植物组织中SOD活性、MDA含量的测定方法
生理指标的测定-SOD-MDA-CAT-POD-叶绿素
生理指标的测定测定不同时期野生大豆和栽培大豆的游离脯氨酸、丙二醛、过氧化物酶、叶绿素的含量。
测定方法如下：采样：分别在盐处理后，第2天、第7天和第12天，采叶片测量生理指标。
采摘的叶片标准为：成龄、无病虫害、无缺失、鲜绿的叶片。
丙二醛含量的测定（采用双波长硫代巴比妥酸法）材料提取：称取0.25g左右大豆叶片，加入0.5% TCA 3mL，研磨后所得匀浆3000rpm离心10min。
取上清液2mL，加0.5%TBA（称取TBA0.5g溶于0.5% TCA 溶液，并用其定容至100mL）2mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。
样品测定：分别测定上清液在450nm、532nm、600nm处的吸光值，并按公式算出MDA的浓度，再算出单位鲜重组织中MDA含量（μmol·g-1）。
结果计算：M=C×V/W×1000M为MDA含量（μmol·g-1）；C为MDA浓度（μmol·L-1）；V为提取液体积（mL）；W为样品重量（g）。
游离脯氨酸含量的测定（采用酸性茚三酮法）样品提取：称取鲜样0.5g左右，放入研钵中，加入80%的乙醇3mL研成匀浆，移入具塞试管中，并用80%的乙醇冲洗研钵，匀浆与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末0.25g，振荡过滤（用80%乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗济并定容至100mL供测定之用。
样品测定：取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录消光值。
结果计算：A=C×V/WA为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·ml-1）；V为样品稀释体积（ml）；W为样品重量（g）。
2013 SOD-MDA实验
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的
产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少
能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的
抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研
究中，丙二醛含量是一个常用指标。
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实验目的 实验原理 实验材料与设备 实验步骤 注意事项 结果比较分析 思考题
CAT活性测定
ml反应体系 0.2% H2O2 1 ml 50 mM PBS 1.95 ml 加入酶液 50 μl 启动反应，记录240 nm 下3 min内吸光值的变化.
3
在240nm下每30秒读取一次OD值，共测3min。
酶活性强度以每分钟内OD240变化0.01为一个CAT 酶活力单位，表示为U，以U/毫克•鲜重（U/ mg•DW） 按照以下公式计算： CAT活性=△OD240*D/（0.01*FW*1000）（U/ mg•FW） △OD240为一分钟吸光度变化值，FW为叶片鲜重 ，D为稀释倍数。
POD活性 ml反应混合液 1 ml 50 mmol/L PBS 1 ml 0.2% H2O2 0.95 ml 0.18 mol/L愈创木酚（pH7.0） 50 μl酶液，测定3 min内OD470 nm下的吸光值变化。 立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分 钟记录一次吸光度值，共测3min。 计算 以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧 化物酶酶活力的大小（单位：U/gFW）。
MDA含量计算
MDA含量C (umol/L)＝6.45(A532-A600)-0.56A450 A450、A532、A600分别代表450nm、532nm、600nm波长下
植物生理学实验报告植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定
实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定一、实验目的和要求1.掌握植物组织中蛋白和丙二醛（MDA，malonyldialdehyde）提取。
2.掌握用比色法测定组织粗提液蛋白质和MDA.3.掌握植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定方法；4.了解植物衰老的原理。
二、实验内容和原理衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能自然衰退，最终导致死亡的过程。
衰老时生理生化变化主要有：蛋白质含量下降，生物膜降解，核酸含量的变化，光合速率下降，呼吸速率下降，植物内源激素的变化等。
植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。
自由基代谢失调, 并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA。
（1）可溶性蛋白测定的原理（2）考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从0~1000g/ml。
据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。
（3）待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。
测定595nm吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。
（4）MDA测定原理（5）MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成粉红色复合物（3，5，5－三甲基噁唑2，4-二酮），该复合物在532nm处有最大吸收峰；600nm处是最小吸收峰，两峰差值的消光系数为155 (mM)-1 cm-1（6）超氧物岐化酶（SOD)活性测定原理：→ H2O2+ O22O2·−+2H2O SOD四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法:核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收,而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。
网上说定容到100ML我也不懂。
拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。
取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。
实验五 植物组织中SOD活性测定
