001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法
001_经口急性毒性试验方法_改良寇氏法
急 性 毒 性 试 验 方 法――改良寇氏法Kärber 法由Kärber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法（Käber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。
2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。
进行正式实验。
用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g ，小鼠18~22g ，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg ，犬10~12 kg 。
用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。
仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。
当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。
通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组：1n abr -= 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。
毒理学实验报告参考格式
写题目：灭多威经口急性毒性试验一、目的意义（抄实验课本）二、原理（抄实验课本）三、内容与操作步骤（一）受试动物：昆明种小白鼠，体重18g~24g，雌雄各半。
（二）称重、分组原则：每性别各分、6个剂量组、每组5只、体重均衡法进行方法：实验课本P15（体重均衡法分配方法）（1）雄性小白鼠分组第一步将动物按体重分组按照18~g，19~g……24g分为7组，30只雄性小白鼠称重后放入相应的体重组中。
第二步照抄就好（2）雌性小白鼠分组同（1）（三）编号（参考课本P21）各小组的按照小组的做法来写（四）剂量设计原则：设6个剂量组，组间剂量(mg/kg)以及灌胃液浓度(mg/ml)均是等比数列，比值均为1.32设计方案：组别 1 2 3 4 5 6剂量（mg/kg）100 75.79 57.39 43.48 32.94 24.95 灌胃液浓度（mg/ml）5 3.79 2.87 2.17 1.64 1.24 原液取量（ml）5*2 3.79*2 2.87*2 2.17*2 1.64*2 1.24*2 （定容为10ml）动物死亡数（只）8 9 6 0 1 1（五）受试物的配制（课本P22）可以用自己的语言来简洁地描述（六）灌胃给药（课本P23）具体操作要写原则：等容量法（七）中毒体征和动物死亡观察记录写表3-1 急性毒性实验原始记录2.计算LD50（1）方法：改良寇氏法(课本P26，写原则和计算公式及表3-3(6组)求lgLD 50和SmLgLD50及其95%可信限为所以LgLD50及95%可信区间范围为四、结果评定（课本P25 写表3-2）判断受试物的毒性大小和毒性特征四、实验讨论1.写实验操作过程中出现了什么问题2.小组针对各小组结果进行讨论，特别是有异常结果的小组要注意了3.也可以比较雄雌性结果的差异大家发挥想象力吧！。
LD50测定预试(采用改良寇氏法)
取 2%敌百虫？ml 加生理盐水至？ml 即为母液。以此类推。 从母液中取出？ml 作为 4 号液（最高浓度）
在剩下的？ml+生理盐水？ml 取？ml 作为 3 号液。以此类推。 3. 计算剂量填入表格 以第一组剂量×比值按顺序填入各组剂量值。 4. 将稀释好的药液按顺序给每组小鼠 0.2ml/10g 腹腔注射，1 号液注射 1 组；2 号液 2 组……观察 10ˊ～15ˊ内死亡情况以翻正反射消失为准，并将死亡数 填入表格，一只未死的剂量组为 0%全部死亡的为 100%。 组号 剂 量 对数 实验动物 死亡数 死亡数 P P2 mg/10g 剂量 数
摇匀
1 2 3 4
实验一、LD50 测定预试（采用改良寇氏法） ——小白鼠腹腔注射敌百虫
目的：初步确定 0%和 100%死亡率的剂量范围。 1. 基本要求：步骤： （1）实验动物的选择：♂、♀各半后兼取，剔除病鼠及（远 ♂、近♀）孕鼠，体重应较接近 20±2g。品系、年龄、饲料、饥饱与环境因 素尽可能一致。本实验采用昆明小鼠 20 只。 （2）随机分组：减少人为的偏差，采用随机数字表。每个小鼠称（按体重轻 重分）重编号，和随机数字表对应，用组数去除时（本实验分四组） ，按如下 分配。 ①余数等于零时，其余数用组数表示如： 4÷4→余 0→4 组。 ②不够除时，直接把分子落下来。如：3÷4→3→3 组。 ③能除时，余数即为组数。如：0.5÷4→1→1 组。 如此类推，分完了不均衡（每组应相等） ，每组多的重新按随机数字表分配，随 机数字除以该组的动物数（参见例 1～例 3） 。 （3）确定剂量 ①剂量范围选择：据经验，预试找出 0%～100%范围，Dm 为使试验动物全部死亡 的最小剂量，Dn 为使试验动物一个也不死亡的最大剂量。 Dm =10mg/kg ;Dn =3.3mg/kg 二步法大致 a 新药——————→ 10x 稀释————→ 2 倍稀释 范围 x b 无资料：治疗量×100 作为最大剂量 ②剂量分组：5～8 组为宜，要求 50%死亡上下各有一半的组，包括 0%和 100% 组，两头舍去。 ③各组剂量呈等比级数，换成对数为等差级数。 比值=log −1 (
