含量具有差异性。

【关键词】　高效液相色谱法；　不同品种；　辣椒；　辣椒碱 Determination of The Content of Capsaicin in Different Kinds of Capsicum by High Performance Liquid Chromatography/ZHENG Chuang-qin.//Medical Innovation of China，2017，14（04）：019-022 【Abstract】　Objective：To study the method for the determination of capsaicin in different varieties of capsicum.Method：High performance liquid chromatography was used，and the separation was carried out on a Hanbon Sci. & Tech. Lichrospher C18 （250.0×4.6 mm，5 m）.The mobile phase consisted of methanol：0.1% phosphoric acid aqueous solution （65%-90%，0-45 min） gradient elution， detection wavelength was 280 nm， and the detection wavelength was 28 ℃.Result：The linear regression equation of capsaicin was Y =11.918×106X-3.925×103（r =0.9997），and the capsaicin showed a good linear relationship in the range of 1.0007-4.0261 μg.The average recovery of capsaicin was 99.93%，and RSD=1.32%.Conclusion：High performance liquid chromatography （RP-HPLC） can be used to determine the content of capsaicin in capsicum， and it has good separation effect，high system stability and simple operation.It can be applied to the determination of capsaicin in different varieties of capsicum.The content of capsaicin in different varieties of different maturity is different. 【Key words】　High performance liquid chromatography；　Different varieties；　Pepper；　Capsaicin First-author ’s address：Qiaoli Traditional Chinese Medicine Hospital of Doumen District in Zhuhai City（Second Traditional Chinese Medicine Hospital in Zhuhai City），Zhuhai 519125，China doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.006 辣椒（Capsicum frutescence L）又称辣角、辣子、秦椒、番椒，属于茄科辣椒属植物[1]，起源于南美洲的秘鲁和中美洲的墨西哥一带，在大约十六世纪末期辣椒传入中国，被作为药物的调味品使用[2]。

辣椒传入我国之后其分布地区较广，品种多，应用范围广，具有一定的药用价值[3]。

《中国药典》2010版（一部）将其作为新增品种进行规定，并通过了高效液相色谱法测定辣椒碱成分的含量以控制辣椒的质量。

有研究表明，辣椒产生辣味的主要成分为辣椒碱，辣椒果实中的主要药用成分也是辣椒碱，辣椒碱类化合物具有镇痛、消炎、杀菌的作用，已经被应用于治疗风湿、跌打损伤、镇痛、糖尿病性神经痛以及银屑病等疾病中[4-6]。

本研究为了评价不同品种辣椒药材的质量，以辣椒中的有效成分辣椒碱为指标成分，采用高效液相色谱法对不同品种辣椒药材中的成分含量进行了测定，为辣椒药材的应用和质量控制提供参考，同时为从植物资源中提取辣椒碱类物质提供检测依据[7]。

1　仪器与试药1.1　实验仪器　Agilent HP 1200型高效液相色谱仪器（其中包括四元泵，自动进样器，DAD 检测系统，均属于美国Agilent公司生产）[8]，美国梅特勒BP-211D电子分析天平（精密度为0.0001 g），KQ5400型超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司生产），DHG-9275B型电热恒温鼓风干燥箱（北京生物科技有限公司），SB-2200EYE型旋转蒸发仪器（上海爱郎仪器有限公司）。

1.2　试药　试验中的不同辣椒药材购于本市农科院，并经相关专家鉴定为辣椒正品，将药材晒干、粉碎，置于干燥容器内备用[9]。

对照品辣椒碱（中国药品生物制品检定所，批号：111666-201005），甲醇溶液，乙腈，磷酸溶液均为色谱纯（北京化工科技有限公司），95%的乙醇溶液为药用级别，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果2.1　供试品溶液的配制　取同一批次的辣椒药材约30 g，粉成粗粉后取12 g精密称定后，置于500 mL的圆底烧瓶中[10]，加入药材体积9倍量的95%乙醇溶液，摇匀后放置于60 ℃恒温水浴锅上减压回流提取2.5 h后过滤，残渣称重后加入2倍量的95%乙醇溶液按照上述操作方式提取1次，将2次滤液合并后加入95%乙醇溶液定溶至216 mL，过0.45 μm的微孔滤膜，置于容量瓶-20 ℃冰箱中，储存，备用。

