Trizol法提RNA操作说明书
TRIZOL说明书
trizol 中文说明书trizol 试剂是一种从组织及细胞中提取总rna的专用试剂。
这种试剂是一种酚和硫氰酸胍的单相溶液，是将chomczynski 和sacchi发明的一步rna提取法的改进。
在样品匀浆或分析过程中，trizol 试剂可在分裂细胞及溶解胞膜的同时保持rna的完整。
在匀浆后加入氯仿，可将溶液分为水相和有机相。
rna均在水相中。
吸取水相加入异丙醇，得到rna沉淀。
去除水相后，样品中的dna及蛋白质可通过进一步连续的沉淀而得到。
中间相加入乙醇可沉淀dna而有机相加入异丙醇则能沉淀出蛋白质。
dna的再纯化可能对标化样品的rna产量有作用。
2．这一技术可以用于人，动物，植物或细菌株的微量组织（50—100mg）及细胞（5×106），也可以用于大量检材（≥1g）及细胞(﹥107).该方法简便易行,可用于同时检测大量样品,全部过程1小时内可以完成.用trizol 试剂分离的rna 没有dna及蛋白质成分.这种rna可用于northern印迹分析,斑点杂交,多聚(a)+检出及vitro转移, rna酶蛋白分析及分子克隆.用于pcr反应时,当两个引物位于同一外显子时应用扩增特异dna酶i处理提取出的rna.3． trizol 试剂可用于分子量从大到小的各种rna的提取.例如,大鼠肝脏提取出的rna,经琼脂糖凝胶电泳,eb染色后可显现出7kb和15kb的大分子量的rna谱带(包括mrna和hnrna), 位于～5kb(28s)和～2kb (18s)的两条主要的核糖体rna谱带及大小在0.1kb-0.3kb之间的低分子量rna(trna,5s).分离出的rna当溶于双蒸水中时a260/280为1.6-1.8之间.每毫克组织所能提取的rna量约为:肝和脾,6-10μg;肾,3-4μg;骨骼肌和脑,1-5μg;胎盘,1-4μg.从1×106培养细胞中提取的rna量约为:上皮细胞,8-15μg;成纤维细胞,5-7μg.需要但未提供的试剂:1. 氯仿2. 异丙醇3. 75%乙醇(depc处理水配制)4. 无rna酶水或0.5%sds溶液(制备无rna酶水:将水倒进无rna酶的玻璃容器中,加入depc至0.01%(v/v)放置过夜后高压灭菌). sds溶液必须用depc处理后高压灭菌的水配制.rna分离提取步骤:1．匀浆a. 组织每50-100mg组织加入1ml的trizol 试剂后用匀浆机或玻璃棒匀浆。
总RNA的提取（Trizol法提取）（PDF）
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
【精品】Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南48
【精品】Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南48Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南 (破碎组织?分离RNA?沉淀RNA?洗涤RNA?融解RNA?保存RNA) 1 试剂:三氯甲烷(氯仿)，异丙醇，75?乙醇，无RNase的水、Trizol reagent 2 材料与仪器:EP管匀浆器移液枪漩涡振荡器低温高速冷冻离心机冰袋电泳仪琼脂糖凝胶超净工作台3 操作步骤:3.1 准备工作A 玻璃匀浆器、75?乙醇预冷，离心机预冷至4? 打开超净工作台紫外灯15分钟以上B 用酒精擦拭台面 EP管标记3.2. 匀浆处理1 取一定量的纯化过的孢子悬浮液，12000rpm ，离心5min，弃上清 a 或者用匀浆仪进行匀浆处理，悬浮液不经离心，直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.，然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器，转移至1.5ml EP管中b 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次.(离心取细胞，67每5-10×10动物、植物和酵母细胞或每10细菌细胞加1ml Trizol。
加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理) 2 1ml Trizol Reagent，震荡混匀3. 将匀浆样品在15-30?放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
4. 可选步骤:4 ? 12 000rpm离心10min，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
5. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。
TRIZOL试剂提取细胞RNA和蛋白步骤
TRIZOL试剂提取细胞RNA和蛋白步骤
1. 0.3-0.4 ml Trizol 加入每个6 cm皿，刮取细胞到离心管中，静置5-10分钟。
2. 加入0.1 ml氯仿，震荡，静置10分钟，4度13000 rpm 离心15分钟。
3. 取上清用于提取RNA，下层用于提取蛋白。
上清的处理(RNA)：
1、上清打入新的RNase free离心管，加等量异丙醇，震荡，静置10分钟。
2、4度12000 g离心15分钟，弃去上清（倒掉，枪头在管口吸），沉淀为RNA。
3、加入1 ml 75% 乙醇（现配，用DEPC水稀释无水乙醇）洗涤沉淀。
4、4度12000g 离心5分钟，弃去上清（倒掉，枪头在管口吸），管口倒置，在卫生纸上，晾干15分钟。
5、加入20微升DEPC水溶解沉淀，微量分光光度计测质量。
下层的处理(蛋白)：
1、把中层吸掉，下层液加200微升无水乙醇混匀，静置5分钟，4度5500rpm离心10分钟，取上清移入新的离心管。
2、往新的离心管液体里加入1毫升异丙醇，充分混匀，室温静置10分钟，4度13000rpm 离心10分钟，弃上清。
3、加入1毫升0.3 mol/L 95%乙醇盐酸胍溶液，室温静置20分钟，4度13000rpm离心10分钟，弃上清。
4、重复步骤3 2次
5、加入1毫升无水乙醇，室温静置20分钟，4度13000rpm离心10分钟，弃上清。
6、室温干燥15分钟，用现配1% sds溶液溶解蛋白，不溶物以4度12000rpm离心10分钟去除。
7、上清液与5x loading buffer混匀，煮沸10分钟，存于-20度冰箱待用。
trizol提取RNA说明书
Trizol 使用说明书一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化 RNA。
RNA 质量的高低常常影响cDNA 库，RT-PCR 和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。
Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）三、准备工作RNase 酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是 RNase 完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与 RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC 配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取 RNase-free 的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC 使 DEPC 的终浓度为 0.1%。
注意：DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将 DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C 烘烤 3 小时以上。
诺维赞trizol说明书
诺维赞trizol说明书1、该法从细胞中提取RNA——用匀浆器将组织磨碎，加入TRIzol处理组织。
5分钟后加入氯仿，以每分钟12000转离心5分钟，样品即分成水样层、中间层和有机层。
2、RNA存在于水样层中，收集水样层后可以通过异丙醇沉淀RNA来还原。
3、在除去水样层后，中间层中的DNA和蛋白质也能相继以沉淀的方式还原：乙醇能使中间层的DNA沉淀析出，在中间层中加入异丙醇能沉淀出蛋白质。
4、每100mlTRIzol可以抽提100个六孔板中的样品或100个50-80mg的组织样品。
无论样品是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织（50-100mg)和细胞（约五百万个）及大量的组织（≥1g）和细胞（超过一千万个）均有较好的分离效果。
5、每一百万细胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA，每毫克组织用TRIzol抽提可得1-10微克RNA（产量因细胞和组织不同而异）。
6、TRIzol操作上的简便性允许其同时处理多个样品，所有的操作可以在一小时内完成。
7、TRIzol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白质的污染，故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA 酶保护分析和单分子克隆（PCR）。
8、如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNaseI(Cat.No.18068）来处理抽提的总RNA。
9、TRIzol试剂能促进不同种属、不同分子量大小的多种RNA 的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA经过琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7kb和15kb之间的不连续的高分子量条带（mRNA和hnRNA成分），两条优势核糖体RNA条带位于~5kb（28S）和~2kb（18S），低分子量RNA介于0.1和0.3kb之间(tRNA,5S）。
当抽提的RNA用TE稀释时，其A260/A280比值≥1.8。
抽提小RNA时宜-70℃沉淀过夜。
TRIzol-法提取血液总RNA
TRIzol 法提取血液总RNA
一、所需试剂、耗材
1. 0.1% DEPC-DDW;
2. 5ml, 2ml, 1.5ml灭菌离心管；
3. TRIzol；
4. 氯仿；
5. 异丙醇；
6. RNase-free water；
7. 70% DEPC-EtOH;
8. 检测用胶盒等
二、操作步骤
1. 取经过DEPC-DDW泡过，且灭菌烘干的7 ml 离心管；
2. 在0.5 ml小鼠全血（4C）中加入3 ml的TRIzol，震荡摇匀，室温静置5 min；
3. 将上述混合液体转移到灭菌的2 ml离心管中，12000 rpm 4℃离心5 min；
4. 将上清液移至新的1.5 mL离心管中；
5. 加入0.2 ml的氯仿，震荡摇均匀，室温静置5 min；
6. 12000 rpm 4℃离心15 min；
7. 将上清液移至新的1.5 ml离心管中，加入等体积-20C预冷的异丙醇，
-20C静置10 min；
8. 12000 rpm 4℃离心10 min；
9. 向沉淀中加入1 ml 70% DEPC-EtOH清洗沉淀;
10. 12000 rpm 4℃离心15 min;
11. 弃上清液保留沉淀，室温干燥10 min；
12. 加入30 μl RNase-free DDW 溶解RNA沉淀；
13. OD值检测（OD260/OD280=1.8-2.0）以及1% agrose gel检测（5ul）；
14. -80℃保存。
28S
18S
5.8S。
RNA提取trizol试剂盒说明书
注：各种样品的最大使用量（1ml Trizol）操作步骤：1. 在液氮中将组织(单头飞虱)研磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5ml离心管中。
细胞经计数后直接加入离心管，然后5000rpm室温离心去上清。
每100mg组织或5×106个细胞加1ml的Trizol。
注意：如果组织量（1-10mg）或细胞数很少（1×102-1×104），在样品中加入800μl的Trizol，用枪头反复抽吸混匀，再加入糖原（终浓度为250μg/ml），剧烈振荡或用匀浆器匀浆。
2. 用1ml针筒，26-G号（6#）针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5-ml离心管中。
3. 加入200μl氯仿/异戊醇（24:1）或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。
4. 台式离心机上，12000rpm，室温离心5分钟。
5. 将上清液小心转移到RNase-free 1.5ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，室温下放置5分钟。
（注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染）6. 台式离心机上，12000rpm，室温离心5分钟。
7．小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。
8. 用70%酒精洗涤两次，每次700μl，12000rpm，室温离心2分钟。
9. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。
10. 真空离心干燥3-5分钟，或放在室温下使酒精完全挥发。
11. 沉淀用30-50μl DEPC-H2O溶解。
如发现沉淀难溶，68℃处理10分钟。
