Transwell实验技术(corning)
Transwell实验 超详细
Transwell侵袭实验总结第一节概念这里想明白两个概念,一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模子.关于Transwell这个词该若何解释,查了许多材料也未见精确的注解,我以为可以这么懂得吧,trans这个词根有转移.转运.穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上懂得,这是一类有通透性的杯状的装配,依据Corning公司的Transwell解释书中的介绍,可以以为这是一种膜滤器（Membrane filters）,也可以为是一种有通透性的支架（permeable supports）.更精确地说,Transwell应当是一种实验技巧,这项技巧的重要材料是Transwell小室（Transwell chamber,Transwell insert）,其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不合厂家对Transwell会有不合的定名,而不合型号也可有不合外形,不合大小,依据实验须要,可有不合选择.但无论是何种外形,其症结部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与通俗的孔板是一样.这层膜带有微孔,孔径大小有0.1－12.0µm,依据不合须要可用不合材料,一般经常运用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）.下图是一个Transwell装配的纵切面将Transwell小室放入造就板中,小室内称上室,造就板内称下室,上室内盛装上层造就液,下室内盛装基层造就液,高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔.我们将细胞种在上室内,因为聚碳酸酯膜有通透性,基层造就液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研讨基层造就液中的成分对细胞发展.活动等的影响.运用不合孔径和经由不合处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共造就.细胞趋化.细胞迁徙.细胞侵袭等多种方面的研讨.下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不合细胞其体积不合,具体选择时要斟酌到细胞大小.这里重要谈几种大家经常运用的实验：（1）共造就系统：小于3.0um孔径前提下,细胞不会迁徙经由过程,是以,若研讨不涉及细胞活动才能,不须要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm 以下孔径.经常运用0.4.3.0µm.我们实验室用的是0.4µm.将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的影响.（2）趋化性实验可用5.0.8.0.12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反应下室成分对上室细胞的趋化才能.①细胞B对细胞A的趋化感化：将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的趋化感化.②趋化因子对细胞的趋化感化：将细胞种于上室,下室参加某种趋化因子,可研讨该趋化因子对细胞的趋化感化.（3）肿瘤细胞迁徙实验经常运用8.0.12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁徙才能.（4）肿瘤细胞侵袭实验经常运用8.0.12.0µm膜,道理与肿瘤细胞迁徙实验相似.上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁徙实验不合的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模拟体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要排泄基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解,方可经由过程聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭才能.用于研讨肿瘤细胞侵袭才能的肿瘤细胞侵袭模子有如下几种（引自司徒镇强《细胞造就》）：2.1 体内癌细胞侵袭模子2.1.1 皮下移植侵袭模子2.1.2 肌肉内移植侵袭模子2.1.3 腹腔内移植侵袭模子2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模子2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模子2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模子2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模子2.1.8 视网内界膜侵袭模子2.2 体外癌细胞侵袭模子2.2.1 体外静止器官造就法2.2.1.1 半固体造就基单细胞器官造就法2.2.1.2 液体造就基单细胞器官造就法2.2.2 半体外半体内器官造就法2.2.3 单层细胞器官造就法2.2.4 瘤细胞球体器官造就法2.2.4.1 静止球体器官造就法2.2.4.2 扭转动摇球体器官造就法2.2.5 单层细胞侵袭实验模子2.2.6 Transwell侵袭小室测定法可见,Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等号,Transwell有多种运用,侵袭实验也有多种办法.所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技巧运用于肿瘤细胞侵袭研讨的一种实验.因为其简略易行.反复性好,因而得到了越来越普遍的运用,但不克不及以为研讨肿瘤侵袭只有Transwell 一种办法.第二节 Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁徙实验,其他方面的Transwell运用我不太清晰,是以这里重要谈谈Transwell侵袭实验.1.实验用品：① Transwell小室：多种厂家可供给,论坛里经常运用的是Costar.Corning.BD临盆的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,尚有Boyden lipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert.这些厂家供给的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很便利,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是异常贵,24孔板配套的小室,每个价钱约130元,不推举给大家.BD也有已包被好的,价钱不清晰.Coster和Corning公司临盆的小室,是论坛里比较经常运用的,似乎是要本身铺胶,但据说每个小室成本只有40阁下,应当比较合适中国国情.下面是一些战友供给的价钱,具体建议大家接洽代理商咨询.linanping1979战友供给的价钱：coster的24孔板的transwell的价钱是456元RMB,8µm,用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy 战友供给的价钱：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的.梅林战友供给的BD价钱： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert）,似乎是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy供给的价钱是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人平易近币不到.平均每个20元不到.Transwell小室按照公司的请求,都是一次性运用的.不过其实洗洗泡泡照样可以反复用的.我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很清洁,用前用紫外里外都照30min.sword01战友供给的处理办法：用棉签轻轻擦去胶和不和细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,不和6h,微波,低火10min×2.因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次运用的小室只用来做不须要铺胶的迁徙实验.以前的Chemicon ECM550系列,膜很壮实,擦不坏,可以反复用许多次,但如今的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能反复用一次,真黑啊！许多战友说Costar 和Corning也是可以反复用的,大家可以尝尝.本身没见过,有兴致的可以本身研讨一下.别的,依据论坛战友供给的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理.Transwell小室用事后,可把本来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,如许又可以用了,不过我没用过,有兴致的可以尝尝.maojianwen战友的运用办法： trasnwell小室做一次后,将本来的膜去掉落,从新泡酸,泡酒精,运用前照紫外,然后用密斯用指甲油（留意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上,剪掉落过剩的边沿.再照紫外.② 上层造就液：上层造就液采取无血清造就基,为保持渗入渗出压,需参加0.05%0.2% BSA.③ 细胞：值得留意的是,有侵袭才能的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP2的表达.假如不清晰细胞MMPs的表达情形,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不须要的糟蹋,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,其实不是笔小数量,照样当心为妙.别的,为了让实验成果更显著,可先撤血清让细胞饥饿12－24h,再进行实验.④ 基质胶：经常运用的是人工重构基底膜材料Matrigel,重要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,临盆厂家有BD.美国Collaborative Rsearch 公司等.CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司临盆的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不成逆.同样的器械在sigma叫ECM.zhangyong1036战友供给的价钱：BD 公司的matrigel 1500阁下.假如购置的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不须要购置了.⑤ 基层造就液：基层经常运用含5%－10% FBS的造就基,具体浓度依据细胞侵袭力而定,侵袭力衰的细胞可恰当进步FBS浓度.基层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白参加基层造就液作为趋化因子,但小我以为,FBS仍是最合适的.⑥ 细胞造就板：经常运用于Transwell侵袭实验的细胞造就板有6孔板.12孔板.24孔板等,以24孔最经常运用.细胞造就板没什么特别请求,通俗的细胞造就板就可以.但要留意,细胞造就板应当与购置的Transwell小室相配套.⑦ 此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),如许做的目标是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.许多战友以为这不是必须的,并且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好.假如贴壁不好的话可以尝尝看.linanping1979战友以为,假如造就时光很长（>24h）,细胞照样会掉落到下室里面去,所以有前提的话,最好照样在膜基层涂上FN.别的,值得一提的是,膜基层涂上FN还有必定的趋化感化.2．步调2.1 Transwell小室制备2.1.1 无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干.