Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶基因的克隆及信息学分析

Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶基因的克隆及信息学

分析

吴丽云;刘韩;倪辉;肖安风;蔡慧农;朱艳冰

【摘要】以Pseudomonas syringae的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶引物进行PCR扩增,将目的基因克隆至pMD18-T载体后进行测序.结果显示,克隆基因的大小为1137 bp,预测编码含有378个氨基酸残基的蛋白质.对该蛋白质进一步进行生物信息学分析,结果表明,该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶具有高的相似性,预测本研究克隆的基因编码褐藻胶裂解酶.该褐藻胶裂解酶的理论分子质量为42.5 ku,理论等电点为8.15.采用同源建模法建立P.syringae褐藻胶裂解酶的三维结构,富含螺旋结构.

【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2015(020)003

【总页数】7页(P179-185)

【关键词】假单胞菌;褐藻胶裂解酶;克隆;生物信息学

【作者】吴丽云;刘韩;倪辉;肖安风;蔡慧农;朱艳冰

【作者单位】集美大学食品与生物工程学院,福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院,福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院,福建厦门361021;福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建厦门361021;厦门市南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室,福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院,福建厦门

361021;福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门361021;厦门市食品与

生物工程技术研究中心,福建厦门361021;厦门市南方海洋研究中心经济海藻资源

化利用与深加工重点实验室,福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院,福建

厦门361021;福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门361021;厦门市食

品与生物工程技术研究中心,福建厦门361021;厦门市南方海洋研究中心经济海藻

资源化利用与深加工重点实验室,福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院,

福建厦门361021;福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门361021;厦门

市食品与生物工程技术研究中心,福建厦门361021;厦门市南方海洋研究中心经济

海藻资源化利用与深加工重点实验室,福建厦门361021

【正文语种】中文

【中图分类】Q939.97

褐藻胶为主要来源于褐藻类植物细胞壁的结构多糖，它是一种阴离子酸性直链多糖，由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)通过共价键随机结合形成的线性无支链的高分子聚合物[1].褐藻胶来源丰富，以其凝胶性、增稠性、稳定性和螯合金属

离子等特点被广泛应用于食品、医疗、印染和化工等领域[2-4].褐藻胶的降解产物

褐藻胶寡糖因其具有特殊的化学结构而表现出多种生物活性，例如抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、促进植物生长等[5-9]. 研究表明，利用褐藻胶裂解酶催化裂解褐藻胶糖苷键，从而在非还原端形成具有双键的不饱和糖醛酸寡糖，这种不饱和双键对褐藻胶寡糖所具有的生理活性功能有重要的影响[10].根据褐藻胶裂解

酶的底物专一性，褐藻胶裂解酶分为多聚β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和多聚α-L-1,4-古罗糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11).已经报道的褐藻胶裂解酶的来源

主要包括海洋藻类、海洋软体动物、棘皮动物和微生物(包括海洋细菌、陆生真菌

和极少数的病毒)，其中细菌类是褐藻胶裂解酶研究最为广泛的来源[11-14].利用

基因工程技术将褐藻胶裂解酶基因在工业化生产的宿主细胞中高效表达，以获得高产量、高纯度、高活性、高稳定性的褐藻胶裂解酶制剂，具有高的产业潜力. 本文进行Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶基因的克隆及其生物信息学分析，为该菌株褐藻胶裂解酶的酶学性质、酶的结构与功能研究奠定基础.

P.syringae购自德国微生物菌种保藏中心(No.21482)，E.coli DH5α菌株由本实

验室保存.pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA标准均为TaKaRa 公司产品，T4 DNA连接酶为Fermentas公司产品，细菌基因组DNA提取试剂

盒购自北京百泰克生物技术有限公司，柱式质粒DNA提取试剂盒和柱式DNA胶回收试剂盒均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，寡核苷酸序列的合成及核酸序列的测定均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，其余试剂均为分析纯产品.

1.2.1 褐藻胶裂解酶的活力测定

将P. syringae接种于培养基(0.25% D-葡萄糖，0.3%大豆蛋白胨，1.7%干酪素，0.5% NaCl，0.25% K2HPO4，均为质量分数)，25 ℃培养36 h后，取20 mL培养液于4 ℃、10000 r/min离心10 min，收集上清液，即为胞外液.用2 mL 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH=7.5)重悬菌体，在冰浴条件下超声破

菌后，4 ℃、10000 r/min离心10 min，获得上清液，即为胞内液.取0.25 mL

含0.5%(质量分数)褐藻胶的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH=7.5)，加入0.25 mL粗酶液，30 ℃反应30 min后，沸水终止反应.加入0.5 mL DNS试剂，混匀后于540 nm波长下测定反应液的吸光度值.通过制作葡萄糖标准曲线确

定还原糖含量，根据还原糖的产生计算褐藻胶裂解酶的活力.褐藻胶裂解酶活力定

义为：在上述条件下，每分钟水解底物产生1 μg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量

为1个酶活力单位(U).

1.2.2 褐藻胶裂解酶基因的克隆