实验五SOD活性的测定一、实验目的学习并掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理和操作方法。
二、实验原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
测定SOD活性的方法很多，简便且常用的是NBT(氮蓝四唑)光还原法。
该方法的原理是超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
当反应体系中有可被氧化的物质存在时，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧气，氧气被单电子还原产生氧自由基，氧自由基则可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除氧自由基，当反应体系中有SOD存在时可抑制NBT的还原，于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
因此可通过测定A560来计算SOD的活性，以抑制NBT 光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。
三、实验材料、试剂与仪器1.实验材料：小白菜叶片。
2.实验试剂：（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；（4）100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（5）20μmol/L核黄素溶液：100μmol/L核黄素溶液稀释5倍即实验所需的20μmol/L核黄素溶液；（6）SOD提取介质：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、3.实验仪器：高速台式离心机，可见分光光度计，光照培养箱，专用试管，研钵等。
四、实验步骤1、粗酶液提取将小白菜叶片放置在冰箱中冷处理3min，用作胁迫对照。
植物生理学中各项生理指标的测定方法
植物⽣理学中各项⽣理指标的测定⽅法⼀.实验内容实验1 MDA(丙⼆醛)含量测定所需试剂：10%三氯⼄酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)实验2：可溶性蛋⽩含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-250 95%⼄醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏⾎酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分⼦量167.12） (⼄=胺四⼄酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维⽣素C)含量测定偏磷酸 95%⼄醇磷酸 4% 2,2-⼆联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(⾕胱⽢肽, 媚⼒肽GSH GSH是由⾕氨酸、半胱氨酸和⽢氨酸结合⽽成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2O DTNB（⼆硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基⽔杨酸甲苯茚三酮冰⼄酸 85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。
80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。
三氯⼄酸试验11：超氧阴离⼦含量测定⼆．酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚⼄烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后⽤缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶⽚加⼊预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离⼼20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存⼀两天内备⽤，中短期⽤-20℃保存）2．ASA . GSH母液提取：0.1g叶⽚加⼊3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离⼼10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备⽤）（偏磷酸可显著沉淀蛋⽩质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚⼄烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml⽔），1000ml需称取10g，此处⽤PBSEDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏⽔)，此处⽤PBSPBS（缓冲液）配制⽅法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O取① 71.64g，蒸馏⽔定容⾄1L，取② 31.21g定容⾄1L，放置4℃冰箱备⽤PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释⾄400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容⾄100 ml蒸馏⽔（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得⽤研钵提前研碎，后⽤磁⼒搅拌器溶解⼀到两天后再定容）（现所⽤为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容⾄500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯⼄酸（TCA）（纯）称10g定容⾄100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g⽤10%TCA定容⾄100ml（配制时，可⼀次完成，先配TCA，不要定容，再加⼊硫代巴⽐妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁⼒搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶⽚，加4ml磷酸缓冲液研磨，加⼊ 4ml 0.25%的硫代巴⽐妥酸（溶于10%的三氯⼄酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离⼼15分钟↓取上清测定 OD532，OD600，OD450值↓按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (µmol/L)可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（µmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1（⽤多波长测定，在测定之前⼀定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输⼊）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空⽩调零MDA含量测定的改进1.可以⽤做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，⽤量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。