假如须要鄙人室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉落,汲取FN平均涂抹在小室的下面.用胶原（collagen）的话,一班配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上.② 水化基底膜：吸出造就板中残存液体,每孔参加50ul含10g/LBSA的无血清造就液,37℃,30min.尚有tianjin_glioma战友供给的办法：在上室的聚碳酸酯膜上参加稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 6080µl (留意体积不成太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶.2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列解释书请求,将小室放入造就板中,在上室参加300µl预温的无血清造就基,室温下静置15－30min,使基质胶再水化.再吸去残剩造就液.2.2 制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.② 消化细胞,终止消化后离心弃去造就液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清造就基重悬.调剂细胞密度至1－10×105,小我以为不要超出5×105.具体实验时采取密度要本身探索,因为不合细胞,其侵袭才能是不合的.小我经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,假如最后用计数法统计成果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时光点,所有的细胞都已穿过,是以起码也要包管在收样的时刻,上室内还要有必定量的细胞消失.小我以为,对比组和处理尽量不要离开计数,因为细胞数量标差别会轻微影响实验成果.假如须要对细胞预处理而不克不及不离开计数,那么计数必定要多反复几回,力图精确,尽量包管对比组和处理组细胞密度一致.2.3 接种细胞① 取细胞悬液100－200µl参加Transwell小室,不合公司的.不合大小的Transwell小室对细胞悬液量有不合请求,请参考解释书.24孔板小室一般200µl.② 24孔板下室一般参加500µl含FBS或趋化因子的造就基,不合的造就板加的量有不合请求,具体请参考解释书.这里要特别留意的是,基层造就液和小室间常会有气泡产生,一旦产朝气泡,基层造就液的趋化感化就削弱甚至消掉了,在种板的时刻要特别留意,一旦消失气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进造就板.③ 造就细胞：通例造就12－48h（重要依癌细胞侵袭才能而定）.时光点的选择除了要斟酌到细胞细胞侵袭力外,处理身分对细胞数量标影响也不成疏忽.以我的课题为例,我运用的药物不但会克制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有显著克制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h 的IC50.用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并没有显著克制,但24h后,克制造用就开端消失了.所以,用这个浓度来做Transwell,处理时光也必须限制在24h内,不然一旦药物克制了细胞增殖或者引诱出凋亡,使处理组细胞数量少于对比组,那么就难以确定穿过膜的细胞比对比组少,毕竟是因为侵袭被克制引起,照样处理后细胞数量本身就比对比组少而引起的了.时光过长不成以,同样,过短也不成,因为细胞内会有必定量的MMPs储存,短时光内可能侵袭才能不会有太大转变.同时从药物被接收进去,进而施展感化,影响MMPs表达,到最后释放到造就基中,还须要一个进程.时光点的选择可尽量长点,也可选择多个时光点研讨时光依附效应,但前提是这个时光规模内细胞数量不克不及有显著变更.别的,我看到细胞在小室内的形态不是正常造就贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会集合成团,所以看到细胞不正常贴壁也没紧要张,是正常现象在造就进程中,膜下会逐渐有少量吝啬泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我碰到过造就一段时光后,膜下消失了大气泡,亏得实时发明,不然效果将异常轻微.是以,小我建议,最好接种细胞后1－2h把造就板从造就箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生.2.4 成果统计检测穿过的细胞数有两种办法：2.4.1 直接计数法2.4.1.1 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉落到下室里面去.如下图：经由过程给细胞染色,可在镜下计数细胞① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 染色：经常运用的染色办法有结晶紫染色.台肦蓝染色.Giemsa染色.苏木精染色.伊红染色等.小我推举采取0.1%结晶紫染色,这种办法有如下优势：(1). 不须要固定细胞,直接染色即可.(2). 配制简略便利.(3). 染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完整洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值,间接反应细胞数.小我以为这是结晶紫染色最大的优势地点.因为,固然经由精确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以精确掌握,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,乃至细胞成堆,这种情形下就难以计数了,这种情形下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.运用结晶紫染色要留意,染色前要将膜风干,不然可能会染不上.③ 细胞计数：我们运用的是Leica DC 300F正置显微镜进行不雅察和摄影,把Transwell小室反过来底朝上就可清晰看到小室底膜高低室侧附着的细胞.也有许多人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保管,但是如许做小室就成了一次性的了,不免难免有点糟蹋.取若干个视野计数细胞个数.论坛里一般采取3－5个视野,也有人用10个,都是随机拔取,小我以为如许选择的视野带有很大的有时性,也会掺进工资影响,特别是计数视野较少的时刻.我拔取16个视野,不是随机选择,而是有固定的地位.我们运用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.如图,蓝色部分暗示膜的大小,白色圆形暗示视野的大小,绿色方形则暗示摄影时所能拍下的视野的中间部分.如许,每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数,如许得到成果是比较客不雅和精确的.2.4.1.2 “非贴壁”细胞计数因为某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不克不及附着在膜上,而是掉落进下室.如下图：2.4.2 间接计数法间接计数法重要用于穿细致胞过多,而无法经由过程计数获得精确的细胞数所采取的办法,与经常运用的MTT实验是同样的道理.2.4.2.1 MTT法① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 24孔板中参加500µl含0.5mg/ml MTT的完整造就基,将小室置于个中,使膜浸没在造就基中,37℃ 4h后掏出.③ 24孔板中参加500µl DMSO,将小室置于个中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分消融.掏出小室,24孔板于酶标仪上测OD值.2.4.2.2 荧光试剂检测这类办法一般是与Transwell小室一路出售的,其道理与MTT 法相似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值.Chemicon的ECM554即属于这类.2.4.2.3 结晶紫检测上文已说过,这里不再赘述,道理与MTT法也是相似的.但结晶紫染色还有个长处,就是染色和脱色的进程其实不影响膜上细胞,在脱色后还可从新染色.这是用正置显微镜拍摄的图,结晶紫染色,进行细胞计数.第三节 Transwell的其他运用的实验步调1．Transwell肿瘤细胞迁徙实验进程与Transwell侵袭实验根本一致,不合的只是不须要铺Matrigel.小我以为,因为没有基质胶的阻拦,细胞穿过膜的速度较侵袭实验显著加速,所以细胞量要更大.我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁徙实验的密度是1×106.别的,基层造就液的FBS浓度也可恰当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁徙实验的浓度是2.5%.2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞造就步调做了一段时光的原代细胞造就,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友配合商量：(1) 将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管掏出,置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma),100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（GibcoBRL）.无Ca 2＋.Mg2＋,无血清的MEM.(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞.(3) 离心后立刻用新颖的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5％胎牛血清.100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC8 medium (Biofluids)冲洗一次.(4) 冲洗事后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活气,若存活率大于90％,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar）,以37°C 5％CO295% 空气含5% 胎牛血清(GibcoBRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC8 medium孵育6~10天.(5) 孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电心理实验.显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中心,发展时常彼此慎密衔接成单层细胞片3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁徙实验我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁徙实验,具体是这么做的：起首把Transwell倒置,在Transwell的PVPF 膜（0.8 um）的下概况涂一层fibronectin(10 ug/ml,50ul),37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600ul的造就基（含10%血清）的24孔板内,后在Transwell的闺阁参加细胞（100ul,用含0.1%血清的造就基稀释好本身所需密度）,放入造就箱,1218小时后,掏出Transwell,用棉签擦去PVPF膜接近闺阁那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下不雅察细胞,记数.4．mci战友的内皮细胞HMEC1迁徙实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于造就箱中均衡1小时后,上室参加100µl用serumfree MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不合浓度的药物,下室参加0.6ml serumfree的MCDB131培液及20%FCS刺激迁徙,同时设置响应阴性及阳性对比,置于CO2造就箱中感化8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉落上层未迁徙细胞,显微镜(Olympus, DP50, Japan).下不雅察并摄影,最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD 值.克制率盘算公式为：克制率（%）=[(OD值给药组OD值无刺激阴性对比)/（OD值不加药阳性对比 OD值无刺激阴性对比)]×100%.。
