LB培养基中所用抗生素终浓度.
海洋放线菌(Salinispora arenicola)基因转移系统的建立
海洋放线菌(Salinispora arenicola)基因转移系统的建立马艳玲;李海贤;翁萍;刘泽璇;许小庆;曾荣【摘要】该实验旨在建立海洋放线菌Salinispora arenicola基因转移系统,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作.以整合型质粒pSET152和pIB139为出发质粒,通过接合转移构建了海洋放线菌Salinispora arenicola的基因转移系统.结果表明,25μg/mL阿泊拉霉素可有效筛选接合子,大肠杆菌与孢子的比例为8:1时可获得较多的转化子.经聚合酶链式反应(PCR)验证,质粒成功整合到菌株海洋放线菌S.arenicola基因组中,接合子经多次传代后,导入的质粒pSET 152和pIB139仍稳定整合于接合子基因组上.成功构建了海洋放线菌S.arenicola接合转移系统.%The objective of this study is to establish the gene transfer system of marine-derived actinomycetes Salinispora arenicola,which can be used for genetic manipulations such as gene knock-out and expression of foreign ing integrated plasmid pSET 152 with pIB 139 as original plasmid,the gene transfer system of actinomycetes S.arenicola was constructed by conjugating transfer.Results showed that 25 μg/ml apramycin may be used to efficiently screening conjugants,and more transformant can be acquired with Escherichia coli to spores ratio 8:1.PCR verification revealed that exogenous plasmid was successfully integrated in the chromosomal DNA of actinomycetes S.arenicola.After multiple generations of zygotes,the transformed plasmid pSET152 and pIB139 of conjugants were stably integrated in the zygote genome.The S.arenicola conjugational transfer system was successfully constructed.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)003【总页数】4页(P131-134)【关键词】海洋放线菌;Salinispora arenicola;接合转移;遗传稳定性【作者】马艳玲;李海贤;翁萍;刘泽璇;许小庆;曾荣【作者单位】佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231【正文语种】中文【中图分类】Q93-331天然药物的一个重要来源是海洋放线菌[1]，其作为一类特殊菌群其可以产生多种生物活性物质，这些活性物质很多都具有成为新药先导化合物的研制潜能，如多肽、酶类、抗肿瘤物质和抗生素等[2-4]。
EGFP的原核表达分析
EGFP的原核表达分析首都师范大学生命科学学院100048摘要：利用PCR反应扩增出所需要的EGFP基因，与pTrc His蛋白表达载体重组，转化大肠杆菌BL21,提取质粒，诱导EGFP蛋白表达，进行进一步的分离纯化并用SDS-PAGE和Western-blot 做检测。
这个实验让我们充分熟悉了整个流程。
关键词：绿色荧光蛋白蛋白的诱导表达、分离纯化表达蛋白检测 E.coli材料和方法：1、主要材料及仪器1.1、菌株和质粒：大肠杆菌BL21为本实验室保存；重组筛选质粒pTrcHis购自Invitroge公司。
1.2、培养基：LB培养基（液/固）内含氨苄青霉素浓度为100 ug/ml。
1.3、器材和试剂器材：移液枪、PCR仪、离心机—（HetticZENTRIFUGEND-78532 Tuttlingen）、SIGMA2-16K(4℃离心机)、SIGMA 3-18K(离50ml大离心管)、紫外透射观察仪、水浴锅、核酸电泳仪（BIO-RAD）、超声波破碎仪（SONICSVIbra cell）、气浴恒温振荡器（THZ-82江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、SDS-PAGE电泳装置、WesternBlotting电转移装置、水平摇床（WD-9405）、胶片观察灯（WD-9406）、封口机、超净台、250ml锥形瓶。
试剂：PCR反应体系缓冲液（10~50 mMTris-HCl，50 mM KCl，1.5 mMMgCl2）、DNA聚合酶（Taq E）、dNTPs混合物（每种2.5mM）、博大泰克PCR产物快速回收试剂盒、限制性核酸内切酶（BglII、EcoRI）、0.5M EDTA、琼脂糖凝胶（1g琼脂糖、100ml1xTAE、10ulEB）、电泳缓冲液（50 xTAE、Tris—乙酸、EDTA）、溴酚兰、蔗糖、甘油、连接酶（购于Promega公司的T4DNA连接酶及10×ligation buffer）、0.1MCaCl2、碱裂解液（溶液I：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl，pH=8.0、10mM EDTA；溶液II：0.2 M NaOH，1％SDS；溶液III：5 M KAc，11.5 ml冰醋酸，加水定容至100ml）、RNaseA、无水乙醇、PBS缓冲液、裂解缓冲液（含20mM咪唑）、冲洗液（含100mM咪唑）、洗脱液（含500mM咪唑）、5×样品缓冲液、30%凝胶贮液、4×分离胶缓冲液、4×浓缩胶缓冲液（4℃保存）、TEMED原液、10%过硫酸铵、Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3）、考马斯亮蓝G250染色液、GFP抗体（200ug/ml，用pH=7.5 TBS配置)、转移缓冲液、TBS、封闭液（5%脱脂奶粉）、显色液（氯萘酚，30mg/ml于甲醇中）、ddH2O、脱色液（（100 ml冰乙酸:100 ml乙醇:800 ml蒸馏水）2、方法2．