原生质体的分离、融合与培养

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植物原生质体的分离及融合

植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。

细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。

2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。

本实验用PEG诱导原生质体融和。

PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。

PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。

当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子。

Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。

高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。

普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。

PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。

二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。

（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。

（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。

（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。

修改第八章原生质体培养和融合

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使用的酶主要有：纤维素酶(Cellulase)、果胶酶(Pectolyase)、离析酶(Macerozyme )、半纤维素酶(Hemicellulase) 崩溃酶(Driselase)，其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。
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酶液中的渗透压是原生体分离的另一个因素，植物细胞去壁后，必须由合适的渗透压替代细胞壁维持的机械压力，酶液中的渗透压过低会使细胞吸涨而破裂；渗透压过高，细胞除受到渗透压力而破裂外，还会损害细胞生长代谢。
培养基，将适当密度的原生质体悬浮液加在含琼脂的培养基上。液层较浅，有利于通气，而且固体培养基中的养分可以释放到液层中去，以补充培养物对养分的消耗。另外培养物中的代谢产物对原生质体的生长不利，可以为固体层所吸收，降低或消除毒害。
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13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体纯化(以柑桔原生质体为例，界面法)
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果胶酶和纤维素酶
过滤、离心
原生质体制备流程（以叶片为例）图
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第二节原生质体的培养
一、原生质体培养的方法 1. 液体培养
培养基中不加凝固剂，仅仅用液体培养基按所需植板密度重悬原生质体后，直接植板在培养皿中即可。液体浅层培养法是目前原生质体培养中广泛应用的方法之一。优点：操作简便，对原生质体伤害小，有利于通气。缺点：容易使原生质体互相粘连、聚集，导致原生质体损坏；并且难于定点观察监测单个原生质体的发育过程。
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***沉降法：利用密度不同沉降速率不同的原理，低速离心使原生质体沉于离心管底。此法方便，但不易除尽一些完整的细胞或破碎的原生质体。 ***界面法利用原生质体和破碎细胞比重不同，低速离心条件下完整的原生质体漂浮于密度不同的两相分界处，碎片留在低层相中，可从两相界面收集到高纯度原生质体。

实验五植物原生质体的分离和培养

实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。

实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。

在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。

植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。

分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。

其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。

原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。

酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。

渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。

酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。

游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。

实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。

2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。

⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。

细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。

三、试剂1. 70％酒精。

2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。

3. 灭菌蒸馏⽔。

4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。

5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。

4原生质体培养和融合

• 原生质体纯化方法有：离心沉淀法漂浮法接口法
1、离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。
步骤： • 第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。 • 第二步：离心（500~1000r/min离心5~6min）。 • 第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）
重新悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。 • 第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生
对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维素酶，果胶酶(0.2％-0.5％); 酶量少
对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大酶液PH值：5.4 - 5.8
PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多
2.3 酶液渗透压
• 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。
•常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。
目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。
2.4 材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理)
在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，预质壁分离约一小时后再用酶液处理。
2-6 其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
2-7 原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例）
• 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
• 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块
• 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6

原生质体无菌分离培养与融合

然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面). (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处，
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4）和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处，酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

原生质体融合操作方法

原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。

在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。

以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。

用酶类解除细胞壁以获得原生质体。

2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。

3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。

4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。

5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。

需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。

在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。

原生质体的分离与融合

原生质体融合技术体系大致包括三大环节：
02
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。自然融合（Spontaneous fusion）来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
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压、酶解时间、温度等。
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组织和细胞材料的生理状态
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植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
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的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
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容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
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体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种

原生质体培养与融合

飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。优点：可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。所用药品简单，成本低。缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。细胞壁再生细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个细胞的细胞团 15d形成细胞团

影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率常显著提高。
渗透压稳定剂培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础改进的。

渗透压稳定剂

原生质体培养及融合

要是原生质体，可以采用下述两种方法进行进一步的纯化。
主要方法：漂浮法、界面法和沉降法等。
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A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片下胚轴
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五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、固－液双层培养
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1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
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4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
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胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
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细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体小原生质体（核质体）胞质体
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原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生成为杂种植株的技术。