细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）
细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster 和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
Transwell实验 超详细
Transwell侵袭实验总结之袁州冬雪创作第一节概念这里想明白两个概念，一个是Transwell，另外一个是肿瘤细胞侵袭模子.关于Transwell这个词该如何诠释，查了很多资料也未见准确的注解，我感觉可以这么懂得吧，trans这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上懂得，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning 公司的Transwell说明书中的先容，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）.更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要资料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，分歧厂家对Transwell会有分歧的定名，而分歧型号也可有分歧形状，分歧大小，根据实验需要，可有分歧选择.但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的资料与普通的孔板是一样.这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据分歧需要可用分歧资料，一般常常使用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）.下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔.我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响.应用分歧孔径和颠末分歧处理的聚碳酸酯膜，便可以停止共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究.下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子详细来谈谈孔径的选择，当然分歧细胞其体积分歧，详细选择时要思索到细胞大小.这里主要谈几种大家常常使用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动才能，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径.常常使用0.4、3.0µm.我们实验室用的是0.4µm.将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢发生的物质对细胞A的影响.（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化才能.①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢发生的物质对细胞A的趋化作用.②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用.（3）肿瘤细胞迁移实验常常使用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移才能.（4）肿瘤细胞侵袭实验常常使用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验近似.上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验分歧的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以仿照体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭才能.用于研究肿瘤细胞侵袭才能的肿瘤细胞侵袭模子有如下几种（引自司徒镇强《细胞培养》）：2.1 体内癌细胞侵袭模子2.1.1 皮下移植侵袭模子2.1.2 肌肉内移植侵袭模子2.1.3 腹腔内移植侵袭模子2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模子2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模子2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模子2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模子2.1.8 视网内界膜侵袭模子2.2 体外癌细胞侵袭模子2.2.1 体外运动器官培养法2.2.1.1 半固体培养基单细胞器官培养法2.2.1.2 液体培养基单细胞器官培养法2.2.2 半体外半体内器官培养法2.2.3 单层细胞器官培养法2.2.4 瘤细胞球体器官培养法2.2.4.1 运动球体器官培养法2.2.4.2 旋转摇动球体器官培养法2.2.5 单层细胞侵袭实验模子2.2.6 Transwell侵袭小室测定法可见，Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种方法.所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验.由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不克不及认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法.第二节 Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验.1.实验用品：① Transwell小室：多种厂家可提供，论坛里常常使用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，还有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友先容的Thincert.这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来便可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每一个价格约130元，不推荐给大家.BD也有已包被好的，价格不清楚.Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常常使用的，好像是要自己铺胶，但听说每一个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情.下面是一些战友提供的价格，详细建议大家接洽代理商咨询.linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm，用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy战友提供的价格：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的.梅林战友提供的BD 价格： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人平易近币不到.平均每一个20元不到.Transwell小室依照公司的要求，都是一次性使用的.不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的.我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min.sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2.因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次操纵的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验.以前的ChemiconECM550系列，膜很坚固，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的资料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试.自己没见过，有兴趣的可以自己研究一下.别的，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理.Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试.maojianwen战友的使用方法： trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用密斯用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边沿.再照紫外.② 上层培养液：上层培养液采取无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%0.2% BSA.③ 细胞：值得注意的是，有侵袭才能的细胞才可用于Transwell 侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP2的表达.如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就自觉停止Transwell侵袭实验，能够会造成不需要的华侈，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，其实不是笔小数目，还是小心为妙.别的，为了让实验成果更分明，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再停止实验.④ 基质胶：常常使用的是人工重构基底膜资料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等.CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝结成胶状，不成逆.同样的东西在sigma叫ECM.zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右.如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那末Matrigel就不需要购买了.⑤ 下层培养液：下层常常使用含5%－10% FBS的培养基，详细浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力衰的细胞可适当提高FBS浓度.下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的.⑥ 细胞培养板：常常使用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常常使用.细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板便可以.但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套.⑦ 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目标是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好.如果贴壁欠好的话可以试试看.linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室外面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN.别的，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用.2．步调2.1 Transwell小室制备2.1.1 无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干.如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN平均涂抹在小室的下面.