根系活力、脯氨酸、MDA、可溶性蛋白、硝酸还原酶、POD、SOD的测定方法
根系活力TTC法1、试剂（1）、0·4% TTC溶液配制。
准确称取TTC 0·4 g,溶于少量蒸馏水中,定容到100 ml。
配好的溶液应避光保存,如若变红时则不能使用,需重新配制。
（2）、0·067 (1/15) mol/L磷酸缓冲液的配制。
贮备液A: 1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液(KH2PO4, A. R9·08 g,配成1 000 ml)。
贮备液B: 1/15 mol/L磷酸二氢钠溶液(NaH2PO4, A. R. 9·47 g或Na2HPO4·2H2O 11·87 g配成1 000 ml);然后,取贮备液A38·9 ml和贮备液B 61·1 ml,混合。
（3）、1 mol/L H2SO4。
用量筒取比重1·84的浓硫酸55 ml,边搅拌边加入盛有500 ml蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1 000 ml。
（4）、成品试剂甲醇、乙酸乙酯、保险粉(Na2SO4)。
2、步骤显色。
取0·5 g样品,依次加人0·4% TTC溶液和(1/15) mol/L磷酸缓冲液各5 ml,充分混合,并使根尖切段完全浸入上述反应液中,置于37℃的恒温箱内以黑暗条件培养2 h,以使根尖切段显色(红色)。
改良TTC法。
提取保温显色时间一到,立即向小烧杯内加入1 mol/L H2SO4溶液2 ml以终止反应。
甲醇浸泡法。
将已显色的根尖切段装入具塞刻度试管中,加入10 ml甲醇,使根尖切段完全浸入甲醇中,然后将试管置于30~40℃的保温箱中,约1.5小时使根尖切段完全变白为止。
比色。
上述提取液用分光光度计比色测定。
波长485 nm,以甲醇作参比(调零点),记录OD (光密度)值。
3、标准曲线的制作0·4% TTC溶液0·2 ml,加入甲醇9·8 ml和少量保险粉,充分摇动,所生成的红色TTF溶液作为已知母液,取12只试管,按照表1所给数据配制系列浓度溶液。
植物组织中SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定
植物组织中SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定1. CAT反应液的配制：O.1M H2O2溶液: 0.568ml 30%H2O2定容至100ml。
0.1M PH7.0磷酸缓冲液：97.5毫升A液+152.5毫升B液。
定容至500毫升。
0.1M的H2O2 5毫升+0.1M的pH7.0的磷酸缓冲液20毫升(即按1:4的比例)混勺，即为CAT反应液。
2. CAT的测定:0.1毫升（或50微升）酶液+2.5毫升反应液，240nm下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。
3. 结果计算:CAT( 240*/0.05/0.5=1. MDA反应液的配置:0.6克TBA(硫代巴比妥酸)，先用少量1M NaOH溶解，用10%TCA (三氯乙酸) 定容至100毫升。
2. MDA的测定:1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后再离心，取上清液，在600、532、450nm 三个波长下比色。
3.结果计算:MDA(umol/gfw )=(6.45*(D532*D600)-0.56D450)*0.015/W或(6.45*(D532*D600)-0.56D450)*0.03/W七、可洛性蛋白的制定1. 反应液配制:0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，过滤。
2. 测定:20微升酶液+3毫升G-250放置2分钟，595纳米比色，同时做空白(20微升缓冲液+3毫升G-250)3. 结果计算:可溶性蛋白（mg/Gfw)=(C*V/Va）/W八、脯氨酸含量的测定1. 试剂配制:0.6克黄基水杨酸，定容至200毫升。
酸性茚三酮(现配)：3.75克茚三酮+90毫开冰醋酸+36毫升蒸馆水2. 测定:0.3克叶片，加入5毫升磺基水杨酸，加盖，沸水浴10分钟，过滤，吸取滤液2豪升（同时作空白，吸取2毫升蒸馏水），2毫升冰醋酸和3毫升酸性茚三酮，沸水浴40分钟，冷却，加入5毫升甲苯，充分振荡，静置分层，取上层甲苯溶液于比色皿中，520纳米下比色。
植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法
植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量是评价植物细胞的氧化应激程度和损伤程度的重要指标。
下面将介绍常用的测定植物组织中SOD活性和MDA含量的方法。
一、SOD活性测定方法：1. 混合植物组织提取液：将适量的植物组织（如叶片、根部等）加入冰冻磨碎器中，加入适量的冰冷提取液（Tris-HCl缓冲液，pH 7.8或其他适宜缓冲液），按比例加入少量酒石酸、酚酸、DTT等，然后将混合物离心10分钟。
2.处理提取物：将上述所得的植物组织提取液加入活性溶液，如NBT、PIP等，混匀后放置在37°C水浴中反应一定时间。
3. 停止反应：将反应液加入组织破壁液（甘油、NaCl、Tween-20等混合物），混匀后放置一段时间，离心10-15分钟。
4.测定光密度：取上清液用比色计测定光密度（OD）值，以反映SOD的活性，活性越高，OD值越低。
二、MDA含量测定方法：1.组织提取：将适量的植物组织加入冰冷提取液（如磷酸盐缓冲液，pH7.4），用冷磨具磨碎并移至离心管中，离心5分钟收集上清液。
2.加入TBA液：取上清液与TBA液（三硝基苞球菌素溶液）按比例混合，混匀后在水浴中加热（100°C，10分钟），然后迅速冷却至室温。
3.离心沉淀：将样品离心10分钟，取上清液。
4.测定光密度：分别取上清液测定OD值，OD值越高，MDA含量越高。
三、优化与改进：1.提取液的选择：根据不同植物组织的特点选择合适的提取液，以提高SOD活性和MDA含量的测定效果。
2.比色反应的时间和温度的调整：根据植物组织中SOD活性的变化调整反应时间和温度，以保证测定结果的准确性。
3.重复测量：为了提高实验结果的可靠性，可以重复测量同一样本，并取平均值作为最终结果。
4.与对照的比较：将测定样本与对照组进行比较，以评估SOD活性和MDA含量的变化，进一步分析植物组织的氧化应激程度和损伤程度。
