组织切片技术 PPT

2.注意防止人为因素的影响 切取组织的刀剪必须锋利，刀要足够长。切分组织块时，不
可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压。以免损伤组织；
取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整 部分修去。
3.组织块的大小
厚为0.2～0.5cm，大小可根据需要而定。柔软组织不易切小,
可先取稍大的组织块固定2 ～ 3h，等组织稍硬后再切成薄的小块
(3) Bouin’S液
苦味酸饱和水溶液 75ml
甲醛
25ml
冰醋酸
5ml
是常用的良好固定液，渗透速度快，收缩小，组织固定均匀胰腺特殊染色效果好。固定为12～24小时，但固定过久， 对碱性染料着色不利。
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（4）Carnoy氏液
(6) Methacarn固定液
甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备用，对 核内抗原的保存效果较好。
(7)丙酮及醇类固定剂
丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是对蛋白质的沉淀而 发生固定作用。酒精是一种还愿剂，用于组织固定以95%的浓度 为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固 定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。
所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时 间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当， 即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。
一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，动物组织取 材要稍大，植物组织取材稍小。
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动物组织标本的取材
动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜， 10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应 采用灌注固定后，再进行后固定。
8.明确编号，登记
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2.2 组织标本的固定
新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的 繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后， 应立即采用一种方法，将组织尽可能保持原有的形态结 构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固 定。化学固定法就是用化学试剂配制成固定液使组织固 定。
制片所需的材料要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面 的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要从活的动物 体上采取材料，在一般情况下，要对动物施行麻醉，然后 再割取材料加以固定。所用的麻醉药品，必须以不影响细 胞结构为原则。
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组织取材注意事项
1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学研究。 动物放血处死后立即取材，最好在心脏还在跳动时立即取材，马 上投入固定液中；
造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清 晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而 使细胞各部易于染色； ④ 固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于 操作。
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固定的方法
（1）小块组织固定：从人体或动物取出组织，切成小块投入固 定液中固定。
（2）局部注射固定：某些组织和器官其固定液不易渗透或渗透 较慢，渗透不均匀，还有些器官为保持外型或卷缩，可采 取局部注射固定方法，固定4～6小时后，再将组织切成小 块继续投入固定液中固定。
（3）整体注射固定：此法主要用于科研和大体解剖，亦可用于 组织学教学制片。
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固定液的选择
固定液的种类很多。可分为两大类：单纯固定液和 混合固定液。
单纯固定液：是用一种化学试剂作为固定液，如乙 醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固 定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞 固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原 等，单纯固定液有一定局限性。
石蜡切片及H&E染色技术
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石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片 和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来 的。现以石蜡切片为例，介绍切片标本的制备 方法。
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组织学制片步骤：
取材
固定 冲洗
脱水
透明
浸蜡 包埋 修块 切片 贴片
烤片
染色 封片 观察结果
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取材
根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新 鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。
甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在 某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pH 为7.6，能长期保持中性。甲醛固定后，通常需在流水中冲 洗24-48小时,否则影响染色效果。
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(2) 4％多聚甲醛固定液
最好是动物经灌注固定取材后，继续固定2-24h。该固定剂较 为温和，适用于组织标本的长期保存。
纯酒精
60ml
氯仿
30ml
冰醋酸
10ml
此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间
2～4小时，它是细胞极好的固定液，适合于细胞分裂、
RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。
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(5) PLP固定液：
过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含 糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣， 除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否 适当和完全。
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固定的目的和作用在于：
① 防止组织自溶和腐败； ② 使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保
存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构； ③ 因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，
混合固定液：是用几种化学试剂，按一定的比例混 合配制而成的，由于各种试剂的优缺点互相弥补，因此 可产生较好的效果。
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（1）甲醛固定液：
是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为37%～40%，配成 固定液的浓度为4%，习惯上称为10%，配制时取甲醛原液 10ml，加蒸馏水（D.W）或缓冲液至100ml，为甲醛固定液 （10％福尔马林） 。
继续固定。
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4.取材应注意清洁，组织块上如有血液、污物和粘液沾着，应用 生理盐水洗涤后再入固定液。
5.取材时间：原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、 肺、肠等器官，最好先固定后取材。
6.注意确定取材部位和包埋切面的方向，选好组织块的切面应熟 悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向，
7. 组织清除：切除(清除)不需要的部分，特别是组织周围的脂肪， 应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。