蛋白质含量测定法
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实验一 蛋白质含量测定法
[实验目的]
1． 掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法 2． 掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的方法
一．考马斯亮蓝法（Bradford 法）
[实验原理]
（蓝色）变为氨基酸芳香族
碱性
染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+
-
[器材与试剂]
（一） 器材
1． 722型和753型可见光分光光度计 2． 漩涡混合器 3． 试管16支 （二） 试剂
1． 标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.03mg/ml 和0.103mg/ml 。 2． 考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再
加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]
1． 标准方法 （1） 取10支试管，分别编号后按 表1-1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、
去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 （2） 加完染料20min 后，使用722分光光度计（灵敏度4），塑料比色皿，在595nm
处测量吸光度A 595。 （3） 用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到
标准曲线。根据测得的未知样品的A 595，查表即可求得未知样品的蛋白质含量。
2． 微量法
取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。其他步骤同上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。 3． SDS 干扰实验 （1） 取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和
考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 （2） 加完染料20min 后，使用753分光光度计（狭缝4），塑料比色皿，在595nm
处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]
（一） 标准方法的数据和图
表1 考马斯亮蓝标准法实验表格
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 （1.03mg/ml ） 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 未知蛋白质 （约0.5mg/ml ）
0.04 0.08 0.10 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 0.02 0 考马斯亮蓝 G-250试剂 3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
对应的吸光度
A 595
0.200 0.311 0.362 0.483 0.624 0.752 0.845 0.387 0.501 0.572
根据表1，以A 595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg ）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮兰标准法
y = 6.1884x + 0.2287
R 2 = 0.9942
00.20.40.60.8
10
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
标准蛋白质量/（μg）
A 595
图1 考马斯亮蓝标准法
根据线性拟合公式y =6.1884x +0.2287计算所测溶液的蛋白质的含量分别是8号管0.637mg/ml ，9号管0.5547 mg/ml ，10号管0.550 mg/ml 。因为8号管测出结果误差太大，取9和10管的平均值，所以，未知溶液的蛋白质含量为0.5524 mg/ml 。
表2 考马斯亮蓝微量法实验表格
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 （0.103mg/ml ） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 未知蛋白质 （约0.5mg/ml ）
0.4 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.6 0.2 0 考马斯亮蓝 G-250试剂 3.0 3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
对应的吸光度
A 595
0.088 0.184 0.292 0.411 0.542 0.631 0.171 0.289 0.362
根据表2，以A 595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg ）为横坐标，作图2。
图2 考马斯亮兰微量法
y = 6.0579x + 0.0305
R 2 = 0.9919
0.10.20.30.40.50.60.70
0.02
0.04
0.06
0.080.10.12
标准蛋白质量/（μg）
A 595
图2 考马斯亮蓝微量法
根据线性拟合公式y =6.0579x +0.0305计算稀释10倍后的未知溶液的蛋白质含量分别是8号管0.05798 mg/ml ，9号管0.05334 mg/ml ，10号管0.05472 mg/ml 。取平均值再乘10倍，得未知溶液的蛋白质含量为0.5534 mg/ml 。
表3 考马斯亮蓝SDS 干扰实验表格
管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质 （1.03mg/ml ） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 SDS (1mg/ml)
0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 蒸馏水 0.9 0.8 0.7 0.5 0.3 0.1 考马斯亮蓝 G-250试剂 3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
对应的吸光度
A 595
0.423 0.336 0.275 0.200 0.213 0.198
根据表3，以A 595为纵坐标，SDS 浓度为横坐标，作图3。
考马斯亮兰SDS干扰实验图
00.10.20.30.4
0.50
0.2
0.40.60.8
1
SDS浓度
A 595
图3 考马斯亮蓝SDS 干扰实验
由上图可以看出，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰，同是0.103mg/ml 的标准蛋白与3.0ml 考马斯亮蓝，但随着SDS 浓度的增加，其混合液的595nm 处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。