实验四 超氧化物歧化酶测定
高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1 超氧化物歧化酶（SOD ）活性和丙二醛含量的测定（操作步骤）1 试剂配制1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制注：配成PBS2000ml ，其中1000ml 用于A 液配制，另1000ml 用于酶液制备。
1.2 其它溶液配制2 酶液制备称取植物材料１g ，加少许0.05mol/L 、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10 ml 匀浆。
转移至10ml 离心试管中，在3000 rpm 下粗离心１分钟，粗提液再转移至2个5ml 离心管中，在冷冻离心机13000g 、４℃下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD 活性和丙二醛含量的测定。
3 丙二醛含量测定吸取酶液２ml →加入Ｆ液２ml →沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm 下离心５分钟。
若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。
以Ｆ液为参比液，分别在532nm 和600nm 处测定光密度值。
丙二醛含量（nmol ·g -1）＝式中：V/v --- 提取液总量(10ml)／测定液用量(2ml)R --- 反应液总量(４ml)Ｗ --- 植物材料鲜重或干重(g)0.155 --- 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml 时,OD 532-OD 600=0.155)[即( OD532—OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml ]室温下处理的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值室温下丙二醛含量（nmol·g-1）=-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75 nmol·g-1 冷处理下的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值冷处理下丙二醛含量（nmol·g-1）=0.077-0.026/0.155×4×10/2×1=6.58 nmol·g-14 超氧化物歧化酶活性测定4.1 操作及说明* 仪器调零液中的“酶液”0.1ml，可以取对照植株的，也可以取胁迫植株的。
SOD、MDA、GSH
改良的盐酸羟胺法测生物样品SOD 活性一． SOD （T-SOD ）活力测定：原理：羟胺在有氧环境下发生自氧化可产生超氧阴离子，产生的超氧阴离子可由NBT 还原率而检测，在SOD 存在下，超氧阴离子被分解，NBT 还原被抑制。
因此，用比色法测定NBT 还原产物可以间接反映SOD 的酶活力。
仪器：可见光分光光度计试剂：75mM Na 2CO 3 /NaHCO 3缓冲液（pH=10.2，含0.15mM EDTA-Na 2） 5mM NH 2OH ·HCl0.3%（V/V ）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml甲酸步骤：1. 用1:5组织匀浆（血清可直接取样），3000rpm 离心30min ，取上清20ul 稀释至0.1ml2. 按顺序加入如下试剂：75mM Na 2CO 3 /NaHCO 3缓冲液 2.0ml5mM NH 2OH ·HCl 0.5ml0.3%（V/V ）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml3. 立即计时，于37℃恒温水浴10min （避光）。
4. 2.0ml 甲酸终止反应。
5. E560nM 比色，记录OD 值。
计算结果：酶单位表示：在本实验条件下，抑制率达50%所对应的提取液SOD 含量即一个SOD 单位（U ）。
可用每g 蛋白（U/g protein ）表示。
%100SOD ⨯-=值对照组值实验组值对照组抑制率OD OD OD 二． Mn-SOD 活性测定：基于氰化物抑制CuZn-SOD 非Mn-SOD 活性的原理，在上述缓冲液中加入KCN ，使最终反应体系中的KCN 浓度达到2mM ，即将缓冲液配成含3mM 的KCN 。
37℃孵育45分钟，以抑制CuZn-SOD 。
其余操作、步骤、计算方法同上。
三． CuZn-SOD 酶活力 = T-SOD 酶活力单位 — Mn-SOD 酶活力 注意事项：1) 对照组（非酶管）取样品同体积的三蒸水，其余步骤同样品。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法-(2154)
抗氧化酶（ SOD、 POD、 CAT ）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS ， pH7.8) ：A母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 : 取 Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14） 71.7g；B母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4·2H2O（分子量 156.01） 31.2g。
分别用蒸馏水定容到 1000ml 。
0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液 (Na2HPO 4) 228.75ml ，B 母液 (NaH 2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至1000ml 。
加入 10gPVP （聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000： 267～ 268。
（2） 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：取 1.399g Met 用磷酸缓冲液（ pH7.8 ）定容至 100ml 。
网上说定容到 100ML 我也不懂。
拜托（ 3）100μ mol/L EDTA-Na 2溶液：取 0.03721g EDTA - Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；（4） 100μM核黄素溶液：取 0.0075g 核黄素用蒸馏水定容至 100ml ，避光保存，随用随配，并稀释 10 倍（ 5）750μ mol/L 氮蓝四唑（ NBT ）溶液：称取 0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml 。
取 5ml 于 10000r/min 下离心10min ，上清液即为SOD 粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