实验二-经口急性毒性试验-Acute-Oral-Toxicity
实习内容
试验动物的选择和性别鉴定。
试验动物的称重、编号以及随机分组方法。 急性毒性试验常用染毒途径和方法。
急性毒性反应的观察和LD50计算。
实验材料
(一) 实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。
(二) 器材 注射器(O.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，
10m1)、容量瓶(10，25，50ml、烧杯(10，25，50ml)、滴管、
灌胃针(大鼠、小鼠适用)、电子天平(感应量1/10000g)、动物 体重秤、外科剪刀、镊子。
(三) 试剂
受试化学物为氟化钠(NaF，分析纯)，苦味酸酒精饱和液 或其它染色剂。
实验动物的选择(提问)
实验动物的性别鉴定
♀
♂
分组成表3所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试验。
表3 调配后30只动物随机分组
组别 A 1 14 鼠号 17 19 23 组别 D 4 9 鼠号 25 26 27
B
C
5
7
8
16
10
20
13
22
15
29
E
F
2
3
6
11
12
18
24
21
28
30
实验动物染毒途径和方法（示教）
常用的染毒途径： 经口染毒 经呼吸道染毒
面向自己,沿着门牙左 边滑入
气管
By LASCO
食道
经皮染毒
注射途径染毒
吸收速率：
静脉注射>吸入染毒>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射> 经口染毒>皮内注射>其他染毒途径如经皮等
受试物的配制
实验二 经口急性毒性LD50测定
实验二经口急性毒性LD50测定实验二经口急性毒性LD50测定一、试验目的1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量设计2. 掌握小鼠灌胃技术3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法二、试验原理选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。
一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。
根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
三、材料和试剂1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、分析天平、台秤、外科手术剪、镊子3. 受试物:(敌百虫或克佰威)4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液四、实验内容1. 实验动物称重、编号和随机分组2. 染毒剂量设计及试剂配制3. 小鼠灌胃染毒技术4. 毒性反应的观察及LD50计算五、试验方法(一)预实验1. 探索剂量范围先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。
据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。
以次类推，找出Dmin。
2. 剂量分组一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。
在确定组数后，按下列公式计算r。
1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如0.5ml/20g)。
剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。
急性经口毒性实验
小鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠头部两耳后皮肤，无名指或小指将尾部紧压在手上，使小鼠腹部向上，尽量使其体位垂直，注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持连着灌胃导针的注射器，将灌胃针由动物口腔侧插入，避牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即深人至胃部，一般进针深度小鼠2.5～4cm，随后将受试物溶液注入。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。小鼠一次灌胃体积为10-20ml/kg
灌胃时操作要避免损伤食道或误入气管
正确捉拿动物，防止被咬伤且避免动物损伤
防止操作者中毒。注意通风，不要把药品撒到手、脸部皮肤及身体其他部位，操作过程中要小心。
五、注意事项：
实验动物的种属。
01
实验动物体重和随机分组情况。
02
受试物的名称、性状等情况。
03
受试物的配制和溶剂。
04
描述实验观察的中毒表现和死亡情况等。
LD50的95%可信限=log-1(X + 1.96 SX )
结果评价：
根据实验动物中毒体征、死亡时间、根据得出的LD50及受试物的种类，按相应的国家标准或技术规范中的急性经口毒性分级标准（课本 215页--农药的急性毒性分级）对受试物进行毒性定级，判断受试物的毒性大小。
灌入量计算和操作要准确，否则影响结果