原生质体的分离和培养

时间 30min-------20h
4.木、草本植物使用时间不同
5.时间 4~24h 1g材料+10ml
二原生质的培养
1.过程:原生质---细胞再生---细胞分裂--细胞团芽和根
2.培养方法
细胞植板法半固体培养基琼脂糖
优点:位置固定,方便观察琼脂上细胞不易分裂可降低渗透压
多用液体培养基: 可更换培养基可降低细胞密度
----胚状体---植物
方法:(1)原生质悬浮液0.5ml,置于10mm×100mm的小管中;
(2).加入贮于00C,含2mg/L的 FDA的丙酮溶液成质量分数为0.01%,混匀;
(3).置于室温下5min后
用荧光显微镜观察
有活力: 荧光无活力:无荧光
2.检测细胞壁是否除净荧光增白剂
用荧光显微镜观察培养基
有细胞壁绿色荧光
无细胞壁:红色
将纯化后收集的原生质加入0.1%--0.05%的荧光增
白剂,染色5~10min.离心3min,再用0,7mol/L甘露洗去
多余染料,如此重复3次.
1.营养成分无机盐有机物
激素
条件培养基:将生长迅速的细胞在液体培养基中培养一段时间,除去细胞后收集的培养基.
Ph值 5.6~5.8
2.原生质体的培养方法
2.酶解:
苄烷铵0.1%+酒精10%-- 5min 01
1.表面消毒:
60%~70%酒精消毒30s--- 0.1%HgCl2- 无菌水冲洗 3~5次 02 撕去叶片下表皮(向下)--- 漂浮于酶液中----------------纤维素酶:消化细胞壁纤维素
酶的选择: 静止轻摇易获得酶处理简便
酶解法:漆斑霉产生的纤维素酶(粗制剂)---分离番茄根尖细胞原生质体

第五章植物原生质体的分离与培养

原生质体融合二杂种细胞的选择与细胞杂种的鉴定体细胞杂种的鉴定这种鉴定不但在于确认细胞杂种的杂种性而且必须弄清楚融合亲本的双方各贡献了哪些遗传成分因为在杂种细胞发育成完整植株的过程中往往有一方的染色体更易消减掉
第五章植物原生质体的分离、培养与杂交
杨柏云
南昌大学生命科学与食品工程学院
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值得注意的是，在考虑分离植物原生质体时，既要采用容易获得原生质体的植物材料，但更重要的是要选用易于再生完整植株的细胞。
详见图2
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四. 植物原生质体的分离和纯化
(一) 原生质体的分离旱在1892年就有人用机械法分离原生质
体。直到1960年，英国的科金(Cocking) 首先采用酶解法分离原生质体，这一重要发现开辟了细胞工程研究的许多领域，作出了巨大的贡献。
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五. 影响原生质体分离的几个因素
1.材料不同其细胞壁的组成和结构也有差异。因此分解细胞壁的酶的种类和浓度也不相同，如分离根尖细胞的原生质体要有较多的果胶酶。
2.渗透压稳定剂的种类和浓度也因材料不同而有变化。
3.在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的稳定性。
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(三) 原生质体的活力测定
用于培养和细胞工程操作的必须是健康的有活力的原生质体。
方法有二：
一是凭借形态可识别原生质体的存活性。二是采用特异的染色方法来确定，可用 0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色；最好是采用荧光素双醋酸酯 (FDA)染色。有活力的原生质体带有荧光，无活力的不产生荧光。

原生质体分离与融合

原生质体的分离、融合与培养一、实验目的1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。

2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。

3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。

PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

三、实验材料、试剂与仪器1．材料新鲜的菠菜叶片2．试剂（1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。