2.2　对照品溶液的配制　精密称取辣椒碱对照品12.57 mg，置于25 mL的容量瓶中，加入95%的乙醇溶液定溶至刻度，摇匀后将不足的液体补充至刻度，得到0.503 mg/mL的辣椒碱对照品溶液[11]，置于-20 ℃冰箱中储存备用。

2.3　色谱条件的选择　采用高效液相色谱法，色谱柱选择Hanbon Sci.& Tech.Lichrospher C18（250.0×4.6 mm，5 μm）进行分离[12]，流动相为甲醇：0.1%磷酸水溶液（65%~90%，0~45 min）梯度洗脱，检测波长为280 nm，柱温为28 ℃，进样量为20 μL。

分别取2.2项下的对照品溶液和2.1项下的供试品溶液各20 μL，按照上述色谱条件，分别连续进样3次，辣椒碱和供试品样品中相邻色谱峰的分离度>1.5，以辣椒碱峰计算理论塔板数>4000。

记录色谱图，见图1~2。

2.4　线性关系考察　分别精密吸取2.2项下的对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中[13]，用95%乙醇溶液稀释并定溶至刻度后得到不同浓度的辣椒碱对照品溶液。

分别吸取不同浓度的对照溶液各20 μL，按照2.3项下的色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度作为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程为：Y=11.918×106X-3.925×103（r=0.9997），辣椒碱在1.0007~4.0261 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图1　辣椒对照品色谱图注：1：辣椒碱图2　辣椒供试品色谱图 注：1：辣椒碱2.5　精密度考察　取2.2项下的辣椒碱对照品溶液，按照2.3项下的色谱条件，每次进样20 μL，连续进样5次，记录色谱峰面积并按照线性回归方程计算，结果表明辣椒碱对照品平均色谱峰面积为135697，其RSD值为1.23%，表明所采用的高效液相色谱仪器精密度良好。

2.6　稳定性考察　取同一批次的供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、16、20 h内按照2.3项下的色谱条件分别进样20 μL，结果表明辣椒碱的平均峰面积为406 289，RSD值为1.02%，表明辣椒供试品溶液在20 h内稳定性较好。

2.7　重复性试验　取统一品种的辣椒样品6份，按照2.1项下的供试品溶液配制方法制备成待测样品溶液，按照2.3项下的色谱条件分别进样20 μL，测定辣椒碱含量[14]，结果表明辣椒碱的平均含量为1.326 mg/g，RSD值为0.32%，表明高效液相检测方法的重复性良好。

2.8　加样回收率试验　取已知含量的同一批次样品6份，精密称定，分别精密加入已知浓度的辣椒碱对照品溶液（辣椒碱含量为0.503 mg/mL）1.0、1.0、2.0、2.0、4.0、4.0 mL，按照2.1项下的供试品溶液的制备方法配制成溶液后[15]，按照2.3项下的色谱条件分别进样20 μL，按照线性回归方程进行分析，辣椒碱的加样平均回收率为99.93%，RSD 值为1.32%，见表1。

表1　加样回收率试验结果表（n=6）取样量（g）样品含量（mg）加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均加样回收率（%）RSD 值（%）5.9897 1.33950.5030 1.841099.9299.931.326.0025 1.34120.5030 1.843099.935.9944 1.3399 1.0060 2.343899.916.0326 1.3445 1.0060 2.349799.976.0127 1.3427 2.0120 3.351299.906.00281.34022.01203.351099.962.9　样品含量测定　取不同省份的辣椒药材样品，按照2.1项下的制备溶液方法制备成供试品溶液，取已知浓度含量的辣椒碱对照品溶液与供试品溶液各20 μL [16]，注入高效液相色谱仪器中按照2.3项下的色谱条件进行分析，按照线性关系方程计算不同省份辣椒样品中辣椒碱的含量。