用胶原（collagen）的话，一班配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上.② 水化基底膜：吸出培养板中残存液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min.还有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 6080µl (注意体积不成太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶.2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化.再吸去剩余培养液.2.2 制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬.调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超出5×105.详细实验时采取密度要自己试探，因为分歧细胞，其侵袭才能是分歧的.个人经历，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计成果的话将难以计数；而过少的话，能够还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要包管在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在.个人认为，对照组和处理尽能够不要分开计数，因为细胞数目标差别会严重影响实验成果.如果需要对细胞预处理而不克不及不分开计数，那末计数一定要多重复几次，力图准确，尽能够包管对照组和处理组细胞密度一致.2.3 接种细胞① 取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，分歧公司的、分歧大小的Transwell小室对细胞悬液量有分歧要求，请参考说明书.24孔板小室一般200µl.② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，分歧的培养板加的量有分歧要求，详细请参考说明书.这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡发生，一旦发生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留意，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板.③ 培养细胞：惯例培养12－48h（主要依癌细胞侵袭才能而定）.时间点的选择除了要思索到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目标影响也不成忽视.以我的课题为例，我使用的药物不但会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有分明抑制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50.用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并没有分明抑制，但24h后，抑制作用就开端出现了.所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那末就难以必定穿过膜的细胞比对照组少，毕竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目自己就比对照组少而引起的了.时间过长不成以，同样，过短也不成，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内能够侵袭才能不会有太大改变.同时从药物被吸收出来，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程.时间点的选择可尽能够长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不克不及有分明变更.别的，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会堆积成团，所以看到细胞不正常贴壁也不妨张，是正常现象在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡发生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重.因此，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡发生.2.4 成果统计检测穿过的细胞数有两种方法：2.4.1 直接计数法2.4.1.1 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室外面去.如下图：通过给细胞染色，可在镜下计数细胞① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 染色：常常使用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等.个人推荐采取0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞，直接染色即可.(2). 配制简单方便.(3). 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数.个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在.因为，虽然颠末准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确节制，能够某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下便可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则能够会染不上.③ 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜停止观察和摄影，把Transwell小室反过来底朝上便可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞.也有很多人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，便可以长期保管，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点华侈.取若干个视野计数细胞个数.论坛里一般采取3－5个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶尔性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候.我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置.我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.如图，蓝色部分暗示膜的大小，白色圆形暗示视野的大小，绿色方形则暗示摄影时所能拍下的视野的中心部分.这样，每一个小室都拍摄如下图的16个视野停止计数，这样得到成果是比较客观和准确的.2.4.1.2 “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不克不及附着在膜上，而是掉进下室.如下图：2.4.2 间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采取的方法，与常常使用的MTT实验是同样的原理.2.4.2.1 MTT法① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜淹没在培养基中，37℃ 4h后取出.③ 24孔板中加入500µl DMSO，将小室置于其中，使膜淹没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解.取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值.2.4.2.2 荧光试剂检测这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法近似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值.Chemicon的ECM554即属于这类.2.4.2.3 结晶紫检测上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是近似的.但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程其实不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色.这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，停止细胞计数.第三节 Transwell的其他应用的实验步调1．Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致，分歧的只是不需要铺Matrigel.个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验分明加快，所以细胞量要更大.我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106.别的，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%.2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步调做了一段时间的原代细胞培养，把经历拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：(1) 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（GibcoBRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM.(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞.(3) 离心后当即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC8 medium(Biofluids)冲洗一次.(4) 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO295% 空气含5% 胎牛血清(GibcoBRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC8 medium孵育6~10天.(5) 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验.显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此慎密毗连成单层细胞片3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，详细是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下概况涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的阁房加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，1218小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜接近阁房那一面的细胞，另外一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数.4．mci战友的内皮细胞HMEC1迁移实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serumfree MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及分歧浓度的药物，下室加入0.6ml serumfree的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并摄影，最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值.抑制率计算公式为：抑制率（%）=[(OD值给药组OD 值无刺激阴性对照)/（OD值不加药阳性对照 OD值无刺激阴性对照)] ×100%.。
Transwell实验技术(corning)
传统Transwell通透性支持物
