免疫荧光双染

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免疫组化-双重染色

免疫组化-双重染色免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。

此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。

目前，最常用的是最后一种方法。

不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。

但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。

在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。

即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。

该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。

试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。

2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。

3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。

然后测pH值使之在7.2—7.6。

如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。

4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。

免疫荧光双标操作方法及注意事项

在统一组织细胞标本上须要同时检测两种抗原时,需进行双重荧光染色.双重免疫荧光标识表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法.(1)直接法双重免疫荧光标识表记标帜：将标识表记标帜有两种不合荧光素的抗体(如抗A和抗B)以恰当比例混杂,滴加在标本上孵育,然后洗去未联合的荧光抗体,在荧鲜明微镜下分离选择两种响应的激发滤片不雅察,即可对两种抗原进行定位和定量.直接法简即靠得住,但敏锐度较低.(2)间接法双重免疫荧光标识表记标帜：用未标识表记标帜的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞,洗去过剩的第一抗体后,再用两种不合的荧光素分离标识表记标帜的第二抗体孵育组织或细胞,洗去过剩的第二抗体,后在荧鲜明微镜下分离选择两种响应的激发滤片不雅察,从而对两种抗原进行定位和定量.运用此法应留意两种特异性第一抗体必须起源于不合种属,且荧光标识表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光双标技巧中操纵要点和留意事项一.免疫荧光技巧中标本制造的根本程序近似于酶免疫组化,不合点如下： 1.免疫荧光不须要运用双氧水处理,关闭和一抗孵育与其雷同. 2.免疫荧光的二抗运用不合荧光标识表记标帜的二抗孵育,孵育时光依据抗体的工作浓度肯定. 3.二抗孵育之后充分洗片后即可贴片.封片和不雅察. 4.免疫荧光在封片时常运用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1).前提允许,建议购置抗淬灭的封片液,使标本可以保管更久. 5.荧光抗体的孵育以及后续处理须要避光. 6.荧光抗体染色假阳性可能会多,须要分离设定阳性和阴性对比.二.留意事项 1.荧光染色后一般在1h内完成不雅察,或于4℃保管4h,时光过长,可能会使荧光提前阑珊. 2.每次实验均需设置以下三种对比： (1) 阳性对比：阳性血清+荧光标识表记标帜物; (2) 阴性对比：阴性血清+荧光标识表记标帜物; (3) 荧光标识表记标帜物对比：PBS+荧光标识表记标帜物.三.免疫荧光双标的经验之谈 1.拔取一抗时,请求起源于两种不合的动物,我用的是起源于家兔和大鼠的抗体,二抗则是不合荧光旌旗灯号标识表记标帜的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红). 2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度.孵育时光要自我探索,我感到一抗4℃孵育留宿比较好,布景比较清楚. 3.我的阳性对比采取的是阳性组织切片,阴性对比则分离是家兔和大鼠的IgG,荧光标识表记标帜物对比是PBS+荧光标识表记标帜物. 4.关闭血清是二抗起源动物的正常血清,我用的是10%正常donkey血清. 5.其余事项同免疫荧光单标操纵.免疫组化双重染色办法和步调在生物医学和临床研讨实践中,经常须要检测两种不合物资是否在统一样品中共存或统一种细胞中共存,是以消失了免疫组织化学双重染色.此办法有几种类型,包含免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法联合;统一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色,阳性部位摄影,再用酸处理使抗原抗体解离,继之,对第二种抗原染色.摄影);两种酶标抗体3又重染色(分离用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标识表记标帜第二抗体.用间接法分离显示A和B抗原,如两种一抗来自统一种属,常有重叠染色);不合种属起源的抗体双重染色.今朝,最经常运用的是最后一种办法.不合种属起源的抗体双重染色,两种抗体间无交又反响.特异性较高,即使细胞内抗原量很少也能检测.但是,当两种抗原消失于统一部位而个中之一浓度较高,占绝对优势时将妨害另一种抗原染色,此种情形应分离染色,起首染色含量较少的抗原,再显示含量丰硕的抗原.在该办法中运用最多的是把SABC法或SP法的实验流程反复两次,个中两种不合特异性抗体(可所以小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合),与一抗对应的不合种属生物素化二抗和两种不合显色体系.即可将不合部位或雷同部位的两种抗原显示出来.该办法用于白腊切片时应斟酌所选择的两个抗体的修复办法应当一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色成果没有影响.SP法双重染色步调1～6步调与SABC法雷同,但无需运用生物素阻断剂：7.切片参加A特异性抗体(如兔抗A抗体),4=C留宿孵育后,PBS冲洗3次,每次5分钟8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗),室温孵育切片10分钟,继而PBS冲洗3次,每次5分钟;9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶,室温孵育10分钟,PBS冲洗3次,每次5分钟10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次,每次5分钟;11.滴加0.05%盐酸,室温10分钟(可防止已显色的抗原褪色);12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清,37~C孵育10分钟;13.滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体),4~C留宿孵育.PBS冲洗3次,每次5分钟;14.滴加生物素化抗小鼠二抗,室温孵育切片10分钟.PBS冲洗3次,每次5分钟：15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶,室温孵育10分钟,PBS冲洗3次,每次5分钟16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次,每次5分钟17.苏木精复染细胞核;18.水溶性封片剂封片. 在运用SP法双重染色之前须要看待测抗原的性质.二抗的种属类型和显色体系进行具体设计.购置免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计计划雷同的配套试剂.在选择一抗时应防止定位在细胞的统一部位(如胞核.胞浆和胞膜)的两种抗原,假如不成防止,最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色办法,因为两种不合色彩的荧光重叠后呈现另一种色彩的荧光(如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光),它比SP 法的显色体系更轻易差别和辨认阳性成果. 在进行双重染色之前,必须对所选择的一抗分离进行单独染色预实验,预实验前提必须与双染前提雷同,在不雅察预实验成果和抗体定位准确后,再进行双染实验.。