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202X
急性经口毒性实验 （Acute Oral Toxicity Test）
通过本次实验掌握经口灌胃技术，半数致死剂量的意义。
通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。
一、实验目的：
二、测定方法：
本实验以灌胃方式测定敌敌畏DDV（80g/100ml）的半数致死量（LD50）。
急性经口毒性实验方法的比较与选择
急性经口毒性实验方法的比较与选择国内外的农药管理机构在对农药进行安全评价时，农药的急性毒性实验是必不可少的。
通过研究实验哺乳动物在不同接触途径（口腔、皮肤、呼吸道、眼睛）下对农药的中毒反应，来推测该农药对人类、家畜等的毒性大小，从而为安全生产、储存、运输及使用农药制定指导性文件。
急性经口毒性的概念急性经口毒性（acute oral toxicity）：机体一次或24h内多次经口接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。
急性经口毒性试验的目的1）求出致死剂量及其他急性毒性参数2）观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征3）为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据4）为毒理学机制研究提供线索急性经口毒性的参数半数致死剂量：LD50实验要点(一)健康实验动物的选择和性别鉴定。
(二)实验动物称重、编号和随机分组方法。
(三)受试化合物溶液的配制。
(四)小鼠灌胃技术。
(五)毒性症状的观察和LD50计算。
国际通用的几种急性经口毒性实验方法传统的急性经口毒性试验多采用霍恩氏法和改良寇氏法。
我国过去普遍采用的急性毒性的评价方法大体上可以归为两类：一是死亡率剂量反应要求为正态分布的，其中概率分配图解法和寇氏法（Karber）较为常用；另一类是不要求为正态分布的（非正态分布），查对有关表格即可得到LD50值，如霍恩氏法（Horns）等。
目前中国主要采用三种急性经口毒性试验方法，分别为霍恩氏法、序贯法（up-and-down procedure）、概率单位法（Miller and Taninter’s method）。
具体方法可参看中华人民共和国国家标准GB/T 15670-2017 （农药登记毒理学试验方法）第2、3、4部分内容。
美国EPA农药登记推荐的方法是OPPTS 870.1100，实际内容与OECD 425 （up-and-down procedure）一致。
LD50计算方法
2.15
0.846～5.48
2.15
0.888～5.23
4.64
1.91～11.3
1.47
0.605～3.56
3.16
1.30～7.67
1.00
0.412～2.43
2.15
0.888～5.23
2.15
0.728～6.38
4.64
1.57～13.7
1.47
0.419～5.14
3.16
0.903～11.1
3.16
0.122～82.1
10.0
0.385～260
Horn氏表2-2
各剂量组动物死亡数 (只)
1234 2224 3024 3034 3114 3124 0033 0043 0123 0133 0143 0223 0233 0243 0333 1033 1043 1123 1133 1143 1223 1233 2033 2043 2123 2133 2223
0
2
1
0
3
1
0
4
1
1
1
1
1
2
1
1
3
1
1
4
1
2
2
1
2
3
2
0
2
2
0
3
2
0
4
2
1
1
2
1
2
2
1
3
每组4只动物，组距3.16倍
剂量1＝0.316
剂量2＝1.00 剂量3＝3.16
×10t
剂量4＝10.0
4
LD50
4
3.16
可信限 1.63～6.15
【推荐】第二次--经口急性毒性实验
二 、实验原理
选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD50计算的设计原则将动物分成数 个染毒组。给予受试物后，了解动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征 以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量（LD50），并 根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。本次实验采用改进寇氏法。 改进寇氏法: 利用剂量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法。要求如下: 每个染毒剂量组动物数相同， 各剂量组组距呈等比级数， 死亡率呈正态分布， 最低剂量组死亡率<20％， 最高剂量组死亡率>80%。
治疗提供参考。
实习报告要求
• 一、目的意义 • 二、实验原理 • 三、实验材料（实验动物, 受试物）及仪器 • 四、实验步骤(随机分组, 试剂配制） • 五、实验结果（包括两个表、计算结果） • 六、结果评价
• 1、说明受试物的基本情况（名称、纯度、状态等）和配 制方法；
• 2、实验动物的种属、级别。实验前动物禁食情况和健康 状况；
雄A= V * K / (K-1)
•
＝5*1.28/ ( 1.28－1)
=5*1.26/(1.26-1)
•
＝22.9ml
=24.2ml
• 4.下一组溶液的配置： 等比稀释法 A*（1/K）