Transwell嵌套可以提供四种膜直径6.5mm（24孔板），12mm（12孔板），24mm(6孔 板)和75mm（100培养皿）。表4列出了这些尺寸可以提供的细胞生长面积。
相对于每个规格，都有几种类型的膜和大范围的孔径可选择。具有专利的中心悬挂设计可 以防止培养液由嵌套壁和孔壁之间通过毛细作用流失。悬挂设计使得嵌套与底部有1mm的 差距，这样可以保证在嵌套移走的时候，形成的单层细胞不会被破坏。在嵌套壁上的缺口 可保证与底部接触。
பைடு நூலகம்SnapwellTM嵌套
Snapwell嵌套 (U.S. Patent No. 5,272,083) 是经过改良的Transwell嵌套，包括12mm 的经组织 培养处理的聚碳酯膜或透明的聚酯膜，以及一个分离环。这些嵌套主要用于运输和电生理 研究。一旦细胞长满，分离环固定的膜可以拆卸，并垂直或水平放置，或置于Ussing培养 室中。Ussing培养室可以通过哈佛仪器公司购买：
HTS-96 系统是高通量药物转导 研究的理想工具
HTS Transwell系统为机械操作 而设计
05
如何使用Transwell® 通透性支持物
使用提示
1. 通透性支持物上的细胞形态和密度受滤膜孔径的影响。 2. 一些孔径大的膜可以容许细胞穿过。 3. 在通透性支持物上生长的细胞的贴附对于起始接种密度很敏感。初次使用应接种不同密
常规使用指南
1．使用时先将培养液加入多孔板的孔中，将嵌套放入，再将含细胞的培养液加入嵌套内 部，推荐使用的培养液体积列在表5中。
选择合适的Transwell® 膜和孔径
Transwell通透性支持物可以提供三种膜材料：聚碳酯（PC），聚酯（PET）和胶原包被的 聚四氟乙烯（PTFE）。表1提供了这些膜特性的更多信息。
Transwell实验-超详细
Transwell侵袭实验总结第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1.Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
corning Transwell 孔径大小 选择指南
1．使用时先将培养液加入多孔板的孔中，将嵌套放入，再将含细胞的培养液加入嵌套内 部，推荐使用的培养液体积列在表5中。
总览
0.4 μm孔径聚碳酯膜的扫描电镜
PTFE膜的扫描电镜，显示孔径结构
在6孔板中的聚酯Transwell透明 嵌套显示膜的清晰度
12mm直径的Transwell嵌套带有 聚碳酯膜 02
细胞和组织培养技术在基础和应用生命科学领域的重要性日益提高。为尽可能的模拟体内 环境以培养某些特殊的细胞系，新的培养容器和细胞贴附的表面不断涌现。顺理成章的， 使用带有多微孔膜的通透性支持物培养这些细胞成为基本的方法。通透性支持物可以有效 改善极性细胞的培养，因为这些支持物允许细胞从其基底面和顶面分泌和吸收分子，从而 以更为自然的方式进行代谢。
有关这些产品的详细信息可以在下面及订购信息中找到。
传统Transwell通透性支持物
Transwell嵌套可以提供四种膜直径6.5mm（24孔板），12mm（12孔板），24mm(6孔 板)和75mm（100培养皿）。表4列出了这些尺寸可以提供的细胞生长面积。
相对于每个规格，都有几种类型的膜和大范围的孔径可选择。具有专利的中心悬挂设计可 以防止培养液由嵌套壁和孔壁之间通过毛细作用流失。悬挂设计使得嵌套与底部有1mm的 差距，这样可以保证在嵌套移走的时候，形成的单层细胞不会被破坏。在嵌套壁上的缺口 可保证与底部接触。
聚四氟乙烯（PTFE） 湿润时透明 可见细胞轮廓 无 50um 有 有 0.4, 3.0
化学兼容性
所有的Transwell膜都适用于组织学固定剂，包括甲醇和甲醛。聚酯Transwell膜具有最佳 的全面化学适用性。这些膜（不包括聚苯乙烯）都耐受多种酒精，胺类，脂类，醚类，酮 类，石油类和其他溶剂包括卤化碳氢化合物和DMSO，但是不推荐使用强酸强碱。
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
学会这5步，轻松搞定transwell实验
学会这5步，轻松搞定transwell实验生物学霸丁香通出品轻松采购无忧科研做肿瘤研究的人，很少有不知道 transwell 实验的，它是用来研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。
今天咱们就来讲讲怎么做肿瘤细胞的侵袭转移实验。
Transwell 侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。
我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞就要分泌金属蛋白酶将基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。
而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。
Transwell 简易图以下学霸君来介绍侵袭实验步骤：实验前准备：transwell 小室（一般选用12um），24 孔板，基质胶（corning），细胞实验所需的基本的材料。
基质胶铺板用BD 公司的Matrigel 1：8 稀释（可以直接用无血清的培养基稀释），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置37℃孵箱 1-4h 使Matrigel 聚合成凝胶（时间不宜太长，之前有人说在37 度孵箱过夜，反正元元师兄觉得不太可能）。
注意事项：1. 铺胶之前将枪头以及所用的耗材至于冰箱4 度当中，否则配胶的时候会直接凝固。
2. 铺胶的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。
3. 注意铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。
4. 注意无菌操作。
2制作细胞悬液1. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
2. 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 PBS 洗 1－2 遍，这一步很必要，否则细胞表面覆有血清培养基，细胞没有迁移侵袭的动力），用无血清培养基重悬。
Transwell实验
Transwell实验Transwell是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放臵在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
Transwell 使用介绍
1. Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（perme able supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
(完整版)Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
细胞迁移侵袭实验操作步骤（Transwell）
细胞迁移侵袭实验操作步骤（Transwell）迁移实验（cell migration assay ）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1 材料准备：可拍照显微镜，Tran swell小室，孔径8 ^m ,没包被胶的（Coster和Corni ng公司的也较常用），Transwell 迁移实验的细胞培养板24 孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell 小室相配套，BD 公司的Matrigel ，无血清DMEM ，（1% 胎牛血清）DMEM 和1640 培养基，DMEM 完全培养基，1640 完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS ，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS 结晶紫）2 步骤和流程2.1 基质胶铺板：用BD 公司的Matrigel 1 ：8 （根据细胞产生mmp 的量来决定）稀释，包被Transwell 小室底部膜的上室面，置37 °C 30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2 制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 －24h ，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1 —2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5X105/ml。
2.3 接种细胞①取细胞悬液100卩1加入Tran swell小室。
②24孔板下室一般加入600 ^l含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
transwell原理和技术
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
小室培养实验报告
一、实验目的本研究旨在通过Transwell小室共培养技术，观察细胞间的相互作用及其对细胞迁移能力的影响，为进一步研究细胞间的信号传导和肿瘤转移机制提供实验依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞系HepG2、人正常肝细胞系L022. Transwell小室：Corning公司产品，孔径为8.0 μm3. 培养基：DMEM培养基，含10%胎牛血清，青霉素和链霉素各100 U/mL4. 其他试剂：胰蛋白酶、EDTA、无菌水、细胞计数板、酶标仪等三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和L02细胞分别接种于6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后进行实验。
2. Transwell小室共培养：将Transwell小室置于6孔板中，在上室中加入1 mL 含10%胎牛血清的DMEM培养基，下室中加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。
将HepG2细胞接种于上室，L02细胞接种于下室，共培养24小时。
3. 细胞迁移实验：将Transwell小室取出，用棉签轻轻刮去上室中的细胞，用1 mL PBS洗涤3次，然后用4%多聚甲醛固定30分钟。
将固定后的Transwell小室放入显微镜下观察，计算上室中迁移至下室的细胞数量。
4. 数据分析：采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，实验数据以均值±标准差表示，采用t检验进行组间比较。
四、实验结果1. HepG2细胞在Transwell小室共培养条件下，迁移至下室的细胞数量明显多于L02细胞，表明HepG2细胞具有较强的迁移能力。
2. 与单独培养的HepG2细胞相比，共培养后的HepG2细胞迁移至下室的细胞数量显著增加，表明L02细胞对HepG2细胞的迁移具有促进作用。
3. 共培养后的HepG2细胞中，与L02细胞直接接触的细胞数量明显多于未接触的细胞，表明细胞间的直接接触对HepG2细胞的迁移具有促进作用。
五、讨论本研究通过Transwell小室共培养技术，观察了HepG2和L02细胞间的相互作用及其对细胞迁移能力的影响。
transwell细胞迁移
迁移实验（cell migration assay）实验材料（1）Transwell小室，孔径8μm (Corning) ,细胞培养板24孔板 ,培养板应当与购买的Transwell 小室相配套（2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养,PBS，2.5%FBS（3）固定液：4%多聚甲醛固定液或者甲醇（4）染色液：Giemsa染液或结晶紫染色（5）其他：小镊子，棉棒1材料准备：无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.2接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；②24孔板下室一般加入600µl含2.5%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了。
③种板，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
④培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。
24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