免疫荧光双染和细胞化学DAB染色步骤

制备细胞爬片1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。

再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。

将培养皿（6孔细胞培养板）置于37℃，含5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。

2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。

3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。

4、倾去培养液，加PBS（PH 7.2～7.4）洗涤细胞爬片2 次，每次1 min。

5、加10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮）固定10～15min。

6、吸除固定液，加PBS 再洗涤细胞爬片3 次，每次5 min。

7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。

8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。

将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。

免疫荧光双染用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案1)冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定10～15min。

（细胞爬片固定后，以下步骤一样）2)漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。

PBS液是用来漂洗和稀释的。

其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。

3)在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。

（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟4)阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。

（37℃）（一抗前不洗，只甩干）5)原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化60分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。

免疫荧光双染

免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce nee labeli ng method）也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤1、？冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、？破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?（TdT）? 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、?BSA封闭:将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、？加二抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min 。

8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS( PH7.4)洗涤3次，每次5min。

去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。

免疫荧光细胞化学双重染色法

免疫荧光细胞化学双重染色法
原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白―{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet―1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共聚焦显微镜观察)
1．一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B)，按直接法进行染色。

2．二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。

在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。

例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG 和生物素化―抗兔IgG。

进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。

孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。

其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。

此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。

换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。

若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项免疫荧光双标技术（Immunofluorescence Double Staining Technique）是一种常用于生物医学研究中的实验技术，通过检测特定抗原和抗体的结合情况，可以对细胞或组织中的蛋白质进行定位和表达研究。