• 雌性=A×（1/k）=22.9 ×(1/1.28)=17.9ml
• 雄性=A×（1/k）=24.2 ×(1/1.26)=19.2ml
受试物名称: 敌敌畏 验室
受试物性状: 乳油 受试物来源: 毒理实
动物种属品系: 小鼠，昆明种 物中心
毒理学试验
茶多酚毒理学试验及其评价方案摘要：本文为茶多酚急性毒性试验、蓄积性试验和致突变试验的方案。
确定大鼠口服LD50，毒性强弱，是否可作为食品添加剂，及其添加用量。
关键字：茶多酚、L—EGCG、急性毒性试验、蓄积性试验、致突变试验茶多酚（Tea Polyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称。
研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可使锶90和钴60迅速排出体外，被健康及医学界誉为“辐射克星”。
为了使作为天然抗氧化剂广泛应用于食品和医药等产品中, 必须探讨T P 的安全性.。
本文对T P 进行了毒性试验及遗传毒理试验外, 还增加了某些亚急性毒性试验及慢性毒性试验。
1 材料1.1受试物: TP, 淡棕色粉剂, 由桂林实力天然食品有限公司提供，密闭干燥保存, 临用时以生理盐水溶解配制成溶液。
1.2实验动物:昆明种小白鼠,体重(20±2) g。
Wistar大白鼠, 5周龄,体重(105±25)g。
1.3仪器: 日立7170A 生化全自动分析仪(日本日立公司) ,AC920 血球全自动分析仪(瑞典)。
2 方法2.1大鼠急性经口毒性试验(改良寇氏法)：2.1.1大鼠急性毒性预试验: 按卫生部卫法监发(2003)42号文5《保健食品安全性毒理学评价程序和检验方法规范》及所附小鼠、大鼠。
选取体重为(200±20) g 的雄性白鼠24只,按体重随机分为4 组, 每组6只, 禁食12 h 后,按0.2ml/10 g 一次性灌胃给药, 给药剂量分别为4.5、3.0、2.5、1.8 g/kg。
给药后观察14 d白鼠死亡数及死亡分布情。
2.1.2 LD50测定: 根据预试验结果, 确定100%的死亡剂量为LD100, 0% 的死亡剂量为LD0, 100%致死和100%存活量之间设5个剂量,根据i=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)确定组距。
选取体重为(20±2) g大鼠50只,按体重随机分为5组, 每组10 只, 禁食12 h 后, 各组按0.2ml/10 g 一次性灌胃给药, 观察14 d 死亡情况。
实验二经口急性毒性实验
实验二经口急性毒性实验一、实验目的1、通过本次实验掌握经口灌胃技术，半数致死剂量的意义。
2、通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。
二、实验原理：化学物经口染毒的方法是毒理学中重要的基本技术之一，经口急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。
通过该实验学习化学物毒性试验的实验设计原则和掌握经口灌胃技术。
三、仪器、试剂与材料1、器材帆布手套、橡胶手套、电子天平、剪刀、大头针、小鼠鼠笼、泡沫塑料板、棉签、纱布、脱脂棉、小鼠灌胃针、1ml注射器、电子天平、动物体重秤等2、试剂敌百虫、苦味酸饱和溶液。
3、实验动物成年、健康的雌、雄小鼠50只。
四、实验内容与步骤1、实验动物的性别鉴定、编号、称重和分组参考实验一中动物性别鉴定、编号和分组方法，50只小鼠，雌雄各半，随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、五组，各小鼠用电子天平称重，以g为单位，小数点后保留一位数字。
2、确定染毒剂量：经预试验获得敌百虫0％～100％的致死剂量范围，由公式计算各组剂量公比值r：1/-r，根据公比值确定各组正式剂=n ab量。
a：最低组剂量，mg/kgb：最高组剂量，mg/kg3、配制毒物溶液准确称取敌百虫2024mg，溶解并稀释至10 mL，取5 mL置于容器中，供第五组染毒；加入5 mL溶剂，稀释后取出5 mL供第四组动物染毒；再加入5 mL溶剂，稀释后取出5 mL供第三组动物染毒用，依此类推，可配制成按1:0.5递减的各剂量组不同浓度的溶液。
4、计算每只动物实际灌胃体积每只小鼠实际灌胃量＝0.02 mL/g ×该小鼠体重g5、染毒（1）动物的禁食和复食：试验前，实验动物禁食过夜，不限制饮水，灌胃后2-3h后复食（2）灌胃操作技术：同实验一小鼠灌胃染毒法。
6、中毒体征和死亡情况观察染毒后观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡数量和时间及死亡前的特征。
高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应即刻密切观察。
根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。
毒理学 实验二、急性经口毒性试验
LD50测定方法 霍恩（Horn)法（剂量递增法） ——查表 改进寇氏法(karber’s method) 几率单位法
13
改进寇氏法(karber’s method) 基本要求：
每个染毒剂量组的实验动物数量相同； 各剂量组组距呈等比级数； 死亡率呈正态分布； 最低剂量组死亡率<20%，最高剂量组死亡率>80%。
实验二、经口急性毒性试验
1
急性毒性的概念
急性毒性（acute toxicity）是指实验动物一次或 24h内多次接触一定剂量外源化学物后在短期内所产生的健 康损害作用及致死效应。