对于胰腺，肾等组织中RNase含量很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解。
12．DNA的分析和定量：（1）测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。
按1 OD=40μg RNA计算RNAD的产率：OD260/280在1.8-2.0视为抽提的RNA纯度很高。
若需精确量化，只有浓度在4μg/ml以上的样品适于用光度计测定。
RNA提取Trizol 使用说明书
Trizol使用说明书一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、 料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、 璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
RNA提取方法（TRIzol法）
RNA提取方法（TRIzol法）RNA 提取方法（TRIzol法）一、试剂准备1、TROzlo试剂、氯仿、75%乙醇（0.1% DEPC配制）。
2、塑料器皿需用0.1% DEPC 水浸泡。
3、0.1%DEPC水：100ml dd水中加入DEPC0.1ml，充分振荡，37℃孵育12h以上，121℃高压灭菌20min，于4℃保存。
二、操作步骤1、样品处理（1）组织：50-100mg组织中加入1ml TROzlo试剂。
（2）单层细胞：加入TROzlo 试剂1ml/cm2平板。
（3）悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。
每5-10×105动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌加入1 ml TROzlo试剂。
2、将上述样品于15-30℃静置5min，使核蛋白充分解离。
3、加入0.2ml（1 ml TROzlo试剂）氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。
4、于2-8℃12000g离心15min。
离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。
5、取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。
6、于2-8℃12000g离心10min后弃去上清。
7、向沉淀中加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀。
8、于2-8℃7500g离心5min后弃上清9、将RNA样品凉干（不要彻底干燥），加入适量DEPC水溶解（可于55-60℃促溶10min）。
三、注意问题1、在加入氯仿之前（第1步），样品能于-60- -70℃保存至少一个月。
2、RNA沉淀（第6步）在75%乙醇中于2-8℃能保存至少一周，于-5- -20℃能保存至少一年。
四、RNA定量RNA（mg/mL）=40×OD260×稀释倍数（n）/1000 RNA纯品OD260/OD280=2.0 五、RNA电泳（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
组织RNA提取操作规程(TriZol)
组织RNA提取操作规程（TriZol提取RNA）1、目的提取组织总RNA。
2、方法TriZol法提取。
3、检测鉴定所需试剂和设备TriZol、液氮、氯仿、异丙醇、无水乙醇、1.5ml EP管、研磨器（组织粉碎仪或超声粉碎器）、移液器、低温高速离心机。
4、操作步骤4.1 组织处理4.1.1贴壁细胞弃去培养基后加入适量 Trizol，用枪头把细胞从板上吹下，然后转移到1.5ml EP管中。
4.1.2组织用液氮研磨成粉末后挑少许粉末于已加入1ml Trizol的EP管中，剧烈震荡使粉末分散，使细胞裂解完全。
4.2 加入氯仿0.2ml/ml Trizol ，用力振摇15 sec。
15－30℃下孵育2-3min，离心（4℃，12，000g，15min）。
4.3 离心后液体分为三层，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
4.4 加入等体积异丙醇，混匀，-20℃下孵育30min，离心（4℃，12，000g，10min）。
4.5 去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，轻微振荡15sec，离心（4℃，7，500g，5min）。
4.6 小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。
最好是用枪头吸取上清，尽量除去。
4.7加入30μl DEPC水溶解，-80℃冰箱保存。
5、结果检测5.1 RNA含量的检测取1μlRNA样品稀释1000倍后在DU730上测定RNA浓度，以及OD260/280比值。
5.2 RNA质量的检测（此步骤需要PCR扩增吗？）在1%的凝胶上电泳，观察28S、18S、5S分布情况。
6、注意事项6.1样品量和 Trizol 的加入量一定要按步骤（4.1.2？）的比例，不能随意增加样品量或减少 Trizol 量，否则会使内源性 RNase 的抑制不完全，导致 RNA 降解。
6.2作使用的仪器设备均已对RNA酶进行过处理（DEPC处理）。
6.3个人防护，防止操作过程中RNA酶污染，全过程要戴手套、口罩、帽子等。
Trizol法提取总RNA(细胞和组织)
Trizol法提取总RNA
1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol 试剂裂解；
②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；
2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；
3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；
4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；
5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清；
6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）；
7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀；
8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录；
9、进行反转录或分装保存于-80℃。
TRIzol中文说明书
TRIzol2-8℃避光保存产品包装：100ml蓝色透明液体产品简介：TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol试剂有多组分分离作用,TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。