1、EGFP基因的PCR扩增及其电泳检测在一灭菌的0.2mL小离心管中依次加入(总体积为50ml)：10×buffer(Mg2+)5ml4×dNTPs （每种 2.5mM ）8mlEGFP-F1mlEGFP-R1mlTemplate(模板)34mlTaq E1ml--------------------------------------------------------------------------------Total volume 50µl循环参数94 ℃3min94 ℃30s55 ℃30s 27cycle72 ℃1min72 ℃10min4 ℃保存2.2、PCR扩增产物的回收———试剂盒法1)、柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ml的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。
波赛链霉菌dnrK基因中断突变株代谢产物鉴定
波赛链霉菌dnrK基因中断突变株代谢产物鉴定余贞;王继栋;李美红;周军;黄隽【摘要】目的鉴定波赛链霉菌HS062(柔红霉素工业菌株)dnr基因中断突变株新次级代谢产物.方法将dnrK基因中插入了阿泊拉霉素抗性基因及“海正”标记片段的中断载体pBSSP-KA导入波赛链霉菌HS062,筛选获得dnrK插入失活的突变株DK55,通过HPLC-MS和NMR对DK55菌株产生的新代谢产物进行结构鉴定.结果 dnrK中断突变株DK55产生了一个新的蒽环类代谢产物,该化合物经结构鉴定为histomodulin,并且其效价远远高于原产物柔红霉素.结论本研究通过基因工程手段获得高产histomodulin菌株,为该化合物的应用研究打下了基础;同时,探讨了工业菌株中dnrK基因敲除后菌株代谢产物变化原因, 为进一步提高柔红霉素及其衍生物的产量提供了新的思路.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2015(040)011【总页数】6页(P813-817,835)【关键词】波赛链霉菌;dnrK;Histomodulin;基因中断【作者】余贞;王继栋;李美红;周军;黄隽【作者单位】浙江海正药业股份有限公司,台州318000;浙江海正药业股份有限公司,台州318000;浙江海正药业股份有限公司,台州318000;浙江海正药业股份有限公司,台州318000;浙江海正药业股份有限公司,台州318000【正文语种】中文【中图分类】R978.1自1963年意大利学者DiMarco等[1]从波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)分离获得柔红霉素(daunorubicin,6)以来，国内外学者对波赛链霉菌进行了深入研究，先后分离出多柔比星(doxorubicin,7)[2]、表柔红霉素(epidaunorubicin)[3]、表阿霉素(epirubicin)[3]、洋红霉素(carminomycin,3)[4]、13-脱氧洋红霉素(13-deoxocarminomycin)[5]等一系列临床应用十分广泛的蒽环类抗肿瘤抗生素。
细菌培养常用培养基和抗生素的配制方法
细菌培养常用培养基和抗生素的配制方法、常用培养基1、LB 培养基将下列组分溶解在0.9L 水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g如果需要用INNaOH （〜1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。
注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。
2 、SOB 培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨20g酵母提取物5g氯化钠0.5g1mol/L 氯化钾2.5ml用水补足体积到1L。
分成100ml的小份，高压灭菌。
培养基冷却到室温后，再在每100ml 的小份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁。
3、SOC培养基成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁外，再加2ml 灭菌的1mol/L 葡萄糖（18g 葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。
4 、TB 培养基将下列组分溶解在0.9L水中:蛋白胨12g酵母提取物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。
冷却到60 C , 再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4/0.72mol/LK2HPO4 的溶液（2.31g 的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。
高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。
5、2X Y培养基将下列组分溶解在0.9L水中:蛋白胨16g酵母提取物10g氯化钠4ml如果需要用INNaOH (〜1ml )调整pH 至7.0，再补足水至1L 。
注：琼脂平板需添加琼脂粉 12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉 7g/L 。
6、YPD 培 养基将下列组分溶解在 0.9L 水中： 蛋白胨 20g 酵母提取物 10g 葡萄糖 20g用水补足体积为 1L 后，高压灭菌。
建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基 添加1.6g 色氨酸，因为 YPD 培养基是色氨酸限制型培养基。
大肠杆菌的保存和培养
大肠杆菌的保存和培养大肠杆菌, 培养, 保存一．菌种的保存重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。
由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。
能够长期在研究上应用。