在进行免疫荧光双标实验时，为了确保实验结果的准确性和可靠性，有几个操作要点和注意事项需要特别关注和遵守。

一、试剂准备在开始实验之前，需要准备好以下试剂：1. 抗体：根据实验需要选择适当的一抗和二抗。

一抗用于识别待检测的抗原，二抗则与一抗结合形成免疫复合物，发出荧光信号。

2. 样品：包括细胞、组织等待检测的样品。

3. 荧光染色试剂：根据实验需要选择适当的荧光染色试剂。

常用的有荧光染料如荧光素、多聚荧光素等。

4. 细胞或组织培养基：提供细胞或组织的生长和营养。

二、标本处理1. 样品固定：使用适当的固定液对细胞或组织样品进行固定，一般常用的固定液有乙醛或甲醛。

2. 膜通透：使用适当的溶液对固定后的样品进行膜通透处理，常用的膜通透液有Triton X-100等。

三、抗体反应1. 一抗孵育：将适当稀释的一抗添加到样品中，充分反应一段时间，使一抗与待检测的抗原结合。

2. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的一抗。

3. 二抗孵育：将适当稀释的二抗添加到样品中，与已结合的一抗形成免疫复合物。

4. 再次洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的二抗。

四、荧光染色和观察1. 加入荧光染色试剂：将所选的荧光染色试剂加入样品中，使其与免疫复合物结合。

2. 温度和时间控制：根据荧光染色试剂的要求，控制反应温度和时间，确保荧光信号的强度和稳定性。

3. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的荧光染色试剂。

4. 观察和分析：使用荧光显微镜观察样品，记录和分析荧光信号的分布和强度。

注意事项：1. 试剂保存：保持试剂的储存条件和有效期，使用前检查试剂的颜色和透明度，避免使用已失效的试剂。

双标记免疫荧光染色

双标记免疫荧光染色一、实验目的：1.检测MT, IGF-1/FGF5与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。

2.检测目的基因所表达的蛋白定位。

3.检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。

二、实验材料：1.试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛－地高辛抗体，生物素－链霉亲和素）细胞核染料DAPI2. 器材：激光共聚焦显微镜显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。

三、实验步骤：1.细胞培养：取对数期细胞于6孔板培养24小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要24小时，细胞数目达到4×104个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组；2.实验组加药处理：加入MT或IGF-1或FGF5处理24小时或48小时，72小时。

3.上镜前处理：将玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min；PBS洗多次，加0.1%Triton-X100透化10min；PBS洗3次，5%FBS室温封闭一到数小时；PBS洗3次，将MT、FGF-5、IGF-1抗体(1：200)和目的基因(工作液)两两组合，共六组，按体积比1：1混匀，一起加到切片上，4℃过夜；第二天，PBS洗3次，加入荧光二抗[加入TRITC(罗丹明)标记羊抗兔IgG(1：100)；37℃孵育30 min；加人FITC标记山羊抗鼠IgG(1：100)]，室温避光45min；（之后均为避光操作）PBS洗3次，加入核染料，n分钟；PBS洗3次，灭菌水洗2次；取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约30ul防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。

以PBs代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。

4.镜检四、结果预测：1.共表达：两个基因分别为阳性红色，绿色。

共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。

2.正负表达：看荧光强弱。

免疫荧光双染技术原理

免疫荧光双染技术原理
免疫荧光双染技术原理主要基于免疫学和生物荧光学的结合。

首先，通过抗原抗体反应的特异性，将针对特定靶抗原的一抗（primary antibody）与
组织或细胞结合，形成抗原-抗体复合物。

其次，利用二抗（secondary antibody）与一抗的结合，将荧光标记的小分子（荧光素）连接到二抗上，形成荧光抗体。

这样，一抗的特异性识别与二抗的荧光标记相结合，就可以在荧光显微镜下观察到组织或细胞中的靶抗原，并对其定位和分布进行详细的分析。

以上内容仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更全面和准确的信息。

荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求

荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验是一种常见的细胞生物学研究方法，它可以用于检测细胞内的蛋白质表达水平、定位细胞器分布以及研究信号通路等。