2.3染色计数①取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无菌的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。
② 0.1%结晶紫染色20 min，或Giemsa染色（5－10min，室温0.5h），用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。
③400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。
1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。
1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。
ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。
但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。
ﻫ２。
3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
Transwell实验原理与操作步骤
T r a n s w e l l实验原理与操作步骤Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membranefilters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有－μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择μm以下孔径。
细胞迁移实验技术之Transwell Assay
细胞迁移实验技术—Transwell AssayTranswell间接trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0 µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
Transwell小室结构示意图将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
Transwell Assay的应用：共培养体系：小于3.0 μm孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究的内容不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0 µm以下孔径。
常用0.4、3.0 µm。
在共培养过程中，将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
趋化性实验可用5.0、8.0、12.0 µm膜，具体选择哪种孔径根据细胞不同而定。
Transwell实验 超详细
Transwell侵袭实验总结第一节概念这里想明白两个概念,一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模子.关于Transwell这个词该若何解释,查了许多材料也未见精确的注解,我以为可以这么懂得吧,trans-这个词根有转移.转运.穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上懂得,这是一类有通透性的杯状的装配,依据Corning公司的Transwell解释书中的介绍,可以以为这是一种膜滤器（Membrane filters）,也可以为是一种有通透性的支架（permeable supports）.更精确地说,Transwell应当是一种实验技巧,这项技巧的重要材料是Transwell小室（Transwell chamber,Transwell insert）,其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不合厂家对Transwell会有不合的定名,而不合型号也可有不合外形,不合大小,依据实验须要,可有不合选择.但无论是何种外形,其症结部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与通俗的孔板是一样.这层膜带有微孔,孔径大小有0.1－12.0µm,依据不合须要可用不合材料,一般经常运用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）.下图是一个Transwell装配的纵切面将Transwell小室放入造就板中,小室内称上室,造就板内称下室,上室内盛装上层造就液,下室内盛装基层造就液,高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔.我们将细胞种在上室内,因为聚碳酸酯膜有通透性,基层造就液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研讨基层造就液中的成分对细胞发展.活动等的影响.运用不合孔径和经由不合处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共造就.细胞趋化.细胞迁徙.细胞侵袭等多种方面的研讨.下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不合细胞其体积不合,具体选择时要斟酌到细胞大小.这里重要谈几种大家经常运用的实验：（1）共造就系统：小于3.0um孔径前提下,细胞不会迁徙经由过程,是以,若研讨不涉及细胞活动才能,不须要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm 以下孔径.经常运用0.4.3.0µm.我们实验室用的是0.4µm.将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的影响.（2）趋化性实验可用5.0.8.0.12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反应下室成分对上室细胞的趋化才能.①细胞B对细胞A的趋化感化：将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的趋化感化.②趋化因子对细胞的趋化感化：将细胞种于上室,下室参加某种趋化因子,可研讨该趋化因子对细胞的趋化感化.（3）肿瘤细胞迁徙实验经常运用8.0.12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁徙才能.（4）肿瘤细胞侵袭实验经常运用8.0.12.0µm膜,道理与肿瘤细胞迁徙实验相似.上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁徙实验不合的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模拟体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要排泄基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解,方可经由过程聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭才能.用于研讨肿瘤细胞侵袭才能的肿瘤细胞侵袭模子有如下几种（引自司徒镇强《细胞造就》）：2.1 体内癌细胞侵袭模子2.1.1 皮下移植侵袭模子2.1.2 肌肉内移植侵袭模子2.1.3 腹腔内移植侵袭模子2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模子2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模子2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模子2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模子2.1.8 视网内界膜侵袭模子2.2 体外癌细胞侵袭模子2.2.1 体外静止器官造就法2.2.1.1 半固体造就基单细胞器官造就法2.2.1.2 液体造就基单细胞器官造就法2.2.2 半体外半体内器官造就法2.2.3 单层细胞器官造就法2.2.4 瘤细胞球体器官造就法2.2.4.1 静止球体器官造就法2.2.4.2 扭转动摇球体器官造就法2.2.5 单层细胞侵袭实验模子2.2.6 Transwell侵袭小室测定法可见,Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等号,Transwell有多种运用,侵袭实验也有多种办法.所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技巧运用于肿瘤细胞侵袭研讨的一种实验.因为其简略易行.反复性好,因而得到了越来越普遍的运用,但不克不及以为研讨肿瘤侵袭只有Transwell 一种办法.第二节 Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁徙实验,其他方面的Transwell运用我不太清晰,是以这里重要谈谈Transwell侵袭实验.1.实验用品：① Transwell小室：多种厂家可供给,论坛里经常运用的是Costar.Corning.BD临盆的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,尚有Boyden lipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert.这些厂家供给的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很便利,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是异常贵,24孔板配套的小室,每个价钱约130元,不推举给大家.BD也有已包被好的,价钱不清晰.Coster和Corning公司临盆的小室,是论坛里比较经常运用的,似乎是要本身铺胶,但据说每个小室成本只有40阁下,应当比较合适中国国情.下面是一些战友供给的价钱,具体建议大家接洽代理商咨询.linanping1979战友供给的价钱：coster的24孔板的transwell的价钱是456元RMB,8µm,用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy 战友供给的价钱：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的.梅林战友供给的BD价钱： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert）,似乎是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy供给的价钱是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人平易近币不到.平均每个20元不到.Transwell小室按照公司的请求,都是一次性运用的.不过其实洗洗泡泡照样可以反复用的.我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很清洁,用前用紫外里外都照30min.sword01战友供给的处理办法：用棉签轻轻擦去胶和不和细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,不和6h,微波,低火10min×2.因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次运用的小室只用来做不须要铺胶的迁徙实验.以前的Chemicon ECM550系列,膜很壮实,擦不坏,可以反复用许多次,但如今的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能反复用一次,真黑啊！许多战友说Costar 和Corning也是可以反复用的,大家可以尝尝.victoh战友对Millipore公司的millicell有比较具体的讲授,链接如下：本身没见过,有兴致的可以本身研讨一下.别的,依据论坛战友供给的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理.Transwell小室用事后,可把本来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,如许又可以用了,不过我没用过,有兴致的可以尝尝.maojianwen战友的运用办法： trasnwell小室做一次后,将本来的膜去掉落,从新泡酸,泡酒精,运用前照紫外,然后用密斯用指甲油（留意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上,剪掉落过剩的边沿.再照紫外.② 上层造就液：上层造就液采取无血清造就基,为保持渗入渗出压,需参加0.05%-0.2% BSA.