2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。
并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。
人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。
3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后vf fv 的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
常用培养基配制
限制-修饰
rRNA
核糖体核糖核酸
RT
逆转录
RT-PCR
逆转录聚合酶链式反应
SAM
S-腺苷蛋氨酸
SAP
虾碱性磷酸酶
SDA
链置换扩增
/升
终1 X浓度
Na2HPO4x7H2O
64 g
47.8 mM
KH2PO4
15 g
22 mM
NaCl
2.5 g
8.6 mM
NH4
5 g
18.7 mM
添加剂
/升
终1 X浓度
抗生素(如果需要)
氨苄青霉素
50 µg/ml
氯霉素
20 µg/ml
卡那霉素
30 µg/ml
四环素
12 µg/ml
半乳糖苷(如果需要)
2.Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, A1.2-A2.12, 2001.
0.1% (w/v)
H2O
至1升
稀释溶液的pH至8.3
5X Tris-三(羟甲基)甲基甘氨酸-SDS电泳缓冲液
/升
终1 X浓度
lb培养基中所用抗生素终浓度氨苄青霉素-50μgml；氯霉素-20μlgml
LB培养基中抗生素的贮液配置和工作液浓度
①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22 μm滤器过滤除菌；
②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；
③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。
注意：镁离子是四环素的拮抗剂。
对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB培养基。
下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度
氨苄青霉素：贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度20 μg/ml （严紧型质粒）60 μg/ml （松弛型质粒）
羧苄青霉素：贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度20 μg/ml （严紧型质粒）60 μg/ml （松弛型质粒）
氯霉素：贮液浓度34 mg/ml 溶于乙醇-20℃保存工作浓度25 μg/ml （严紧型质粒）170 μg/ml （松弛型质粒）
卡那霉素：贮液浓度10 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
链霉素：贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
四环素：贮液浓度 5 mg/ml 溶于乙醇-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
质粒类型：。
大肠杆菌的保存与培养
一．菌种的保存重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。
由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。
能够长期在研究上应用。
2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。
并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。
人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。
3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
分子操作基本技术实验报告LB培养基的配制和大肠杆菌的培养
实验一LB培养基的配制和大肠杆菌的培养第一部分理论知识一．生物工程所需的微生物学原理基因工程主要采用革兰氏阴性细菌作为宿主细胞表达系统。
下面着重讲述大肠杆菌。
1.大肠杆菌的一般特性大肠杆菌（Escherichia coli，简写为E.coli）属于革兰氏阴性细菌，大肠杆菌不仅能液体培养，也能在固体培养基上很好地生长。
在细菌培养过程中，有两方面的因素影响它的纯度：1.其它细菌造成的细菌污染。
因此，用于培养的所有药品、器皿必须消毒，全部过程应在无菌条件下操作；2.遗传的异质性。
遗传上的异质性发生在培养过程中原有细菌株系遗传成分的变异，导致原有标记性状的改变。
其原因可能是天然突变的结果；或是在由质粒携带标记性状的情况下，异质性可能来自细胞分裂过程中质粒的丢失或质粒的分离。
据目前所知，许多质粒以相当高的频率在寄主细胞分裂时发生分离，从而引起所带性状的变化。
2. 抗生素抗性抗生素阻止细菌生长往往有抑菌和杀菌两种方式。
抑菌就是指药物仅仅使细菌生长受阻而未直接引起细胞死亡；而杀菌是指药物引起细胞裂解或死亡。
一种抗生素抑菌或杀菌效果取决于细菌接触药物的条件。
例如，大肠杆菌接触低水平的四环素将会通过四环素与核糖体结合，影响细菌蛋白质的合成而最终抑制细胞生长。
然而，结合着四环素的核糖体是可恢复的，因为受抑制的细胞被稀释到无药物的培养基上，将会重新恢复正常细胞的生长。
这种抑制的可恢复性表明四环素正以抑菌的方式发挥功能。
当四环素浓度加大，阻止细菌声中的另一种方式变得明显而不可逆，亦即在高浓度下，四环素以杀菌方式发挥功能。
细菌有三种抗生素抗性的机制：（1）抗生素在细菌中作用的目标位置发生了变化。
例如蛋白质合成抑制剂链霉素的抗性通常是由于细菌合成了一种变化了的核糖体蛋白质，这种蛋白质不再与链霉素相连，因此阻止了链霉素的抑制行为；（2）组织药物进入细胞。
如对四环素的抗性是由于细菌合成了阻止四环素进入细胞的膜蛋白，因而四环素的穿透性大为减低所致；（3）改变或钝化药物。
乳酸菌的培养检测方案
品质管理检测项目细菌形态学分类一乳酸杆菌乳酸杆菌的基本属性：乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。