观察指标包括一般行为和外观改变、大体形态变化 以及死亡效应。
2
（二）急性毒性试验的目的
1.求出致死剂量及其他急性毒性参数，并根据 LD50对急性毒性进行分级。 2.观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步 评价毒物的毒效应特征。 3.为后续的毒性试验提供接触剂量和观察指标选 择的依据。 4.为毒理学机制研究提供线索。
i——相邻两剂量组之对数剂量差值； Xk——最大剂量的对数值； p——死亡率； q——存活率（q = 1－p）； ∑p——各剂量组死亡率总和； m —— lgLD50； n——每组动物数。
最后求反对 数得LD50及 可信区间
22
表6-3 我国农药的急性毒性分级
级别
经口LD50
经皮LD50
吸入LC50
18
19
表1. 急性毒性实验原始记录
受试物名称： 动物物种品系： 染毒途径：
受试物性状： 动物来源： 室温：
受试物来源：
组别 剂量 动物 性 体重 染毒量 染毒 体征及 死亡 体重 (mg/kg) 编号 别 (g) (ml) 时间 出现时间 时间 记录(g)
急性毒性试验(改进寇氏法)
实验一急性毒性试验（改进寇氏法）一、目的与要求1、学习急性毒性试验的方法，掌握LD50的测定方法。
2、观察马钱子的毒性反应。
二、实验原理急性毒性试验是指受试动物在一次大剂量给药后所产生的毒性反应和死亡情况。
药物毒性的大小，常用动物的致死量来表示，因为动物生与死的生理指标较其他指标明显、客观、容易掌握。
致死量的测定也较准确。
在测定致死量的同时，还应仔细观察动物是否出现耸毛、倦卧、耳壳苍白或充血、突眼、步履蹒跚、肌肉瘫痪、呼吸困难、昏迷、惊厥、大小便失禁等不良反应。
致死量的测定常以半数致死量为标准。
半数致死量是指能够引起试验动物一半死亡的剂量，妈药物致死量对数值，用符号LD50表示。
由于LD50的测定较简便、可靠，而且稳定，现已成为标志动物急性中毒程度的重要常数。
LD50测定的方法有多种，如Bliss法、改进寇氏法、简化机率单位法、累积插值法、机率单位-加权直线加归法等等。
以上方法虽各有特点，但都有共同的要求：（1）动物：均选用体重17～22克健康小鼠（同次试验体重相差不得超过4克），或选用体重120～150克（同次试验体重相差不得超过1 0克）健康大鼠作实验动物。
性别相同或雌雄各半。
（2）给药途径：要求采用两种给药途径，其中必须有一种与临床所采用的相同。
溶于水的药物沿须测定静脉注射的LD50。
值得提出的是，临床上虽然不用腹腔注射，但动物实验因腹腔注射给药方便，吸收迅速，颇为常用。
若供试药物在腹腔内不引起强烈刺激或局部变化（如纤维性病变等），那么啮齿类动物腹腔注射的LD50，参数很接近于静脉给药的LD50。
口服制剂无法通过注射给药途径时，可只用胃肠给药。
(3)试验周期和观察指标：给药后至少观察7天。
观察期间应逐日记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布。
（4）正式试验前，均须先用少量动物进行预试试验，大致测出受试药物引起0%和100%死亡率的致死量范围，然后安排正式试验。
正式试验组数不得少于三个剂量组，一般选用4～5个剂量组，每组动物数为10～20只。
经口急性毒性试验
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试剂和ห้องสมุดไป่ตู้料
1.受试动物 健康小鼠50只 2.器材 玻璃匀浆器、注射器、容量瓶、烧杯、灌胃器、电子天平（感量 0.1g） 3.试剂 氯硝柳胺悬浮液
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方法
（一）健康动物的选择和性别鉴定（见实验一） 急性毒性试验选择动物的体重要求：小鼠18-22g，大鼠180-200g。 （二）动物称重、编号与随机分组（见实验一） （三）剂量分组 经预试求出受试化学物的大致致死范围（0-100%），按等比级数设计5-7个 剂量组。
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六．LD50计算方法 １、平均致死量法（又名寇氏法） 此法计算LD50较为简便，但实验要符合下列要求： （１）每个实验组动物数要相同； （２）各组剂量要按等比级数分组； （３）最大剂量的死亡率最好为100%或与之接近，最小剂量的死亡率最好为0%或与 之接近，计算公式如下： LD50=Log-1[Xm-i(Σp-0.5)]式中: xm——最大剂量的对数值 i——组距，即相邻两组剂量对数剂量之差 p——各剂量组死亡率（死亡率均用小数表示）
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动物毒理学实验
实验二 经口急性毒性试验
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1
目的和原理
急性毒性试验的目的是推测新药对人的急性毒性的强弱。同时，它可以为长期 毒性试验、生殖毒性试验、致突变试验等试验设计提供剂量选择依据和有关毒 性信息，还可以推测受试药物毒性发生的速度和持续时间，与半数有效量(ED50) 比较判断新药的安全系数。因此，急性毒性试验对了解新药的毒性是非常必要 的。 急性毒性试验的原理是动物一次或24h内多次接触外源化学物后，观察急性毒性 反应及其程度，中毒死亡的原因及特征，了解受试动物毒性反应的剂量-反应关 系，求出LD50。
急性毒性试验讲解.