在进行荧光双染实验时，一抗和二抗的选择是非常重要的，因为它们直接影响到实验结果的准确性和可靠性。

本文将从理论和实践两个方面，详细介绍荧光双染实验中一抗和二抗选择的基本要求。

我们来了解一下一抗和二抗的概念。

一抗(Antibody 1)是指用于检测特定抗原的单克隆抗体，它可以与抗原结合并形成免疫复合物，从而实现对抗原的定量或定位。

二抗(Antibody 2)是指与一抗互补的单克隆抗体，它的特异性可以增强一抗的亲和力和信号强度，从而提高实验的灵敏度和特异性。

在荧光双染实验中，选择合适的一抗和二抗是保证实验结果的关键。

以下几点是进行一抗和二抗选择的基本要求：1. 一抗和二抗的特异性要强特异性是指一抗和二抗只能与目标抗原或靶蛋白结合，而不能与其他分子发生反应。

为了保证实验的准确性和可靠性，一抗和二抗的特异性必须很强。

这可以通过对比不同一抗和二抗对同一样本的检测结果来实现。

如果大部分样本都能被一种特定的一抗和二抗识别并结合，那么这种组合就是具有较强特异性的。

2. 一抗和二抗的亲和力要适中亲和力是指一抗和二抗与目标抗原或靶蛋白结合的能力。

亲和力过低会导致一抗和二抗无法结合到目标抗原或靶蛋白上，从而影响实验结果；亲和力过高则可能导致过度结合，使得信号强度降低，影响后续分析。

因此，在选择一抗和二抗时，需要找到一个适中的亲和力值，使得它们能够有效地结合到目标抗原或靶蛋白上，同时又不会导致信号强度过低。

3. 一抗和二抗的稳定性要好稳定性是指一抗和二抗在储存和使用过程中是否会发生结构变化或失活。

如果一抗和二抗不稳定，那么它们的性能就会受到影响，从而导致实验结果不准确。

因此，在选择一抗和二抗时，需要考虑它们的稳定性，尽量选择那些经过严格质控、储存条件稳定的产品。

4. 一抗和二抗的价格要合理虽然一抗和二抗的质量非常重要，但价格也是一个不容忽视的因素。

免疫荧光双标染色法意义

免疫荧光双标染色法意义在生物医学研究领域，免疫荧光双标染色法是一项重要的实验技术。

该方法通过同时检测两种不同的标记物，帮助科研人员更深入地了解细胞或组织中的复杂生物过程。

本文将详细介绍免疫荧光双标染色法的意义及其在科研中的应用。

一、免疫荧光双标染色法简介免疫荧光双标染色法是一种基于荧光标记的免疫组化技术。

它通过特异性抗原与抗体结合，利用荧光染料标记的抗体来显示细胞或组织中的特定分子。

与传统的免疫组化染色方法相比，免疫荧光双标染色法具有更高的灵敏度和更广的适用范围。

二、免疫荧光双标染色法的意义1.同时检测两种不同的标记物免疫荧光双标染色法最大的优势在于可以同时检测两种不同的标记物。

这在研究细胞或组织中的复杂生物过程时具有重要意义。

例如，在研究肿瘤细胞与免疫细胞相互作用的过程中，可以同时检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，从而更深入地了解两者之间的关系。

2.精确定位细胞内分子免疫荧光双标染色法具有较高的空间分辨率，可以精确定位细胞内分子。

这有助于揭示细胞内分子之间的相互作用和信号传递路径，为疾病发病机制的研究提供有力支持。

3.提高实验效率免疫荧光双标染色法可以在同一实验中同时完成两种标记物的检测，大大提高了实验效率。

此外，该方法操作简便，实验周期较短，有利于科研人员快速获得实验结果。

4.适用于多种样本类型免疫荧光双标染色法适用于多种样本类型，如细胞爬片、组织切片、细胞悬液等。

这为科研人员提供了广泛的实验选择，有助于研究不同类型的生物样本。

5.可视化细胞动态过程通过免疫荧光双标染色法，可以实时观察细胞内分子的动态变化，如细胞迁移、细胞凋亡等。

这有助于揭示细胞在生理和病理过程中的重要作用。

三、免疫荧光双标染色法在科研中的应用免疫荧光双标染色法在生物医学研究中具有广泛的应用，如：1.肿瘤研究：通过检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，研究肿瘤微环境中的相互作用。

2.神经科学研究：揭示神经元之间的联系和信号传递机制。

免疫荧光双标操作方法及注意事项之欧阳美创编

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。

直接法简便可靠，但灵敏度较低。

(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。

使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。

条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

免疫荧光双染完整版

免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

免疫荧光双染

免疫荧光双染 Revised by Hanlin on 10 January 2021免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。

将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求

荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求，听起来好像很高大上，但其实也就是让我们的实验结果更清晰、更有说服力。

