原生质体的分离、融合与培养
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大连理工大学
环境与生命学院
实验十二 原生质体的分离、 融合与培养
指导教师：唐颖
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
大连理工大学
环境与生命学院
1.实验目的
• 了解植物原生质体分离、融合和培养的基 本原理。
• 掌握植物原生质体分离、融合和培养的基 本过程。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
大连理工大学
环境与生命学院
2.实验原理
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
大连理工大学
环境与生命学院
概述
• 物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义， 它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为 作物改良的有力工具之一。
• 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露 细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离 原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要 由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
• PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水 化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可作为邻近原 生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可 在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接 在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从 而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高 了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
大连理工大学
➢ 用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗 糖溶液)，放入另一干净的离心管中．加4ml l3％CPW洗液，1000rpm离心 2-5分钟，弃上清．用血球计数板调整原生质体密度为105一106/ml之间。
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环境与生命学院
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
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3.实验材料、用品
环境与生命学院
– 实验材料：黄瓜种子。
– 实验用品： ①实验器具：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解 剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤 器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、 超静工作台。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
• 原生质体融合
➢ 将1-2滴原生质体混合物（密度分别为105一106/ml）滴 入小培养皿，静置8—10分钟。相对方向加入2滴40％的 PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、 三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸 干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l一2次 即可进行培养：
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原生质体融合后培养
• 原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上 应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动 细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织 或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的 培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是 最关键的环节。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
Fra Baidu bibliotek
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• 原生质体的分离
➢ 取黄瓜无菌苗子叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上（60～70rpm），在 25～28℃黑暗条件下，酶解5～7h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。 在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3～ 4ml l3％CPW洗液，相同 条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗 液吸也，轻轻铺于20％蔗糖溶液上(5ml离心管装3m120％蔗糖溶液)，在 1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态 好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与13％ CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管 底。
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②试剂：
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(1)酶液
(2)PEG融合液
(3)13％CPW洗液
1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L甘露醇
0.7mmol/LKH2PO4 10mmol/LCaCl2·2H 2O pH6.8—7.0
40% PEG (MW 1500-6000) 0.3 mol/L葡萄糖 3.5mmol/L CaCl2·2H2O 0.7mm0l/L KH2PO4
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
大连理工大学
原生质融合
环境与生命学院
• 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证 明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法：
• PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效 应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质 体融合得以完成。
(9) 0.1% HgCl2
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4.实验步骤
环境与生命学院
• 溶液及培养基的配制
• 黄瓜无菌苗的培养
➢ 精选饱满的黄瓜种子，浸种20～30min后，用0.1% HgCl2表面消毒8～10min，无菌水洗涤4～5次，剥皮， 种子接入1/2MS培养基中。置于温度25±2℃，光照度 1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养。培养时间约1周。
27．2 mg／L
KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L
CaCl2·2H2O 246．0 mg／L
MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L
CuSO4 13％ W／V甘露醇
pH 6.0
(4)20％蔗糖溶液 (5)黄瓜种子萌发与生根培养基 （固体）：1/2MS（注：MS无 机成份减半，蔗糖0.2%,琼脂 0.7%） (6)黄瓜原生质体形成愈伤组织培 养基(固体和液体)： MS+0.05mg/L NAA+1mg/L BA (7)黄瓜原生质体愈伤组织分化培 养基(固体)：MS+5mg/L NAA (8) 无菌蒸馏水
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1.实验目的
• 了解植物原生质体分离、融合和培养的基 本原理。
• 掌握植物原生质体分离、融合和培养的基 本过程。
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2.实验原理
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概述
• 物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义， 它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为 作物改良的有力工具之一。
• 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露 细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离 原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要 由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
• PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水 化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可作为邻近原 生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可 在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接 在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从 而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高 了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
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➢ 用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗 糖溶液)，放入另一干净的离心管中．加4ml l3％CPW洗液，1000rpm离心 2-5分钟，弃上清．用血球计数板调整原生质体密度为105一106/ml之间。
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3.实验材料、用品
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– 实验材料：黄瓜种子。
– 实验用品： ①实验器具：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解 剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤 器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、 超静工作台。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
• 原生质体融合
➢ 将1-2滴原生质体混合物（密度分别为105一106/ml）滴 入小培养皿，静置8—10分钟。相对方向加入2滴40％的 PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、 三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸 干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l一2次 即可进行培养：
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
大连理工大学
环境与生命学院
原生质体融合后培养
• 原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上 应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动 细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织 或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的 培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是 最关键的环节。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
Fra Baidu bibliotek
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环境与生命学院
• 原生质体的分离
➢ 取黄瓜无菌苗子叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上（60～70rpm），在 25～28℃黑暗条件下，酶解5～7h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。 在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3～ 4ml l3％CPW洗液，相同 条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗 液吸也，轻轻铺于20％蔗糖溶液上(5ml离心管装3m120％蔗糖溶液)，在 1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态 好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与13％ CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管 底。
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②试剂：
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(1)酶液
(2)PEG融合液
(3)13％CPW洗液
1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L甘露醇
0.7mmol/LKH2PO4 10mmol/LCaCl2·2H 2O pH6.8—7.0
40% PEG (MW 1500-6000) 0.3 mol/L葡萄糖 3.5mmol/L CaCl2·2H2O 0.7mm0l/L KH2PO4
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• 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证 明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法：
• PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效 应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质 体融合得以完成。
(9) 0.1% HgCl2
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
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4.实验步骤
环境与生命学院
• 溶液及培养基的配制
• 黄瓜无菌苗的培养
➢ 精选饱满的黄瓜种子，浸种20～30min后，用0.1% HgCl2表面消毒8～10min，无菌水洗涤4～5次，剥皮， 种子接入1/2MS培养基中。置于温度25±2℃，光照度 1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养。培养时间约1周。
27．2 mg／L
KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L
CaCl2·2H2O 246．0 mg／L
MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L
CuSO4 13％ W／V甘露醇
pH 6.0
(4)20％蔗糖溶液 (5)黄瓜种子萌发与生根培养基 （固体）：1/2MS（注：MS无 机成份减半，蔗糖0.2%,琼脂 0.7%） (6)黄瓜原生质体形成愈伤组织培 养基(固体和液体)： MS+0.05mg/L NAA+1mg/L BA (7)黄瓜原生质体愈伤组织分化培 养基(固体)：MS+5mg/L NAA (8) 无菌蒸馏水