急性毒性试验常用试验方法
3、固定剂量法（Fixed-dose procedure）
以明显的毒性体征作为终点进行评价。 试验选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂 量进行试验，特殊情况下可增加5000 mg/kg剂量 。实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试 物后再禁食3-4小时。采用一次给药的方式进行。
急性毒性试验常用试验方法
若无有关资料可作参考时，可用500mg/kg作为 初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000 mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束 预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一 个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此 两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂 量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂 量试验之间至少应间隔24小时。给受试物后的观察 期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在， 尚应继续观察7天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少 用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述 四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起 死亡的剂量进行试验，如预试结果表明， 5.0mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行 试验
合格证号：
相对湿度：
组 染毒剂量 动物编 性 体重 染毒
症状
死亡
别 (mg/kg) 号 别 (g) 时间 及出现时间 时间
染毒途径： 室温：
体重记录(g)
……
LD50及其95%可信限（FL）计算
急性毒性及其评价方法
2、预试验
➢ 以此预期毒性中值为待测化学物的中间剂量组，再上下各推1～2 个剂量组做预试验（每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试 化学物的致死剂量范围）
➢ 根据确定的剂量组进行染毒
➢ 根据预试验的死亡资料确定组距
可根据以下公式计算出剂量分组：
○ i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1) 式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；
以灌胃器轻轻压其头部，使口腔与食道成一条直线，再将灌胃针沿 上腭壁轻轻进入食道，当灌胃针进入约3cm左右时即达胃内。
2. 经呼吸道接触
1
2
在常温、常压下为气态，或在生产过 程中 和生活过程中以蒸气、气溶胶、 烟、粉尘 状态污染生产与生活环境空 气，此时就有 可能经呼吸道吸入。
吸入接触分为两种方式 ： ○ 静式吸入 ○ 动式吸入
观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及 其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。
急性毒性替代试验
A
B
固定剂量法
上－下移动法
四、急性毒性分级和评价
实验动物选择
性别
➢ 急性毒性试验所用的动物应当是雌、雄各半 ➢ 如果在研究中发现待测化学物对雌、雄动物的 毒性大小有明显差异时，应分别求出雌性与雄性 动物各自的LD 50 值 ➢ 如果试验是为致畸试验作剂量准备，也可仅做 雌性动物的LD 50 试验
实验动物分组和数量
❑在利用不同的方法测定化学物LD 50 时，实验设 计中对动物数的要求不同
➢ 霍恩氏法测 LD 50 时要求有 4个剂量组， 每组4 或 5只动物
➢ 改进寇氏法、概率单位法、Bliss法测定则要求5 －7个 剂量组，每组10只动物或10只以上
实验三 经口急性毒性实验
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开 始
结 束
3
经口急性毒性 实验
实验目的 实验内容 实验材料 实验步骤 实验结果 结果分析
3. 实验步骤
4.中毒症状：染毒后认真观察中毒发生、 4.中毒症状：染毒后认真观察中毒发生、发展 中毒症状 过程，中毒特点和毒作用靶器官。 过程，中毒特点和毒作用靶器官。观察期间每 3d，称重一次， 3d，称重一次，对死亡动物和实验结束时的存 活动物全部称重，作大体病理学检查， 活动物全部称重，作大体病理学检查，取病变 组织做病理组织学检查，为亚慢性、 组织做病理组织学检查，为亚慢性、慢性和其 他毒性试验剂量和观察指标选择提供参考依据， 他毒性试验剂量和观察指标选择提供参考依据， 并按表3 做好记录。 并按表3-1做好记录。
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开 始
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经口急性毒性 实验
实验目的 实验内容 实验材料 实验步骤 实验结果 结果分析
5. 注意事项
正确捉拿动物，防止咬伤。 正确捉拿动物，防止咬伤。 防止操作者中毒。 防止操作者中毒。 剩余受试化学物应在教 师指导下销毁。 师指导下销毁。
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将外源化合物经口染毒求出LD 将外源化合物经口染毒求出LD50是毒理学研 究中重要的基本技术和基础工作之一。通过试验， 究中重要的基本技术和基础工作之一。通过试验， 学习外源化合物急性毒性试验设计原则，掌握大、 学习外源化合物急性毒性试验设计原则，掌握大、 小鼠经口灌胃技术 求算LD 的方法。 经口灌胃技术和 小鼠经口灌胃技术和求算LD50的方法。 急性毒性试验的原理是动物一次或24h内多 急性毒性试验的原理是动物一次或24h内多 24h 次接触外源化合物后，观察急性毒性反应 急性毒性反应及其程 次接触外源化合物后，观察急性毒性反应及其程 中毒死亡的原因及特征， 度，中毒死亡的原因及特征，了解受试动物毒性 反应的剂量-反应关系，求出LD50。 反应的剂量-反应关系，求出LD50。 剂量 LD50