利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。
这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。
利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。
因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。
无芽孢，革兰氏染色呈阳性。
微好氧，厌氧发酵，最适温度30~40摄氏度，最适PH值为5.5~6.2，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。
在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%~10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。
（一）实验仪器和试剂：实验仪器：现有的仪器：欠缺的仪器：培养基和试剂：①培养基：BCP培养基、MRS培养基和SL培养基BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水lO00ml，pH7 0；MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重量(g) 牛肉蛋白粉10 ，鱼肉汁10 ，酵母浸出汁粉5 ，葡萄糖20 ，醋酸钠5 ，柠檬酸二铵 2 ，吐温80 0.1 ，硫酸镁0.58 ，硫酸锰0.28 ，蒸溜水1 000ml ，备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 。
乳酸杆菌选择性琼脂SL：酪蛋白水解物10g；酵母提取物5g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠（CH3COONa？3H2O）25g；MgSO4？7H2O 0.58g；琼脂15g；葡萄糖20g；吐温80 1.0ml；磷酸氢二钾6g；FeSO4？7H2O 0.03g；MnSO4？4H2O 0.15g。
以上用量为1000ml培养基的用量。
溶解琼脂在500ml的沸水中，溶解其他组分在500ml的水中，用冰醋酸调pH=5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
分子生物学实验
分子生物学实验实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂1、实验材料大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp-2、实验设备恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素三、实验步骤液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml）氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）PH 7.0固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。
并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。
当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。
待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
LB液体和固体培养基的配制及抗生素浓度
LB培养基配方
液态培养基
根据《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔著）配制每升培养基,应该在950 ml去离子水中加入:
胰化蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（1.05kg/cm3）
LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌.通过培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的质粒,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础.
LB培养基的配方如下:
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长)
固态培养基
LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。
LB固体培养基倒板
1.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉
2.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
3.倒板：一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
抗生素终浓度Amp 100ug/ml,Kan 50ug/ml.。
质粒提取和纯化及质粒转染所需试剂及操作规范
二、质粒的提取和纯化所需1. 液体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容（2）将配好的培养基高压后，恢复室温后置于4度保存备用，使用时恢复室温（3）配液体LB培养基时，一般不加抗生素（高温会使抗生素失活，也不宜4度保存），因此若要在此培养基中加抗生素，应该在使用时根据比例添加2. 固体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容时（装到可以高压的瓶中），由于加入的琼脂粉有一定的体积，因此定容时，注意略微少加点水，根据要加入的琼脂粉而定（琼脂粉只有在高压后溶解）（2）直接向以上配好的LB中加入加琼脂粉1.5%，以配成固体培养基（3）高压：高压完注意保温，温度过低培养基会凝固，因此从高压锅里取出后应立即铺板（4）铺板此操作在细胞室安全柜中无菌操作，铺板前应提前开紫外灯照台子15min，点燃酒精灯。
若铺的是无抗生素的阴性平板，则在铺板时直接铺板；若铺的是含有抗生素的平板，则在铺板时，应等到高压后的培养基温度降到不烫手时（高温会使抗生素失效），根据比例加入抗生素后在铺板。