对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。
分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northernblot，dotblot，ployA筛选，体外翻译，RNase 保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。
共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。
蛋白质可用于westernblotting。
注意事项：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。
如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤。
预防RNase污染注意事项：1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
3．RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌。
注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。
TRIzol RNA提取方法及步骤
TRIzol法RNA提取的具体步骤及方法（一）试剂准备1．TRIzol试剂。
2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPC H2O配制）5．DEPC H2O（二）操作步骤1．样品处理：（1）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
（2）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。
2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
3．4℃离心，12000g×15min，取上清。
4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。
6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。
4℃，7500g×5min，弃上清。
7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事项1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。
二、总RNA定量RNA定量方法与DNA定量相似。
RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。
因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml 的单链RNA。
如用1cm光径，用ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。
若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。
trizol提取RNA
RNA的提取一、准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。
二、操作步骤：b. 单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm 直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。
TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c. 细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
1. 匀浆处理：a. 组织将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。
样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。
用异丙醇沉淀水相中的RNA。
每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
invitrogen trizol rna抽提说明书
RNA抽提全过程(TRIZOL)一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
或直接购买经DEPC处理的枪头和EP管,每盒大约30元,基本上试剂公司都可以购买。
（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次（或180度干烤）。
（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。
（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml 容量瓶中静置4小时后备用。
配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。
（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。
（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。
提RNA及反转步骤
提RNA,反转一．Trizol法抽提总RNA1.Trizol用量：组织：50-100mg tissue—1ml T rizol贴壁细胞：1ml Trizol—10cm2培养面积/30mm 细胞平皿；悬浮细胞：1ml Trizol—5-10×10∧6 cell 2．加入Trizol后用枪吹打均匀，室温静置10min，吹打均匀的溶液室温下保存数小时，在-60或-70℃至少保存一个月；3．1ml Trizol溶液中加入氯仿200ul，剧烈震荡15s，室温下静置两分钟；4.离心：4℃，12000g，15min5.取上层水相至新的无酶EP管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温静置10min6.离心：4℃，12000g，10min7.弃上清，沉淀即为RNA，加入1ml 75%乙醇（1ml Trizol所提RNA）(此时的RNA可在-20℃保存至少一年，在4℃保存至少一周)涡旋8.离心：4℃，7500g，5min9.弃上清，超净台干燥5-10min（不可完全干燥），溶于20-50ul 无酶水，并用枪吹打均匀，于55-60℃水浴10-15min10.测量总RNA浓度：RNA 260/280＞1.8DNA 260/280 1.6~1.8二．反转Takara反转体系（10ul）：2ul mix≤500ng RNA无酶水补齐体积至10ml条件：37℃15min→85℃15sPromega反转体系（25ul）：RNA 2.5ugOligoDT 1ul 17.05ul无酶水70℃，5min，立即置于冰上（使RNA变性，打开二级结构）5×M-MLV Buffer 5ulDNTP MIX 1.25ulRNA Inhibitor 0.7ul 7.95ulM-MLV 1ul42℃，1h。