001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法
001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法急性毒性试验方法――改良寇氏法Kärber 法由Kärber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法（Käber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。
2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。
进行正式实验。
用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g，小鼠18~22g，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg，犬10~12 kg。
用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。
仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。
当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。
通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组：r =n ba式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。
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001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法急性毒性试验方法――改良寇氏法Kärber 法由Kärber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法（Käber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。
2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。
进行正式实验。
用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g，小鼠18~22g，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg，犬10~12 kg。
用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。
仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。
当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。
通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组：r =n ba式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。
分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。
因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出LD 50。
3、根据公比(r)计算各组剂量各组剂量分别为：第一组：a 第二组：a r 第三组：a r2第四组：a r3 第五组：a r4 第六组：a r5二、受试物溶液配制1、溶剂的选择毒理学试验中，常用的剂型有液体剂型、固体剂型。
液体剂型中有溶液剂、混悬剂、乳化剂等。
选择溶剂的原则是不与受试物发生化学反应，不改变化学物的毒性，故应根据受试物的理化性质，选择适当的溶剂。
一般而言，水溶性化学物可选择蒸馏水或生理盐水，以水为溶剂，既经济、方便、易吸收，又无毒副作用。
脂溶性化学物多选用植物油，如花生油、橄榄油。
不溶于水而溶于油的化学物常用吐温-80或吐温-60配制成乳化剂。
既不溶于水又不溶于油脂的化学物可选择淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素钠液（0.5-1% CMC ）等助悬剂配制成混悬液。
如用有机溶剂，实验动物应设溶剂对照组，有机溶剂所用比例不宜超过10%，溶解后，再用水稀释，必要时可加入增溶剂，如吐温-80、聚乙二醇等，以提高溶液剂的浓度。
2、配制方法将受试物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。
比如某受试物的试验剂量分别为100、200、400和800mg/kg，受试物配制成10 mg/ml，每组动物每10g 体重分别给与0.1、0.2、0.4和0.8 ml。
将受试物配制成不同浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。
上例中，若实验动物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,则应配制成4个不同浓度, 即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。
灌胃体积依所选用的实验动物而定，一次灌胃的体积为：小鼠0.1～0.4ml/10g b.w，每只不超过1ml ；大鼠0.5～1ml/100g，每只不超过4ml; 家兔在5ml/kg之内; 犬不超过50ml/kg；为避免操作误差，等容量稀释的传统方法常采用1∶K 系列稀释法。
该法操作简便、浓度精确、节约受试化学物。
