微生物学实验教案

革兰氏染色法

一、[目的要求]

了解革兰氏染色的原理；掌握革兰氏染色的方法。

二、[实验原理]

根据革兰氏染色反应的结果，可将所有细菌分为两类：呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示；

三、[实验步骤]（插片法）

1.涂片

2.固定

3.染色

4.干燥

5.镜检

四、[实验报告]

1.实验结果

报告所观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘图。

2.思考题

1.革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？

2. 革兰氏染色成败的关键在哪一步？为什么？应如何掌握？

实验四微生物大小的测定及计数

一、[目的要求]

1学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。增强微生物细胞大小的感性认识。

2.明确血球计数板计数的原理

3.掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、[实验原理]

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

三、[实验步骤]

1.目镜测微尺的标定

2.菌体大小的测定

3.用毕后处理取出目镜测微尺，将目镜测微尺和镜台测微尺用檫镜纸檫试干净，放回盒内保存。

4.稀释

5.镜检记数室

6.显微镜记数

7.清洗血细胞记数板

四、[实验报告]

1.实验结果

将测得的菌体大小值填入表中。

2.思考题

若目镜和目镜测微尺不便，只改用不同放大倍数的物镜测定同一菌体时，其测定结果是否相同？为什么？

3.根据你实验的体会，说明用血细胞记数板的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？

实验五牛肉膏蛋白胨培养基的制备

一、[目的要求]

1. 明确培养基的配制原理。

2.通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

3.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。

4.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、[实验原理]

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

三、[实验步骤]

1.称量

2.溶化

3.调PH

4.过滤

5.分装

6.加棉塞

7.包扎

8.灭菌

9.搁置斜面

10.无菌检

11.灭菌

四、[实验报告]

1.实验结果

记录本实验配置培养基的名称、配方、配制过程，并分析其中的碳源、氮源、能量、无机盐及维生素的来源。

2.思考题

1.在配制培养基的操作过程中应注意些什么？为什么？其中关键操作是什么？

2.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？若不能及时灭菌应如何处理？

3.高压蒸汽灭菌时为什么先要将锅内冷空气排尽？灭菌后压力未降到“0”为什么不可开盖？

实验六土壤中细菌的分离纯化

一、[目的要求]

该项实验是我实验室自行设计编排的，其特点是将培养基制备、高压灭菌、平板制作、细菌菌落计数、接种、分离方法等最基础的微生物学实验技术引入本科生实验教学中，设计综合了从土壤微生物群落中分离培养细菌的整套实验内容。通过该项实验可使学生练习观察细菌群体特征的方法，并能对各特征进行正确的区分，了解对群体特征描述中一般语言的使用及其准确性，并提高实践动手能力的同时培养学生独立分析、解决问题的综合能力，培养学生科学的思维能力和创新意识，养成理论联系实际，勇于探索的科学精神。

二、[实验原理]

微生物在自然界不是单一纯粹地存在，欲获得所需菌种，必须进行分离、接种、培养。

分离方法很多，主要有平板划线分离、平板倾注法、选择培养基法、单细胞挑选法，接种方法主要有斜面接种、液体浸染接种、穿刺接种、液体接种、点植接种等，可以根据实验

需要分别选用。微生物培养方法很多，主要有需氧培养、厌氧培养，培养温度不同等。

菌落主要特征包括大小、形状（正面、侧面）、边缘状态、表面状况（湿润、光滑、干燥、粗糙、绉褶）、颜色（菌落本身的颜色和分泌的可溶性色素）、透明程度（不透明、半透明、透明）。菌落特征与细胞结构密切相关，但也与培养条件、培养成分、生长情况有关。因此观察菌落特征有一定的缺陷性。

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在合宜温度下培养，1-2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

三、[实验步骤]

1.制备土壤稀释液

将采集晾干的土样研碎并过筛，取10g研细的土样装入盛有90ml灭菌水的三角瓶中，混匀，制成土壤悬浮液，稀释度为0.1。从中取出1ml土壤悬浮液移入装有9ml灭菌水的试管中，摇匀，稀释度为0.01。再将其分别稀释10和100倍，稀释度分别为0.001和0.0001。

2.涂布平板

从上述四种稀释度的土壤悬浮液中各取1ml，无菌操作分别移入已制备好的燕麦平板培养基表面，用L型玻棒将土壤悬浮液摊平，每个土样设3个重复。

3. 培养

将涂好平板标记，置于28℃恒温培养箱内黑暗培养，48h后记录菌落形成单位（cfu）。

从纯净的菌落边缘挑取少量菌丝移入另一平板培养基上，28℃暗培养至获得纯菌株。

4. 挑菌落

四、[实验报告]

1.实验结果

（1）将你自己的平板记录在表中。

（2）与其他同学所做的结果进行比较。

2.思考题

（1）如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为该怎么处理？

(2) 为什么熔化后的培养基需冷却45℃左右才能倒平板？

（3）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？