Trizol法提RNA 201304
注意：从富含多糖的植物组织或富含糖原的动物肝脏组织提取 RNA 时，按以下步骤进行：以每 1 ml Trizol 裂解组织，加氯仿后离心得到约 0.5 ml 上清液计算，分别加入上清液一半体积即 0.25 ml 的高盐溶液(0.8 M 柠檬酸钠和 1.2 M NaCl)和 0.25 ml 异丙醇，混匀。执行下面的离心沉淀步骤 6。离心后可有效沉淀 RNA， 但多糖或糖原存留在上清可被弃去。从富含多糖的植物和动物肝脏组织提取 RNA 时，推荐使用植物 RNA 分离 试剂 Plant Trizol 或 Plant RNA Extraction Kit。
o
注意：取上清液时应保留 0.5-1 mm 厚的水相，以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入，应 将所取的上清液放回管中并重新离心 10 分钟，再次吸取水相。这一点至关重要，违背此原则容易 导致 RNA 降解和 DNA 污染。如需同时提取 DNA 或蛋白质，则保留中间相和下层有机相，向公司 索要操作方法。
Page 2 of 2
优化步骤：如果组织裂解物含较多的碎片，或提取植物组织，12,000g 4 oC 离心 10 分钟，取上层裂解液， 弃管底碎片和粘稠 DNA。如果提取脂肪组织，12,000g 4 oC 离心 10 分钟，小心吸掉最上面的油层，弃去。 再取裂解液，弃管底碎片和粘稠 DNA。取出的裂解液如带少量油滴不影响提取。
6
Page 1 of 2
(3) 液体标本：如体液、尿液、全血。每 100l 液体样品加 1 ml Trizol，置冰上 1-3 分钟。未抗凝 的凝固血液按固体组织处理。Trizol Liq (Cat# R1020)产品专门用于液体标本 RNA 提取。 2. 将组织细胞裂解物转移到 1.5 ml 离心管，置冰上 10 分钟。
Trizol试剂
Trizol Reagent/总RNA提取试剂发布日期：[2007-7-13] 共阅[7177]次Trizol Reagent/总RNA提取试剂说明书产品简介TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。
加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。
TRIzol试剂可用于小量样品（50－100mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。
一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。
本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的稳定性。
保存条件2-8℃避光保存12个月。
实验前需要准备的试剂氯仿、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。
操作步骤1. 匀浆处理（Homogenization）组织中提取总RNA1) 植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1ml TRIzol。
2) 动物组织：按10-30mg组织加入1ml TRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。
培养细胞中提取总RNA1) 贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1ml TRIzol。
2) 悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每1ml TRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。
血液中提取总RNA直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000 rpm离心1分钟。
彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。
每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、异丙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品
250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA
1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。
另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
五、从细胞中提取总RNA
1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2 /ml比例加入。
2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
六、操作步骤
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
2、12,000rpm离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡
振荡器，以免基因组DNA断裂。
4、4℃12,000g离心15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
7、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。
注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。
注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
12、测O.D值定量RNA浓度。
（注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug）
注：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase 的主要来源；组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织剪碎，然后再充分研磨。