③ 细胞：值得留意的是,有侵袭才能的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP-2的表达.假如不清晰细胞MMPs的表达情形,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不须要的糟蹋,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,其实不是笔小数量,照样当心为妙.别的,为了让实验成果更显著,可先撤血清让细胞饥饿12－24h,再进行实验.④ 基质胶：经常运用的是人工重构基底膜材料Matrigel,重要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,临盆厂家有BD.美国Collaborative Rsearch 公司等.CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司临盆的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不成逆.同样的器械在sigma叫ECM.zhangyong1036战友供给的价钱：BD 公司的matrigel 1500阁下.假如购置的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不须要购置了.⑤ 基层造就液：基层经常运用含5%－10% FBS的造就基,具体浓度依据细胞侵袭力而定,侵袭力衰的细胞可恰当进步FBS浓度.基层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白参加基层造就液作为趋化因子,但小我以为,FBS仍是最合适的.⑥ 细胞造就板：经常运用于Transwell侵袭实验的细胞造就板有6孔板.12孔板.24孔板等,以24孔最经常运用.细胞造就板没什么特别请求,通俗的细胞造就板就可以.但要留意,细胞造就板应当与购置的Transwell小室相配套.⑦ 此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),如许做的目标是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.许多战友以为这不是必须的,并且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好.假如贴壁不好的话可以尝尝看.linanping1979战友以为,假如造就时光很长（>24h）,细胞照样会掉落到下室里面去,所以有前提的话,最好照样在膜基层涂上FN.别的,值得一提的是,膜基层涂上FN还有必定的趋化感化.2．步调2.1 Transwell小室制备2.1.1 无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干.假如须要鄙人室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉落,汲取FN平均涂抹在小室的下面.用胶原（collagen）的话,一班配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上.② 水化基底膜：吸出造就板中残存液体,每孔参加50ul含10g/LBSA的无血清造就液,37℃,30min.尚有tianjin_glioma战友供给的办法：在上室的聚碳酸酯膜上参加稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (留意体积不成太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃ 30min使Matrigel 聚合成凝胶.2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列解释书请求,将小室放入造就板中,在上室参加300µl预温的无血清造就基,室温下静置15－30min,使基质胶再水化.再吸去残剩造就液.2.2 制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.② 消化细胞,终止消化后离心弃去造就液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清造就基重悬.调剂细胞密度至1－10×105,小我以为不要超出5×105.具体实验时采取密度要本身探索,因为不合细胞,其侵袭才能是不合的.小我经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,假如最后用计数法统计成果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时光点,所有的细胞都已穿过,是以起码也要包管在收样的时刻,上室内还要有必定量的细胞消失.小我以为,对比组和处理尽量不要离开计数,因为细胞数量标差别会轻微影响实验成果.假如须要对细胞预处理而不克不及不离开计数,那么计数必定要多反复几回,力图精确,尽量包管对比组和处理组细胞密度一致.2.3 接种细胞① 取细胞悬液100－200µl参加Transwell小室,不合公司的.不合大小的Transwell小室对细胞悬液量有不合请求,请参考解释书.24孔板小室一般200µl.② 24孔板下室一般参加500µl含FBS或趋化因子的造就基,不合的造就板加的量有不合请求,具体请参考解释书.这里要特别留意的是,基层造就液和小室间常会有气泡产生,一旦产朝气泡,基层造就液的趋化感化就削弱甚至消掉了,在种板的时刻要特别留意,一旦消失气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进造就板.③ 造就细胞：通例造就12－48h（重要依癌细胞侵袭才能而定）.时光点的选择除了要斟酌到细胞细胞侵袭力外,处理身分对细胞数量标影响也不成疏忽.以我的课题为例,我运用的药物不但会克制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有显著克制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h 的IC50.用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并没有显著克制,但24h后,克制造用就开端消失了.所以,用这个浓度来做Transwell,处理时光也必须限制在24h内,不然一旦药物克制了细胞增殖或者引诱出凋亡,使处理组细胞数量少于对比组,那么就难以确定穿过膜的细胞比对比组少,毕竟是因为侵袭被克制引起,照样处理后细胞数量本身就比对比组少而引起的了.时光过长不成以,同样,过短也不成,因为细胞内会有必定量的MMPs储存,短时光内可能侵袭才能不会有太大转变.同时从药物被接收进去,进而施展感化,影响MMPs表达,到最后释放到造就基中,还须要一个进程.时光点的选择可尽量长点,也可选择多个时光点研讨时光依附效应,但前提是这个时光规模内细胞数量不克不及有显著变更.别的,我看到细胞在小室内的形态不是正常造就贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会集合成团,所以看到细胞不正常贴壁也没紧要张,是正常现象在造就进程中,膜下会逐渐有少量吝啬泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我碰到过造就一段时光后,膜下消失了大气泡,亏得实时发明,不然效果将异常轻微.是以,小我建议,最好接种细胞后1－2h把造就板从造就箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生.2.4 成果统计检测穿过的细胞数有两种办法：2.4.1 直接计数法2.4.1.1 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉落到下室里面去.如下图：经由过程给细胞染色,可在镜下计数细胞① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 染色：经常运用的染色办法有结晶紫染色.台肦蓝染色.Giemsa染色.苏木精染色.伊红染色等.小我推举采取0.1%结晶紫染色,这种办法有如下优势：(1). 不须要固定细胞,直接染色即可.(2). 配制简略便利.(3). 染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完整洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值,间接反应细胞数.小我以为这是结晶紫染色最大的优势地点.因为,固然经由精确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以精确掌握,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,乃至细胞成堆,这种情形下就难以计数了,这种情形下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.运用结晶紫染色要留意,染色前要将膜风干,不然可能会染不上.③ 细胞计数：我们运用的是Leica DC 300F正置显微镜进行不雅察和摄影,把Transwell小室反过来底朝上就可清晰看到小室底膜高低室侧附着的细胞.也有许多人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保管,但是如许做小室就成了一次性的了,不免难免有点糟蹋.取若干个视野计数细胞个数.论坛里一般采取3－5个视野,也有人用10个,都是随机拔取,小我以为如许选择的视野带有很大的有时性,也会掺进工资影响,特别是计数视野较少的时刻.我拔取16个视野,不是随机选择,而是有固定的地位.我们运用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.如图,蓝色部分暗示膜的大小,白色圆形暗示视野的大小,绿色方形则暗示摄影时所能拍下的视野的中间部分.如许,每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数,如许得到成果是比较客不雅和精确的.2.4.1.2 “非贴壁”细胞计数因为某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不克不及附着在膜上,而是掉落进下室.如下图：2.4.2 间接计数法间接计数法重要用于穿细致胞过多,而无法经由过程计数获得精确的细胞数所采取的办法,与经常运用的MTT实验是同样的道理.2.4.2.1 MTT法① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 24孔板中参加500µl含0.5mg/ml MTT的完整造就基,将小室置于个中,使膜浸没在造就基中,37℃ 4h后掏出.③ 24孔板中参加500µl DMSO,将小室置于个中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分消融.掏出小室,24孔板于酶标仪上测OD值.2.4.2.2 荧光试剂检测这类办法一般是与Transwell小室一路出售的,其道理与MTT 法相似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值.Chemicon的ECM554即属于这类.2.4.2.3 结晶紫检测上文已说过,这里不再赘述,道理与MTT法也是相似的.但结晶紫染色还有个长处,就是染色和脱色的进程其实不影响膜上细胞,在脱色后还可从新染色.这是用正置显微镜拍摄的图,结晶紫染色,进行细胞计数.第三节 Transwell的其他运用的实验步调1．Transwell肿瘤细胞迁徙实验进程与Transwell侵袭实验根本一致,不合的只是不须要铺Matrigel.小我以为,因为没有基质胶的阻拦,细胞穿过膜的速度较侵袭实验显著加速,所以细胞量要更大.我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁徙实验的密度是1×106.别的,基层造就液的FBS浓度也可恰当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁徙实验的浓度是2.5%.2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞造就步调做了一段时光的原代细胞造就,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友配合商量：(1) 将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管掏出,置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma),100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）.无Ca 2＋.Mg2＋,无血清的MEM.(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞.(3) 离心后立刻用新颖的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5％胎牛血清.100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次.(4) 冲洗事后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活气,若存活率大于90％,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar）,以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天.(5) 孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电心理实验.显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中心,发展时常彼此慎密衔接成单层细胞片链接：3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁徙实验我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁徙实验,具体是这么做的：起首把Transwell倒置,在Transwell的PVPF 膜（0.8 um）的下概况涂一层fibronectin(10 ug/ml,50ul),37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600ul的造就基（含10%血清）的24孔板内,后在Transwell的闺阁参加细胞（100ul,用含0.1%血清的造就基稀释好本身所需密度）,放入造就箱,12-18小时后,掏出Transwell,用棉签擦去PVPF膜接近闺阁那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下不雅察细胞,记数.链接：4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁徙实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于造就箱中均衡1小时后,上室参加100µl用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不合浓度的药物,下室参加0.6ml serum-free 的MCDB131培液及20%FCS刺激迁徙,同时设置响应阴性及阳性对比,置于CO2造就箱中感化8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉落上层未迁徙细胞,显微镜(Olympus, DP50, Japan).下不雅察并摄影,最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD 值.克制率盘算公式为：克制率（%）=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对比)/（OD值不加药阳性对比- OD值无刺激阴性对比)]×100%.。
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Transwell通透性支持物可以提供三种膜材料：聚碳酯（PC），聚酯（PET）和胶原包被的 聚四氟乙烯（PTFE）。表1提供了这些膜特性的更多信息。
聚酯Transwell-透明嵌套的特点是带有在显微镜下呈透明的膜。这些膜经过处理，可以 让细胞更好的贴附和生长。Transwell-透明嵌套使细胞在相差显微镜下更易观察，可以 估计细胞的生长状态和单层细胞的形成。
度保证最佳生长。 4. 在培养之前将通透性支持物在培养基中孵育可以改善细胞得贴附和分布。 5. 与塑料培养表面一样，细胞在通透性支持物上仍然需要细胞外支架的包被。 6. 透明的Transwell是带有透明的，经组织培养处理的聚酯膜，细胞在相差显微镜下很容易
被观察。 7. Transwell-COL带有PTFE膜，经过等摩尔数的I型和III型牛胎盘胶原处理。从而形成了覆
孔密度
在三类膜中只有胶原包被的PTFE膜没有确定的孔密度，因为它具有是曲折孔道的膜。两 种具有额定孔密度的膜是聚酯膜和聚碳酯膜。聚酯Transwell膜的孔密度不像聚碳酯膜 那么高，但是它具有更好的光学清晰度，康宁聚酯膜和聚碳酯膜的额定孔密度详见表3。
选择合适的Transwell系统
Transwell通透性支持物有三种基本设计： 传统的Transwell平板嵌套在6, 12和24孔板及10cm培养皿中独立使用。 HTS Transwell-24和HTS Transwell-96 嵌套按特殊规格包装以方便操作和自动处理。 Snapwell嵌套在扩散或Ussing chambers 模型中使用。
常规使用指南
1．使用时先将培养液加入多孔板的孔中，将嵌套放入，再将含细胞的培养液加入嵌套内 部，推荐使用的培养液体积列在表5中。
Transwell® 通透性支持物的 选择和使用手册
目录
contents
02 总览 02 选择合适的Transwell膜和合适的孔径 03 选择合适的Transwell 系统 06 如何使用Transwell通透性支持物 06 使用提示 06 常规使用指南 07 技术支持 08 订购信息 08 聚酯（PET）Tranwell 嵌套 08 胶原包被的Tranwell-COL嵌套 09 聚碳酯Transwell嵌套 10 Snapwell 嵌套 10 高通量筛选HTS Transwell-24系统 11 6，12和24孔细胞培养板 12 HTS Transwell-96系统
总览
0.4 μm孔径聚碳酯膜的扫描电镜
PTFE膜的扫描电镜，显示孔径结构
在6孔板中的聚酯Transwell透明 嵌套显示膜的清晰度
12mm直径的Transwell嵌套带有 聚碳酯膜 02
细胞和组织培养技术在基础和应用生命科学领域的重要性日益提高。为尽可能的模拟体内 环境以培养某些特殊的细胞系，新的培养容器和细胞贴附的表面不断涌现。顺理成章的， 使用带有多微孔膜的通透性支持物培养这些细胞成为基本的方法。通透性支持物可以有效 改善极性细胞的培养，因为这些支持物允许细胞从其基底面和顶面分泌和吸收分子，从而 以更为自然的方式进行代谢。
盖在滤膜纤维上的具有生物稳定性的胶原骨架。这些Transwell嵌套适用于需生物包被的 细胞培养。
实用小贴士
首先将培养液加入培养板，再 将含细胞的培养液加入 Transwell嵌套
Transwell®嵌套
上部空间
多孔膜 下部空间
嵌套的多孔底部使研究者可以从上层或下层接触到细胞，从而为体外的细胞运输和其他代谢活性研究提供通用的工具。
选择孔径
在实验中使用Transwell®通透性支持物时选择合适的孔径也是十分重要的。表2总结了通透 性支持物的常规应用和推荐使用的孔径。最小孔径的Tanswell膜（0.1um）主要应用于药物 转导研究。细胞侵袭，趋化性和运动性研究通常采用3.0um或以上的孔径的Tranwell膜。 细胞从膜的孔中迁徙通过的能力与选用的细胞系及培养条件有关，同时也与孔径相关。小 于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过。对于一些要求严格的实验，康宁建议在实验中 选用一系列孔径作为对照来确定哪种尺寸最适合于你的细胞培养和特殊应用。还有一 个方 法就是参照已经发表的文献的推荐。若需更多的使用和应用信息， 请访问康宁网站上技术 信息部分的Transwell。
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总览
表3. Transwell® 聚酯膜和聚碳酯膜的额定孔密度
额定孔密度 孔径
聚酯膜
聚碳酯膜
0.4um 1.0um 3.0um 5.0um 8.0um
1 x 108孔/cm2 无
2 x 106孔/cm2 4 x 105孔/cm2 1 x 105孔/cm2
4 x 106孔/cm2 1.6 x 106孔/cm2 2 x 106孔/cm2
表2. 通透性支持物应用选择表
应用 转导和渗透性研究 超大分子，离子，水，低分子量溶液，激素，生长因子等 细胞极性 离子通道，酶，转运蛋白，受体，脂类的极性分布 分类和定向靶点 极性的形成和维持 紧密连接的合成和装配 胞吞作用 蛋白转换 膜循环 生长因子，激素，抗体，病毒，毒素等受体-培体相互作用 药物运输 受体定位和药物反应极性 药物对于血管通透性 药物运输通过表皮（Caco-2细胞）和内皮屏障 药物运输通过脑微血管内皮细胞 转移潜力和侵袭 肿瘤侵袭和转移 克隆化检测 侵袭抑制物 细胞外支架作用 趋药性/动力研究 噬菌作用 血液中成形因子的趋药性与趋触性响应 组织巨噬细胞的移动 共培养 细胞-细胞相互作用 细胞-底物相互作用 肿瘤异质性 细胞-细胞外支架相互作用 饲养层-干细胞相互作用 微生物致病机理 病毒，细菌和寄生虫对宿主细胞膜的附着 入侵和透过内皮屏障 微生物受体 药物对微生物受体的效应 组织重建 伤口愈合 血管生成 表皮再生 炎症反应 体外受精 粒层细胞培养 类固醇生成 内分泌和旁分泌影响粒层分化，胚囊从透明层孵化，底物结合，滋养层细胞生长
HTS-96 系统是高通量药物转导 研究的理想工具
HTS Transwell系统为机械操作 而设计
05
如何使用Transwell® 通透性支持物
使用提示
1. 通透性支持物上的细胞形态和密度受滤膜孔径的影响。 2. 一些孔径大的膜可以容许细胞穿过。 3. 在通透性支持物上生长的细胞的贴附对于起始接种密度很敏感。初次使用应接种不同密
总览
表1.Transwell膜特征
特点
光学特性 细胞可见度 组织培养处理 膜厚度 Matrix/ECM 包被性 胶原处理 可提供孔径（um）
聚酯（PET） 透明 好 有 10um 有 无
0.4, 1.0, 3.0, 8.0
聚碳酯（PC） 半透明 较差 有 10um 有 无
0.4, 3.0, 5.0, 8.0
有关这些产品的详细信息可以在下面及订购信息中找到。
传统Transwell通透性支持物
Transwell嵌套可以提供四种膜直径6.5mm（24孔板），12mm（12孔板），24mm(6孔 板)和75mm（100培养皿）。表4列出了这些尺寸可以提供的细胞生长面积。
相对于每个规格，都有几种类型的膜和大范围的孔径可选择。具有专利的中心悬挂设计可 以防止培养液由嵌套壁和孔壁之间通过毛细作用流失。悬挂设计使得嵌套与底部有1mm的 差距，这样可以保证在嵌套移走的时候，形成的单层细胞不会被破坏。在嵌套壁上的缺口 可保证与底部接触。
推荐孔径 0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um 5.0, 8.0, 12.0um 3.0, 5.0, 8.0um 0.4, 1.0, 3.0um
0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um
SnapwellTM嵌套
Snapwell嵌套 (U.S. Patent No. 5,272,083) 是经过改良的Transwell嵌套，包括12mm 的经组织 培养处理的聚碳酯膜或透明的聚酯膜，以及一个分离环。这些嵌套主要，或置于Ussing培养 室中。Ussing培养室可以通过哈佛仪器公司购买：
无 1 x 105孔/cm2
*数据为额定值，可能有生产流程误差有所不同，为保证实验成功，我们推荐研究者确立自己的实验方法。
表4. Transwell 通透性支持物生长面积
嵌套直径
多孔板和培养皿类型
嵌套膜生长面积
4.26mm
96 well
0.143 cm2
6.5mm
24well
0.33 cm2
12mm
HTS Transwell-24 培养系统可以提供处理过的0.4um孔径及3.0um孔径的聚碳酯膜，或0.4um 孔径的聚酯膜，具有对细胞贴附，生长和分化极佳的界面。一个一体化的储液板可以减少 在培养过程中的液体处理操作（培养液可以一次性快速换掉）。一旦细胞层长满，HTS Transwell-24 嵌套可以转移到一个普通的康宁®24孔培养板上进行实验。
12well
1.12 cm2
24mm 75mm
6well 100mm培养皿
4.67 cm2 44 cm2
*数据为额定值，可能有生产流程误差有所不同，为保证实验成功，我们推荐研究者确立自己的实验方法。
HTS Transwell系统
HTS Transwell系统是24个或96个独立Transwell嵌套通过一个坚固的，可以由机械臂操作的 支持物连接而成，从而可以作为一个单位来操作。这使得HTS Transwell系统成为自动操作 系统，高通量药物运输(Caco-2细胞)和毒性研究的理想工具。
HTS Transwell-96培养系统 (U.S. Patent No. 6,943,009) 包括以下几个部分：一个96孔嵌套 板，可以选择1.0或8.0um孔径的聚酯膜，或者0.4um, 3.0um, 5.0um孔径的聚碳酯膜；带有可 拆卸的培养液稳定装置的储液板用来加液或换液；检测使用的接收板（黑色或透明）；2 个盖子， 以防止挥发和污染。每个嵌套具有0.143 cm2 的生长面积。顶面及侧面的大开口便 于添加和取样。