培养基铺到平板上，每个平板约25ml，注意保温，一定要在培养基凝固成固体前铺到平板上，铺板时还应不时的摇匀培养基以防止瓶底的培养基因温度过低而凝固，铺好后敞开平板的盖子，待培养基凝成固体后再盖上（约15min）（5）待LB培养基在平板中凝固后，盖上平板的盖子，并用封口膜封好后放到4℃保存备用3. 配置含有抗生素的LB培养基Amp配制时一般为100μg/μl,使用时稀释1000倍Kana配制时一般为50mg/ml，使用时稀释1000倍二、质粒转染真核细胞1、lipo2000（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1）将覆盖率为90-95%的细胞提前用only饥饿3h，转染前换新鲜培养液。
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程2010年02月27日星期六09:02丁香园chrispp作品。
一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图11:pET-32aA3未诱导，2:pET-32aA3未诱导，3:pET-32aA3诱导后，4:pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9%NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA 出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图21:pET-32aA3诱导上清，2:pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
实验三 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与检测
实验四 外源基因在大肠杆菌中 的诱导表达与检测
讲Hale Waihona Puke ：王聪艳一、实验目的：1、了解外源基因表达常用的载体及其特点。 2、通过本实验掌握原核基因表达产物分离的 方法。 3、通过本实验掌握原核基因表达检测的方法。
3、蛋白质样品的制备
分别取1 ml菌液，12000 r/min，离心2 min，弃上清， 再取1mi重复一次，加入100 μl 上样缓冲液悬浮沉淀， 置水浴煮沸5 min，冰上放置5 min，12000 r/min，离 心5 min，取上清点样。
4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 在电泳槽中加入电极缓冲液，连接电源，电泳至 溴酚蓝行至电泳槽前沿时停止(需约4 h)。 5、染色、脱色 将胶从玻璃板中取出，用考马斯亮兰染色液室温 染色1-2 h。将胶从染色液中取出，在脱色摇床慢摇脱 色，更换两次脱色液后，将胶置于含冰乙酸(1:1000) 的蒸馏水中，脱色至条带清晰。
6、将脱色好的胶板拍照
四、结果分析与讨论
• 分析对照组pET-32a空载体的大肠杆 菌与含有外源基因的菌体经诱导后 的蛋白表达情况
pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的系统。目标基因被克隆到T7噬
菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶来诱导目标 基因表达。
二、实验仪器、用具、药品
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、电磁炉、水浴锅、 • 微量移液器、注射器、 • Ecoli （pET-32a空载体）、 Ecoli （ pET32a 携带外源基因）、 Ecoli （无载体） IPTG 、标准分子量蛋白等。
大量纯化蛋白的简易步骤
纯化蛋白的简易步骤纯化1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220rpm培养。
2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃220 rpm培养至OD600≈0.4-0.5。
3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱导前对照）。
之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。
4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。
沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻存）。
5.配制buffer A，如下6.加入适当的buffer A （含有100mM PMSF 1：100、10mg/mL Dnase 1: 1000、2M MgCl21:2000）。
1000mL菌液收的菌，加入30mL即可，太少超声时容易起泡。
7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。
混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。
8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。
（一定不要菌体碎片！取4ul+4ulLB 作为binding前的对照）9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。
10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。
11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer，放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。
Wash buffer: buffer A+20mM imidazole12.洗好的beads加入适量（5CV）的elution buffer，放置10min后洗脱。
实验室常用溶液配制-培养基_抗生素
常见实验用溶液的配制方法默认分类 2008-07-04 14:10:54 阅读4 评论0 字号：大中小一、常用溶液1mol/L亚精胺（Spermidine）：溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。
分装成小份，贮存于-20℃。
