实验一 微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色

实验一微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色
赵奕玲 121180169
一．实验目的
1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；
2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；
3．掌握芽胞染色的步骤要点；
4．识别细菌的革兰氏染色和芽胞染色的结果；
5．学习无菌操作技术。

二．实验原理
一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，通常为圆形或椭圆形。

芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较
困难。

因此，用着色力强的染色剂（如孔
雀石绿）在加热条件下进行染色时，染料
不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，
进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽
孢的染色的染料则难以透出，若再用复染
液（如沙黄水溶液）染色后，芽孢仍然保
留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的
颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色
易于区分。

三．实验器材
载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；
结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌
平板，大肠杆菌平板，牙垢。

四．实验步骤
（一）革兰氏染色
1.涂片
左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。

若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。

室温下自然干燥。

2.固定
手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。

要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

3.初染
滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。

4.媒染
用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。

5.脱色
用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。

脱色时间20~30秒。

6.复染
滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗，干燥。

7.镜检照相
（二）芽胞染色
1.将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。

2.滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。

3.用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。

加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。

这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6%）染10分钟。

4.倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

5.用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。

6.待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

注意
1.选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。

2.加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。

五．实验结果及分析
6张装片的实验结果见表1：
图片结果：
1.金黄色葡萄球菌的简单染色
简单染色可见金黄色葡萄球的基本形态，但是细菌之间存在很多牵连，有可
能导致这样结果的原因有：1.因为金黄色葡萄球菌彼此成团，涂片的时候容易没
有涂开；2.染色结束后对染色剂的漂洗不够。

2.革兰氏染色：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌
蓝色的圆球是金黄色葡萄球菌和简
单染色的效果相同，在菌体的四周有
很多牵连染成了红色。

背景也有不少
蓝色的散开了的菌体，
大肠杆菌，革兰氏阴性菌，染
成红色
金黄色葡萄球菌，球形，不太
明显，出现假阴性
出现假阴性的主要原因是金黄色葡萄球菌有很多牵连，自带背景，非常影响其显
色。

大肠杆菌，染色非常成功，显红色。