第七章 放射免疫分析技术和免疫放射分析技术

• （三）亲和常数Ka与剂量反应曲线的关系
• 免疫放射分析技术（IRMA）： • 主要原理是一种标记抗体与有限量的抗原 结合，剩余的未结合的标记抗体再与固相 抗原结合而被分离。
Ag + Ab * Ag - Ab * + Ab *= Ag - Ab * + Ag - Ab * 固相 • 當Ag ，則Ag - Ab * ，故復合物Ag - Ab * 濃度與 • Ag含量成正相關。
[ AgAb*] B
2
[ Ag ] p
[ Ab*] q
代入上式
q 1 q B B(1 ) 0 p kp p
• 在IRMA的反应体系中标记抗体是过量的， B值即为放射性活度，可直接用cpm数表示， 为纵轴的单位，横轴与RIA一样是标准物的 浓度，两者是正相关，而RIA却是负相关， 这就体现了IRMA标准曲线剂量反应范围比 RIA大，灵敏度也可明显提高。 • 3、剂量反应曲线 • Yalow以胰岛素为例，与抗体（两个结合1 位点分别为Aba与Abb）相互作用，其反应 曲线图2.2,
• 4、准确度 • 准确度是指测量值与真值符合的程度。 • RIA和IRMA也都是以准确度为指标，来衡 量分析方法本身的质量。 • 准确度和精密度是两个独立的统计学指标， 因为有的分析尽管精密度很高，但准确度 不一定好，但如准确度很好，则精密度必 定也好。
• 5、稳定性 • 有放射免疫分析中，稳定性是指不同的时 期各批测定结果之间精密度的变异程度， 可用批间变异系数表示。 • 影响稳定性的因素主要是各种试剂在规定 的存放条件下，非特异结合（NSB）、最 大结合率（B0），回归系数，ED25， ED50，ED75值、质控血清测定值与标准 值的偏差等指标是否均在允许范围之内。
• 免疫放射分析技术 • 1986年Miles和Hales建立了免疫放射性分析法， 由于它应用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加 入过量的抗体，待测物（或标准品）和放射标记 抗体进行全量反应，故其灵敏度有明显的提高， 可提高6～10倍。 • 自单克隆抗体应用于免疫放射分析，使本法得到 了更快的发展，近几年来又引入亲和素－生物素 系统的放大作用，使得免疫放射分析的灵敏度有 明显的提高，国内外供应的超灵敏免疫放射试剂 盒就是利用此原理制成的。
K k1 [ AgAb] B B k2 [ Ag ][ Ab] F ([ Abt ] [ AgAb]) F ([ Abt ] B)
B / F K ([ Abt ] B)
B / F K[ Abt ] KB
• B/F对B作图，B为自变量，B/F为因变量， 所得斜率为亲和常数K，x轴截距为[Abt]，y 轴截距为K[Abt]，这就是Scatchard图。如 图2.1。
• IRMA的稳定性较好，当应用标记抗体的浓 度远大于1/K时，K的影响就很小了。因为 IRMA中标记抗体是过量的，无论温度、加 样误差和非特异性均影响很小，所以IRMA 的批内批间变异也都很小，这也是IRMA重 要优点之一。
• 6、有效性 • RIA和IRMA都有一个临床应用有效性的问 题，但往往强调方法学而忽视临床符合率。 实际上无论哪种分析方法，都是为临床应 用所制备的，如果失去这种意义，可以说 该试剂盒一无用处。为此对厂家来说应该 建立两个标准，一是试剂盒质量标准，二 是临床符合率标准。
[ Ag ] [ Aba ]
[ AgAba ]
[ Ag ] [ Abb ]
[ AgAbb ]
将得到
B/F=ka ([Aba ]-B)+k b ([Abb ]-B)
B Ba Bb [ AgAba ] [ AgAbb ]
在这种情况下，B/F对B作图是一条曲线
根据
B =k[Ab t ] 代入 F
(B/F)2+B/F(kAgt -kAbt +1)- kAbt =0
• 标准曲线：标准曲线可由B/F对Agt作图， 即为在放免分析中常用的标准曲线。 • 通过未知样品的B/F值，便可从曲线上读出 对应x轴上抗原浓度。 • 现工作中常用B/B0来表示，然后通过数学 模式来进行数据处理，可直接打印出求知 样品的测值。 • IRMA的测量反应曲线是根据下式来作图：
1 [ AgAb*]2 [ AgAb*]( Ag Ab * )[ Ag ][ Ab*] 0 k
[ AgAb*] B
[ Ag ] p
[ Ab*] q
代入上式
• 式中，k和q是固定值，B随p增多而增大，二者呈 双曲线关系，随着p的逐渐增大，q渐趋饱和，B 渐近q，而曲线达到坪区，如图2.3。
• 基本原理：标记抗原和待测抗原（或标准品）对 有限量的特异性抗体发生可逆的竞争结合反应， 最终形成的放射性复合物与被测抗原含量呈负相 关，所以也称为竞争性放射性免疫分析： Ag* + Ab Ag* - Ab + Ag- Ab Ag • 游离物(F) 复合物(B) 當Ab 含量為有限定量，則當Ag ， Ag- Ab ， Ag* - Ab