那么，我们该如何选择合适的一抗和二抗呢？接下来，就让我用简单易懂的语言给大家科普一下吧！我们要明确什么是一抗和二抗。

在荧光双染实验中，一抗就是用来检测我们想要研究的蛋白质的第一种抗体，而二抗则是用来检测我们想要研究的蛋白质的第二种抗体。

它们就像是我们的“眼睛”，帮助我们看清楚实验结果中的细节。

那么，如何选择合适的一抗和二抗呢？这里有两个基本要求：一是尽量选择特异性高、灵敏度高的抗体；二是尽量选择与我们想要研究的蛋白质结合良好的抗体。

下面，我分别给大家详细介绍一下这两个要求。

1. 尽量选择特异性高、灵敏度高的抗体特异性是指一抗只能识别我们想要研究的蛋白质，而不会误识别其他蛋白质。

灵敏度是指一抗能够检测到我们想要研究的蛋白质的能力。

这两个要求都很重要，因为如果一抗的特异性和灵敏度不高，那么我们的实验结果可能会被其他蛋白质的影响所干扰，从而导致结果不准确。

那么，如何判断一抗的特异性和灵敏度呢？这里给大家一个小技巧：可以先用一些已知特异性和灵敏度较高的一抗进行初步筛选，然后再根据我们的实验需求进行优化。

这样，我们就可以尽量选择到特异性高、灵敏度高的一抗了。

2. 尽量选择与我们想要研究的蛋白质结合良好的抗体结合良好意味着一抗能够与我们想要研究的蛋白质紧密地结合在一起，从而不会被其他蛋白质的影响所干扰。

这样，我们就可以更准确地检测到我们想要研究的蛋白质了。

那么，如何判断一抗与我们想要研究的蛋白质结合得好不好呢？这里也给大家一个小技巧：可以先用一些已知与目标蛋白结合良好的一抗进行初步筛选，然后再根据我们的实验需求进行优化。

这样，我们就可以尽量选择到与我们想要研究的蛋白质结合良好的一抗了。

当然啦，选择合适的一抗和二抗并不是一件容易的事情，需要我们不断地尝试和优化。

但是，只要我们遵循上述的基本要求，相信我们一定能够找到最适合我们的一抗和二抗的！荧光双染实验一抗和二抗的选择是非常重要的，它关系到我们的实验结果是否准确。

双重免疫荧光细胞化学标记方法

双重免疫荧光细胞化学标记方法双重免疫荧光细胞化学标记方法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色。

一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A或抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TM—RITC或RB200标记或PE标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。

在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗丹明标记，可采用以下染色方法：1．一步法双重染色方法先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。

2．二步法双染色方法先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A 抗体染色，按间接法进行。

结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。

激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。

调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。

主要用途：1．细胞及生物荧光样品观察分析。

2．绿荧光蛋白分析。

3．荧光原位杂交分析。

4．光切片扫描。

5．3D图像处理。

6. 时间序列拍摄成像.。

免疫荧光双标操作方法及注意事项

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。

直接法简便可靠，但灵敏度较低。

使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。

条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

双重免疫荧光细胞化学标记方法

双重免疫荧光细胞化学标记方法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色。

2．二步法双染色方法先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。

结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。

调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

主要用途：1．细胞及生物荧光样品观察分析。

2．绿荧光蛋白分析。

3．荧光原位杂交分析。

4．光切片扫描。

5．3D图像处理。

6. 时间序列拍摄成像.。

免疫组化双重染色技术

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大鼠垂体前叶GnRH相关肽阳性细胞(左, 蓝色)与促性腺激素细胞 (右, 棕色)为同一种细胞, 免疫酶(PAP法)双重染色.
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B. 双酶法: 1. 原理: a. 用两种无关的酶分别标记显示两种抗原, 常用的酶为HRP 和AKP, 或HRP和葡萄糖氧化酶. b. 两种一抗来源于不同种属的动物, 如兔和小鼠, 或同种动物(如小鼠)的两种单克隆抗体, 但其Ig亚类不同, 如IgGl和 IgG2a. c. 两种二抗分别是抗兔IgG和抗小鼠IgG, 或抗小鼠IgGl和抗小鼠IgG2a. 可以来自同种属动物或不同种属动物, 可以是酶标抗体(一个用HRP, 另一个用AKP标记), 也可以是未标记抗体(一个用兔PAP, 另一个用小鼠APAAP).
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三. 免疫酶双重染色 A. 单酶法: 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同的电子供体如 DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两种一抗来自同种属动物, 两重染色之间需将第一次染色反应中的各级抗体和酶或各级抗体, 酶和反应产物从组织上洗脱. c. 连续做两次染色, 所费时间较长.
免疫组化双重染色技术
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二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗体, 染色后观察, 相应的抗原物质显示不同的颜色. A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490~495→520~530nm, 黄绿色荧光)和TRITC (550→620nm, 红色荧光)分别标记的两种抗体按一定比例混合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片.
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抗体, 酶和反应产物洗脱
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2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序: a. 先显示含量较少的抗原. b. 先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原. c. 先用不太敏感的抗体. d. 先用DAB显色. 4. 对照试验: a. 单染对照. b. 在进行第二次染色前, 要证明第一次染色的各级抗体和酶活性被完全除去, 而且洗脱后对第二个待检抗原无影响.