1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。
分装成小份，贮存于-20℃。
10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。
10mg/ml牛血清蛋白(BSA)：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。
不要涡旋混合。
加水定容到10ml，然后分装成小份，贮存于-20℃。
1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。
或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。
8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。
1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。
3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。
0.5mol/L EDTA：配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。
或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。
1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。
细菌培养常用培养基和抗生素的配制方法
细菌培养常⽤培养基和抗⽣素的配制⽅法细菌培养常⽤培养基和抗⽣素的配制⽅法、常⽤培养基1、LB 培养基将下列组分溶解在0.9L ⽔中：蛋⽩胨10g酵母提取物5g氯化钠10g如果需要⽤INNaOH （?1ml）调整pH⾄7.0，再补⾜⽔⾄1L。
注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。
2 、SOB 培养基将下列组分溶解在0.9L⽔中：蛋⽩胨20g酵母提取物5g氯化钠0.5g1mol/L 氯化钾2.5ml⽤⽔补⾜体积到1L。
分成100ml的⼩份，⾼压灭菌。
培养基冷却到室温后，再在每100ml 的⼩份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁。
3、SOC培养基成分、⽅法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的⼩份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁外，再加2ml 灭菌的1mol/L 葡萄糖（18g 葡萄糖溶于⾜够⽔中，再⽤⽔补⾜到100ml，⽤0.22um的滤膜过滤除菌）。
4 、TB 培养基将下列组分溶解在0.9L⽔中:蛋⽩胨12g酵母提取物24g⽢油4ml各组分溶解后⾼压灭菌。
冷却到60 C , 再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4/0.72mol/LK2HPO4 的溶液（2.31g 的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在⾜量的⽔中，使终体积为100ml。
⾼压灭菌或⽤0.22um的滤膜过滤除菌）。
5、2X Y培养基将下列组分溶解在0.9L⽔中:蛋⽩胨16g酵母提取物10g氯化钠4ml如果需要⽤INNaOH (?1ml )调整pH ⾄7.0，再补⾜⽔⾄1L 。
注：琼脂平板需添加琼脂粉 12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉 7g/L 。
6、YPD 培养基将下列组分溶解在 0.9L ⽔中：蛋⽩胨 20g 酵母提取物 10g 葡萄糖 20g⽤⽔补⾜体积为 1L 后，⾼压灭菌。
建议在⾼压灭菌之前，对⾊氨酸营养缺陷型每升培养基添加1.6g ⾊氨酸，因为 YPD 培养基是⾊氨酸限制型培养基。
重组载体质粒扩增流程
重组载体质粒扩增的实验步骤：Ⅰ、感受态细菌的制备CaCl2化学转化法准备：LB液体培养基、LB固体平板含抗生素和未含抗生素、0.1mol/L氯化钙溶液预冷、细菌冻存液0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油、高压过的EP管等1、将适合的冻存菌 stbl3挑取一点枪头沾取一点加入盛有1ml LB液体培养基的15ml离心管中；37℃,220rpm,摇菌培养1个小时复苏;2、取10μl以下刚复苏的stbl3涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养纯化;3、挑取20多个前一天培养的细菌菌落加入3ml LB液体培养基里37℃,220rpm,摇菌培养12个小时扩增,需使细菌老化,因为下一步摇出的菌才可处于对数生长期;4、以1：100的比例将3ml培养物转接于300ml LB培养基中,在37℃ 220rpm摇床上剧烈振荡培养约1.5-2小时使细菌处于对数生长期,易于转化,可每半小时测一下OD600值,使其0.3-0.5；5、制冰;以下步骤开始注意无菌操作：6．将所有培养好的菌液分装移至离心管中,在冰上冷却10分钟；7．4℃下3000g冷冻离心10分钟；8．弃去上清,加入 30ml预冷0.1Mol/L CaCl2 溶液,轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置20分钟；9．4℃下3000g冷冻离心10分钟；10．弃去上清,加入 5ml预冷0.1Mol/L CaCl2 溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细菌重新悬浮；11．4℃下3000g冷冻离心10分钟；12.