• IRMA中抗原抗体反应，其本质与RIA一样， 也服从质量作用定律，同样可从质量作用 定律推导数学式，不同的是Ab表示标记Ab （即Ab*）。
[ Ag ] [ Ab]
[ AgAb]
[ AgAb*] K ( Ag [ AgAb*])( Ab * [ AgAb*])
• 将上式展开
2
1 [ AgAb*] [ AgAb*]( Ag Ab * ) [ Ag ][ Ab*] 0 K
• 3、精密度 • 无论RIA或IRMA，都是以精密度来衡量分 析方法本身质量好坏的指标之一，亦称重 复性。它是对分析方法的随机误差的描述， 反映了用该分析方法对同一样品进行多次 测定时，测定值的标准差（s）和变异系数 （CV）来表示。标准差表示各个测定值与 均值的偏离程度，偏离度越大，表示均值 的代表性越小。
• 免疫放射技术突出的优点是：抗体易于碘 化标记，不改变抗原的免疫活性（因为抗 原不标记），反应速率快（因为抗原抗体 是全量反应），灵敏度高（测定从零的基 准开始，且引入了生物素－亲和素放大系 统）工作范围宽，特异性高（因为应用单 抗）、操作更简单（由于各种固相抗体的 使用）。
• 此法是利用标记抗体来测定待测抗原，为了与放射免疫分 析区别，故称免疫放射分析（immunoradiometric assay IRMA）,免疫放射分析的反应系统是非竞争性的全量反应， 故亦称非竞争性免疫分析法。 • 一、基本原理 • 放射性核素标记在抗体上，然后以过量的标记抗体与待测 抗原结合，未结合的标记抗体通过和固相的抗原免疫吸附 剂反应而除去，溶液中放射性与未知抗原浓度呈相关，这 是经典的IRMA法，近年来发展有双位点IRMA以及在双位 点IRMA基础上的标记第三抗体法，双标记抗体法和IRMA －BAS法等更为完善。IRMA法的基本数学模型同样遵循 质量作用定律，其式如下：
[ Ag ] [ Ab]
[ AgAb]
• F B • 式中，设[Ag]，[Ab], [AgAb]分别是抗原、 抗体、抗原抗体复合物（B），k1为结合常 数，k2为解离常数，K为反应到达平衡时的 亲和常数。[Abt]为抗体总浓度，F为游离物， B为结合物，B/F为两者比率，也称为竞争 结合率。 [Abt]= [Ab]+ [AgAb] [Ab]= [Abt]- [AgAb]
1 B 2 B ( p q ) pq 0 k
• IRMA剂量反应曲线，随抗体量的增加，抗 原量也需相应增加，标准线的斜率段也随 之伸延，这就扩大了可测的剂量范围。 • 一般RIA在剂量范围是二个数量级左右， IRMA可达到三个数量级以上。这时临床应 用很有意义。 • 例如TSH在甲亢症时，血中含量<1U/ml， 但TSH-RIA的最小可测值为>1U/ml，而 TSH-IRMA的灵敏度达到0.02U/ml，所以 TSH-IRMA就更适合应用诊断甲亢症。
• 又如hCG，在血中含量低到<1U/ml，但在 生理和病理情况又可增至>3000U/ml以上， 这样要求标准线的剂量范围很大，才能适 应临床。一般的RIA就要稀释标本来检测， 而hCG-IRMA，其剂量范围为 0.005~5000U/ml，这就完全适合临床要求 了。
• 二、放射免疫分析方法学指标 • 1、灵敏度 • 所谓灵敏度，一般用最小检出量来表示， 但也有用零剂量的精密度来表示的。实际 上无论用哪种方法表示，某种物质的RIA， 总得表示出最小检测量，才能达到临床应 用的要求。 • 在RIA中，标准曲线的斜率反映其灵敏度， 即刚好能与被测物浓度为零时区分开来的 量。而斜率与亲和常数K成正比。
Scatchard作图 Scatchard于1949年对化学反应进行数学 推导，以几何图形的方法叙述了化学反应 到达平衡时，游离物与结合物相互间的参 数，称之为Scatchard作图法。 抗原抗体反应是遵循质量作用定律的，因 此其反应式和数学推导，可沿用Sc• （b）2+{1+Ka· [Lo]-Ka[Bo]} · b-Ka[Bo]=0
• (一)上式与竞争性分析的数学模型基本相同，是 以b为函数的一元二次方程式，在直角坐标纸上， 几何图形也是双曲线，b值随Ka· [Lo]和[Bo]而变化， 在一给定的IRMA中，Ka为一常数，而[Bo]为过量 结合剂，[Lo]即待测抗原，b值随[Lo]值变化，b随 [Lo]变，[Lo]越大，b也越大。 • （二）标记抗体浓度对剂量反应曲线的影响 • 从图1－21可知，亲和常数Ka相同的抗体，抗体 含量越大，曲线欲达到饱和时需要更多的抗原， 这说明曲线的可测范围越宽。但应指出，由于标 记抗体量的增加，游离标记抗体也会增多，分离 时将有明显的分离误差，使NSB升高，因此测量 的灵敏度将下降，所以抗体最佳浓度应通过实验 来选择。
• 灵敏度的大小与K值有关，K值越大，灵敏 度超高。 • IRMA的灵敏度同样决定于零剂量时的斜率， 斜率同样和K成正比。 • IRMA的灵敏度要比RIA高。