抗原决定簇选择课件

• 一般情况下，一个多肽表位含5~6个氨基酸残基；一个多糖 表位含5~7个单糖；一个核酸半抗原的表位含6~8个核苷酸。
• 抗原表位的大小与相应抗体的抗原结合部位相适合。
• 一个抗原表位的特异性由组成它的所有残基共同决定，但其 中有些残基在与抗体结合时比其它残基起更大作用，这些残 基被称为免疫显性基团。
➢后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续 的氨基酸组成。
分类
按照与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细 胞抗原表位。
特性 表位分子 MHC分子 表位性质 表位大小 表位类型
T细胞表位
TCR 必需
主要是线性多肽 8-12氨基酸(CD8-TC) 12-17氨基酸(CD4-TC) 线性表位
B细胞表位
BCR
无需
天然的多肽、多糖、脂 多糖、有机化合物 5-15个氨基酸，5-7个 单糖或5-7个核苷酸 构象、线性表位
表位位置
抗原分子任意部位
抗原分子表面
研究意义
• 表位是蛋白质抗原性的基础 ，研究蛋白质抗原表位 ， 对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型 疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。
• 该法对蛋白质的一级结构不作要求，但测定结果只能是抗原的线性表位。
• 化学切割法中常用的试剂：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。
• 酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8 蛋白酶等。
• 水解后采用各种分离方法如SDS-PAGE、凝胶过滤、离子交换将水解片段 分开，然后用Western blot，ELISA等各种检测手段来检测。结果可通过理 论肽段分子量的推断或相应的氨基酸序列分析来判断。
• 抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从 而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗体或 致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。
• 抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。
C
抗原分子以其B细胞表位与抗体分子的抗原结合部位发生互补性结合 A.抗原--抗体复合物的立体构象； B.采用电脑技术将抗原和抗体分子分开，可见抗原和抗体分子的相互作用仅发生 在抗原分子的B细胞表位和抗体分子的抗原结合部位之间，两者呈现结构互补。 C.抗体的互补决定区与抗原表位结合示意图
• 在研究构象性表位时的minotopes方法即采用类似的方法，通常从二肽开 始合成并逐渐增加肽链长度及置换氨基酸种类，直至达到与抗体的最大结 合为止。
研究方法
2.2 基因工程法（噬菌体随机肽筛选法）
➢ 该法先利用基因克隆技术将合成的 一组寡核苷酸混合物（小肽基因混 合物）克隆至线性噬菌体基因组中， 使之以融合蛋白的形式在噬菌体的 外壳蛋白的氨基端表达。再利用生 物素或酶标记的抗体筛出特异的噬 菌体，并进行扩增，再筛选，从结 合特异抗体的噬菌体DNA序列推断 出氨基酸序列，并合成相应的短肽， 验证筛选结果。
抗原表位--分类
• 覆盖型和非覆盖型表位
某些抗原分子表面，不同表位之间相对分离，各自结合 特异性抗体，互不影响，这类表位被称为非覆盖型表位。
若某一表位与相应抗体结合会影响另一表位与抗体的结合， 此类表位称为覆盖型表位。
• 功能性和隐蔽表位
位于抗原分子表面的表位易被相应淋巴细胞所识别，即具 有易接近性，可直接启动免疫应答，故称为功能性表位。
✓ 对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相载 体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一定 条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结合片 段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段以确定 结果。
• 近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地确 定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位。
2. 合成肽库方法
研究方法
肽库是大量某一长度(如六肽)的短肽的集合，它包括了该长度 的短肽的各种可能序列或其中的绝大部分。
2.1 有机合成法
• 有机合成法就是直接利用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短肽。 通过这种合成可以保证各种序列的多肽等机率出现，每个载体上只含有一 种序列的短肽。
• 优点是构建方法简单，迅速。缺点是不能扩增，筛选比较麻烦，需进行荧 光标记或ELISA，在显微镜下操作工作量比较大。
存在于抗原分子内部的表位无直接触发免疫应答的功能， 称为隐蔽表位。若通过理化因素处理抗原，使其结构发生改变， 内部的隐蔽表位被暴露，可能成为新的有功能的表位。
分类
• 按表位结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。
➢连续性表位又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成 通常这种结合比较弱，因为小肽并不含完整天然蛋白的构象， 在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位的一部分。Байду номын сангаас其 研究依赖于多肽固相化学合成技术。
• 应用：多在诊断与疫苗的研究中,尤其是在制作良好 的特异性诊断试剂盒中更为重要。
抗原表位研究方法
1.传统化学“切割”法或酶法（classical epitope mapping）
•
通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克隆
抗体筛选能与之起阳性反应的片段。
1.1 用化学法或酶“切割”抗原，分离抗原肽段
• 利用该法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱酯酶、 玻璃体结合蛋白、磷脂酶基质蛋白等。
研究方法
1.2 水解抗原-抗体复合物
• 这是一个直接的确定线性及构象性抗原表位的方法，又称为Protein footprinting。其理论依据为抗原--抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水 解。
根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。
✓ 对于蛋白酶水解位点较少的抗原，一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反应， 然后酶解，SDS-PAGE分离水解产物，分析结果。
✓ 对于蛋白酶水解位点较多的抗原，采用HPLC法，将抗原--抗体复合物的酶 解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰 高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。
抗原决定簇的确 立与选择（一）
报告内容
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概念 研究意义 研究方法
抗原表位--定义
• 抗原表位，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，是指 抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，因而表位代表了 抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表 面的抗原受体结合。严格说来，抗体的特异性是针对表位而不 是针对完整的抗原分子的。