弃去上清,加6ml 0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油混匀后,分装成100μl 或200ul/EP管4℃预冷,-80℃冷冻贮存备用;练手实验中扩增摇菌时中途摇床关闭了一段时间具体不详,后续接着摇菌过夜;离心时用的6000rpm,第二次离心时很快溶解,遂进行了第三次离心获取沉淀;配制冻存液忽视了甘油对氯化钙的稀释,用1.8ml 50%的甘油加入4.2ml 0.1mol/L的氯化钙,即氯化钙的浓度没有达到0.1mol/L ;分装时每个EP管含有300μl的感受态细菌;Ⅱ、重组载体质粒转化细菌及转化成功细菌即转化子的筛选准备：含筛选抗生素的固体培养基、冰、42℃水浴锅、37℃预热的培养基1、取100μl感受态细菌在冰上解冻,每管加质粒载体体积≤10μl,DNA≤50ng,轻弹以混匀内容物,在冰中放置30min;2、将EP管放到预加温到42℃的循环水浴中的浮板上,放置90s～2min,不要摇动EP管;3、3、快速将EP管转移到冰浴上中,使细菌冷却1～2min4、4、每离心管加400μl LB培养基,事先用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min至1H使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因;5、5、将适当体积10μl已转化的感受态细菌涂布到含相应抗生素抗性100μg/ml的终浓度的LB固体培养基上旋转均匀涂布直至有发涩的感觉,即使平板干燥,然后倒置平皿,于37℃培养,12～16h后可出现菌落或者将质粒涂布均匀后在37℃孵箱里先正放培养30min左右,再倒放培养;练手实验中转化VSVG质粒的平板长了2个菌落,而Δ8.2质粒的平板貌似没有菌落形成;分析原因排除了平板氨苄青霉素浓度100μg/ml太高,可能有两个原因：1、复苏的细菌浓度低,操作时将100μl感受态细菌加入了800μl的培养基摇菌,并且只摇菌40min；2、涂板时量太少,只加了20μl的复苏菌涂布;总的来说可能种在平板上的细菌太少;Ⅲ、转化细菌的扩增：准备：LB培养基1、挑取以上培养的转化细菌的单菌落1至数个于2.5ml 有氨苄抗生素的LB液体培养基里37℃ 220rpm摇菌12H扩增细菌2、将上一步摇的2.5ml细菌加入250ml抗性LB液体培养基氨苄青霉素里,37℃ 220rpm摇菌24H扩增质粒注：扩增的质粒不能立即提取时可将所有菌液转移至离心瓶里6000rpm离心收集细菌沉淀,然后-20℃保存;此次提质粒的细菌连同LB培养基一起冻存了,应把离心弃去培养基后仅冻存沉淀Ⅳ、重组载体质粒提取及纯化详见试剂盒质粒提取步骤1 用15 ml离心管收集1-5 ml菌液;12,000 rpm离心1min,弃上清;●根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数,确定收集的菌液量;2 加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮;室温静置1- 2min;3 加入250 μl溶液Ⅱ,轻柔地反复颠倒混匀5-6次;室温放置1-2 min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液;●不可剧烈混和,否则会使染色体DNA 断裂;●此步骤不宜超过5 min;4 加入350 μl溶液Ⅲ,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次;此时会出现白色絮状沉淀;5 12,000 rpm 室温离心10 min,收集上清;6 将上清置于DNA纯化柱中,静置1-2 min;●如果收集的上清液过多,超过DNA 纯化柱容积800 μl,可将上清分次加入DNA 纯化柱中;7 12,000 rpm 离心1 min,弃滤液;●此时质粒DNA 被吸附于DNA 纯化柱的硅胶膜上;8 加入500 μl 溶液PB,12,000 rpm 离心1 min,弃滤液;●此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA;9 加入500 μl溶液W,12,000 rpm 离心1 min,弃滤液;●溶液W 初次使用前用无水乙醇按1: 1.5 稀释,即含60%乙醇;10 加入500 μl溶液W,12,000 rpm 离心1 min,弃滤液;11 12,000 rpm 离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体;12 将DNA纯化柱置于新的离心管中;向纯化柱中央处,悬空滴加50-100 μl 溶液Eluent,室温放置2 min;● 12,000 rpm离心1 min, 管底即为高纯度质粒DNA;质粒DNA 于-20℃保存●溶液 Eluent 可用无菌双蒸水代替,但其pH 需为8.0-8.5;溶液Eluent 的加入体积视质粒拷贝数多少、依质粒浓度要求而定;Ⅴ、重组载体质粒的浓度及纯度测定紫外分光光度法：测OD260、OD280先将DNA50倍稀释即2μlDNA加入98μl溶液Eluent 中,然后加入比色皿检测质粒浓度=50×OD260×n50为每OD260值代表50μg/ml的双链DNA；OD260为260nm的吸光光度值；n为稀释倍数质粒纯度=OD260/OD280比值在1.8-2.0比较纯此次提的质粒稀释50倍后OD260为0.121、OD280为0.123；所以浓度为302.5ng/ul；质粒纯度OD260/OD280为0.983,考虑蛋白参入太多Ⅵ、重组载体质粒的鉴定：方法1：双酶切→电泳插入片段在2Kb以上时；直接DNA电泳可判断整个重组载体质粒是否正确;方法2：PCR插入片段在2Kb以下时→电泳方法3：送公司测序附：LB培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g再补足水至1L;注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L;氨苄青霉素ampicillin100mg/ml溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中,最后定容至10ml,浓度为100mg/ml;分装成小份于-20℃贮存;常以25ug/ml～50ug/ml还是100μg 的终浓度添加于生长培养基;重组载体质粒转化细菌方法2：电转化Ⅰ、电感受态细胞的制备第一天：1. 将适合的冻存菌 DH5α挑取一点加入盛有1ml LB液体培养基的15ml离心管中；37℃,220rpm,摇菌培养1个小时复苏;2、取10μl以下刚复苏的DH5α涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养;3. 高温灭菌大的离心瓶250-500ml以备第二天摇瓶用4. 准备几瓶灭菌水总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：5、挑取单个前一天培养的细菌菌落加入3ml LB液体培养基里37℃,220rpm,摇菌培养12个小时;6. 以1：100的比例取1ml菌液加入盛有100ml LB液体培养基的250ml摇瓶中37°C,220rpm,振摇2-3小时,定时监控OD.600值培养1小时后每半小时测定一次7. 