（2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。

（3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。

植物原生质体的融合

倒置显微镜的操作

1.开机：接连电源，打开镜体下端的电控开关。 2.准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。 3.调节光源：推拉调节镜体下端的亮度调节器至适宜。通过调节聚光镜下面的光栅来调源的大小。 4.调节像距：转三孔转换器，选择合适倍数的物镜；更换并选择合适的目镜；同时调节升降，以消除或减小图像周围的光晕，提高了图像的衬度。 5.观察：通过目镜进行观察结果；调整载物台，选择观察视野。 6.关机：取下观察对象，推拉光源亮度调节器至最暗。关闭镜体下端的开关，并断开电源。旋转三孔转换器，使物镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。实验用品
原生质体的融合
融合法

高Ca高pH法和电融合法： PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子， Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用
植物原生质体分离及融合
实验目的
实验原理实验用品的原理，掌握原生质体的分离及融合的操作方法。

植物原生质体的分离与融合

植物原生质体的分离与融合第一部分：综合性实验（供同学们学习参考）甘蓝与紫甘蓝原生质体的分离与融合植物原生质体由于已去除了细胞壁，它能够像动物细胞一样，在人为的条件下互相融合，获得细胞杂种植株。

如果用近缘种内或种间的原生质体融合、可以获得稳定的、具有双亲两套染色体的细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种的种质材料；如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，不仅克服了远缘杂交不亲和性，而且可以扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，甚至产生新种。

要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。

目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

1.酶：分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

2.渗透稳定剂：植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。

去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。

因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同。

3.植物材料：一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。

但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。

材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。

4.酶溶液的pH值：对原生质体的产量和生活力影响很大。

一般为5-7。

酶的活性还与pH值有关。

Onoznka纤维素酶R－10最适宜pH值为5～6。

不过实际上酶溶液的pH值经常调节4．7～6．0之间。

对于不同的材料、不同型号的酶其所要求的最适值是不同的，应通过实验确定。

5.温度：对酶解效率有影响和植物原生质体得活力都有影响。

酶：40-50摄氏度，适于植物材料的温度一般都在25℃，所以一般在25℃左右进行酶解。

试剂的配制：1、pH5.7的磷酸钾缓冲液10 mL：A液：称取0.272g KH2PO（0.2mol/L4，溶于蒸馏水中，定容至10 mL。

--细胞生物学原生质体的分离与融合综合性实验报告

细胞生物学综合性实验课程名称: 细胞生物学实验姓名:班级:学号:时间: 年月日植物原生质体的分离、纯化及融合1 材料、试剂与方法1.1材料菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。

1.2 试剂5%次氯酸钠,无菌水,酶液A,0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液,20%蔗糖溶液，0.16 mol/L的Cacl2.2H2O溶液，酶液B,12%蔗糖溶液，PEG溶液，高PH高钙稀释液。

1.3方法1.3.1菠菜叶片和金盏菊花瓣的消毒处理称取金盏菊花瓣1.5g或菠菜叶1g,用自来水冲洗;分别用5%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用无菌水洗4次。

1.3.2 原生质体的分离1.将消毒后的金盏菊花瓣用镊子撕成细丝。

2.酶解：加5ml酶液A,封口，保持28℃,3-6小时。

3.过滤及离心：600r/min离心5min,弃去上清液保留沉淀。

1.3.3 原生质体的纯化1.将沉淀用2ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。

2.用注射器缓缓向离心管底部6ml 20%蔗糖溶液,600r/min离心5min,得到原生质带。

3.用注射器吸出管底杂质和蔗糖及上部Cacl2.2H2O溶液。

4.留下的原生质带用5ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮, 600r/min离心5min。

5.用3ml 0.16mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。

1.3.4 原生质体的融合1.将菠菜叶和金盏菊的原生质体悬液等量混合。

2.用吸管将混合的原生质体混合液滴在培养皿中，7-8滴每皿，静置10min,使其贴壁。

3.用吸管将等量的PEG溶液滴在原生质液滴上，静置10-15min 观察细胞的粘连。

4.用刻度吸管向原生质液滴慢慢加入高PH高钙稀释液。

第一次0.5ml,第二次1ml，第三四次各2ml,每次间隔5min。

5.平皿微倾斜，吸取上清液，缓缓加入4ml高PH高钙稀释液,静置5min后弃去上清液。

6.加入MS培养基4ml, 静置5min后弃去上清液。