a 、确定各剂量组所需受试液浓度如已知最高剂量组剂量为2000mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w.，相当于20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为2000mg/20ml，即10.0%（C 1）。
b 、确定每组所需受试液的量（m ml）按每只鼠体重25g 计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w. ，则每组10只动物所需受试液的量为5ml ；c 、确定母液总量配制时，根据实验设计要求确定最高剂量组所需受试化学物的浓度和总体积，配制母液。
设母液浓度为C 1，各组所需要的量为m ml，母液应配制的总量M 用下述公式计算：M =m1-K式中， K为各组剂量的比值，K=1/r。
d 、配制母液选择适当的溶剂配制浓度为C 1的受试液，取M ml 作为母液，从母液中取出m ml 供最高剂量组染毒用；然后取m ml 溶剂加入剩余的母液中，混匀，稀释后的母液浓度为C 2（C 1 ：C 2=1：k= r ），即次高剂量组所要求的浓度，从中取出m ml供次高剂量组染毒用（第2组），然后再加入m ml溶剂，其稀释后的浓度为C 3（C 2 ：C 3=1.2），取出m ml 供第3组动物染毒用。
依此类推，可配制成按1∶K 递减的各剂量组不同浓度的试液。
三、染毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。
四、观察指标与试验期限急性中毒症状及出现时间，死亡数量、时间。
大体剖检变化。
试验期限为7-14天五、结果及LD50的计算采用寇氏法计算LD 50及其95%可信限 1、试验结果列表表试验结果2 计算LD 50当急性毒性试验的最大剂量死亡率为100%，最小剂量的死亡率为0%；各组动物数相等；各剂量组的组距等比或剂量对数等差时，用下述基本公式计算LD 50：LD 50=log -1[X m -i (∑p -0. 5)]3-P m -P n)] 4当不含0%和100%死亡率时，用下式计算LD 50：LD 50=log -1[X m -i (S x 50∑p -pq =in以上各式中：i —组距，即相邻两组剂量对数剂量之差X m —最大剂量对数P —各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示) P m —最高死亡率q —各组剂量存活率，q=1-pP n —最低死亡率∑p —各剂量组死亡率之和 n —各组动物数 S x50—logLD 50的标准误LD 50 的95 %可信限=log-1(log LD50±1.96×S x50)改进Kärber 法的优点是计算简便、结果精确，实用性大。
我国《新兽药一般毒性试验技术要求》规定用此法计算新兽药的LD 50。
举例：给小鼠口服某药进行急性毒性试验，测定LD 50。
选择体重18~24g健康小鼠（雌雄各半），按随机方法将动物分为5个组，每组10只。
经预试找出死亡率在0~100%的剂量范围大约为300~600mg/kg b.w. 。
（1) 预试（略）（2）计算公比r =n ba（3）根据公比(r)计算各组剂量因而各组剂量分别为：第一组：a=300mg/kg b.w.第二组：a r =300⨯1. 2 = 360mg/kg b.w. 第三组：a r2 =300⨯1. 2 2 =432mg/kg b.w. 第四组：a r3 =300⨯1. 2 3 = 518mg/kg b.w. 第五组：a r4 =300⨯1.2 4 = 622mg/kg b.w.（4）受试液配制采用1：K 系列稀释法配制不同浓度的受试液。
（K ＝1/r）a 、确定各剂量组所需受试液浓度：已知最高剂量组剂量为622mg/kg b.w. ，小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w. ，相当于20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为622mg/20ml，即3.11%（C 1）； b 、确定每组所需受试液的量按每只鼠体重25g 计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w. ，则每组10只动物所需受试液的量为5ml ；c 、确定母液总量各组动物需用本组浓度受试液的用量为5 ml（m ）；各剂量组之比为0.833（k=1/ r），则母液应配制的总量为（ml ）：d 、配制母液选择适当的溶剂配制浓度为3.11%（C 1）的受试液，取30 ml作为母液，从母液中取出5ml 供第五组（最高剂量组）接毒用，然后取5 ml溶剂加入25ml 母液中混匀，稀释后的母液浓度为2.59%（C 2）（C 1 ：C 2=1：k=1.2），即第四组（次高剂量组）所要求的浓度，从中取出5 ml供第四组接毒用，然后再加入5 ml （ν ml）溶剂，其稀释后的浓度为2.16%（C 3）（C 2 ：C 3=1.2），即第三组所需的浓度。
依此类推，可配制第二组、第一组所需浓度的受试液，分别为1.80%、1.50%（5）接毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。
（6）观察指标（7）结果及LD50的计算采用寇氏法计算LD 50及其95%可信限 a 、将试验结果列入下表，按改良寇氏法进行计算；表试验结果b 、按下列公式计算：LD 50=log -1[X m -i (∑p -0. 5)]即：logLD 50=Xm-d （∑p -0.5）Xm=log622=2.7938 i=log 1.2=0.0792 p=0+0.2+0.5+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD 50= 2.7938-0.0792（2.4-0.5）=2.6433 c 查反对数求出LD50=439.87 mg/kg b.w.。
d 计算LD 50的标准误（S ）：S x 50=ipqn=0.0792×0.249=0.0197e 计算LD 50的95%可信限：LD 50的95%可信限= log-1（logLD 50±1.96×S logLD 50）= log-1（2.6433±1.96×0.0197） = log-1（2.6433±0.0386）= log-1（2.6047~2.6819）=402.44~480.73 mg/kg b.w.。