当O.D.600值达到0.3-0.4时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却15min至30min8.将100ml培养基转移至离心瓶中,4°C 2500rpm下离心10min,弃上清液;9. 加入几毫升灭菌冰水用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞,然后加水至离心管的2/3体积稀释;10. 4000rpm离心10分钟还是2500rpm 10min ,小心弃去上清液11. 同步骤9用灭菌的冰水重悬浮细胞12. 4000rpm离心10分钟,弃上清液13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 4000rpm离心10分钟,小心弃去上清液甘油稀释的细菌离心后沉淀更松散,需小心弃液15.15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16.16. 将细胞按100μl或200ul/管等份装入微量离心管,于-80°C保存;可同时取100μl感受态细菌加0.01ng puc18直接电穿孔转化,检测转化效率;次日观察转化子生长情况Ⅱ、细胞转化1、事先用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电击杯,于超净台吹干,将载体质粒名称、800ul无抗生素LB和0.1CM的电击杯一起置于冰上预冷;2. 在冰上解冻一管100μl的电感受态细胞,添加1-10μl载体质粒体积,冰上培育约5分钟;3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器无泡中,混匀后转入电击杯中.轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部.4. 加载P1000移液器,准备好800μl LB5. 对电穿孔容器进行脉冲200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏检查时间常数,应该在3以上6.按一下pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入800μl的LB液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5ml的离心管中;7. 37°C 220rpm下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 5000rpm,5分钟,弃上清剩100ul,涂布到带有抗生素氨苄青霉素的琼脂平板上,放于37℃过夜培养,次日查看转化结果.。
IPTG诱导表达步骤
大肠杆菌中蛋白质诱导表达
(一)材料
1. IPTG(用去离子水配成1 00mM，用0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存)
2. 10xPBS缓冲液: NaCl 1.37 M
KCl 27 mM
Na2HPO4 100 mM
KH2PO420 mM
3. PMSF(用异丙醇配成10mM，-20℃保存)
4. 10% TritonX-100
(二)方法
1. 挑取单克隆接种于少量含有抗生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm震荡培养过夜;
2. 将过夜培养物按1:100的比例接种到新鲜的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,
250rpm震荡培养2-4h至OD600为0.5;
3. 加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续37℃, 250rpm震荡培养2-3h;
4. 4℃, 4000rpm离心10min后，去上清，加入适量IxPBS重悬，在加入PMSF至终浓度为
0.1 mM，冰上预冷10min;
5. 进行冰浴超声破碎5-10min (10-20sec/次)，至菌液较为澄清;
6. 加入10% TritonX-100至终浓度为0.5%, 4 ℃震荡15min;
7. 4℃, 12000rpm离心10min后，取上清:
8. 用相同体积的1 xPBS重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破碎后的上清
和沉淀分别进行蛋白电泳检测，考马斯亮蓝染色，脱色:
9. 根据脱色结果，可确定是否表达出目的蛋白，并且判断所表达的蛋白是可溶性还是以包
涵体形式存在。
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抗生素的贮液和工作液浓度
①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22 μm滤器过滤除菌；
②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；
③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。
注意：镁离子是四环素的拮抗剂。
对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB培养基。
下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度
氨苄青霉素贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度20 μg/ml （严紧型质粒）60 μg/ml （松弛型质粒）
羧苄青霉素贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度20 μg/ml （严紧型质粒）60 μg/ml （松弛型质粒）
氯霉素贮液浓度34 mg/ml 溶于乙醇-20℃保存工作浓度25 μg/ml （严紧型质粒）170 μg/ml （松弛型质粒）
卡那霉素贮液浓度10 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
链霉素贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
四环素贮液浓度 5 mg/ml 溶于乙醇-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
质粒类型：。