生理指标测定方案
一氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应： 2O2-+ 2H →H2O2+O2。
本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
（一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照的一半（50%）时所需的酶量。
）二、材料、仪器设备及试剂（一）材料水稻或小麦叶片。
（二）仪器设备高速冷冻离心机，紫外分光光度计，日光灯（反应试管处照度为4000lx），试管数支。
（三）试剂（1）0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液 (PBS)。
配制方法：①母液A（0.2mol/L Na2HPO4）:称取71.64g Na2HPO4·12H2O,用蒸馏水定容至1000ml 。
(配置溶液时需要用磁力搅拌器搅拌才能溶解。
)②母液B(0.2mol/L NaH2PO4)：称取31.21g NaH2PO4·2H2O,用蒸馏水定容至1000ml 。
③配0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液：取91.5mlA母液+8.5mlB母液+蒸馏水定容到400ml （2）提取介质0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液，内含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）: 称取1g PVP用0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液 (PBS)定容到100ml（3）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。
植物组织SOD、CAT、POD活性以及MDA、H2O2含量的测定
植物组织SOD、CAT、POD活性以及MDA、H2O2含量的测定•植物组织中通过多条途径产生O-.2、OH等自由基，•这些自由基具有很强的氧化能力，对许多生物功能分子有破坏作用。
•细胞内也存在消除这些自由基的多种途径。
如SOD可以消除O-.2（超氧物阴离子自由基）：SOD 2O-2·＋2H+ ──→ H2O2＋O22H2O2＋-.────→OH·＋O2•• CAT2H2O2───→ 2H2O＋O2•••••••••••••••••••••••••••••• 细胞2O2的积累可使CO2的固定效率降低,而CAT和POD•能分解••••H2O2, 只有SOD、CAT、POD三者活性协调一致，才能使自由基维持在••••••••••一个低水平，所以上述三种酶统称为保护酶系统。
•••••••••• 在正常情况下,细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，••••••••••自由基水平很低，不会伤害细胞。
但当植物受到逆境胁迫时，•植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破，O-.2、H2O2、OH•·（羟基自由•基）、·O2（单线态氧）的产量增加，•破坏和降低活性氧清除剂如SOD、CAT、POD、GR(谷胱甘肽还原酶以及VtE、VtC、CAR（类胡萝卜素、GSH（还原型谷胱甘肽）等的结构、活性或含量水平，从而伤害细胞。
•• 自由基伤害细胞的主要途径可能是下列两点：•• 1. 首先自由基导致膜脂过氧化作用, SOD、POD活性下降,•同时还产生较多的膜脂过氧化产物(乙烯、乙烷和丙二醛），膜的完整性被破坏；•• 2. 其次, 自由基累积过多, 也会使膜脂产生脱脂化作用,•磷脂••••••••••游离, 膜结构破坏。
膜系统破坏，•就会引起一系列生理生化紊乱，导致植物死亡。
•••••••••••••••••••••• 本实验利用正常生长和缺素培养的玉米苗为材料, •系统分析叶片中SOD、CAT、POD三种酶的活性及MDA、H2O2、可溶性蛋白质、•叶绿素的含量。
MDA,SOD,CAT及POD活性的测定
叶绿素含量采用无水乙醇的方法测定超氧化物歧化酶SOD活性采用邻苯三酚自氧化法测定过氧化物酶POD活性采用愈创木酚法测定过氧化氢酶采用过氧化氢法测定丙二醛采用硫代巴比妥酸法测定蛋白质含量采用考马斯亮蓝法每次测定重复3次，取平均值测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（甲液：取Na2HPO4 35.9g，加水溶解，并稀释至500mL 乙液：取NaH2PO4 2.76g，加水溶解，并稀释至100mL 取上述甲液91.5mL和乙液8.5mL，混合摇匀即得。
先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。
上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。
SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。
混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。
当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。
液蒸馏水0.5总体积 3.33.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。
以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。
3.<结果计算>已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。
比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
SODMDA实验详解
Vt—粗酶提取液总体积ml； Va—测定用粗酶液体积ml
植物组织中MDA含量的测定
实验目的
了解胁迫反应的具体机制（膜脂过氧化 & 抗氧化） 掌握膜脂过氧化作用产物MDA含量的测定方法
背景知识
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的 产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少 能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的
产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少
能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的
抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研
究中，丙二醛含量是一个常用指标。
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实验目的 实验原理 实验材料与设备 实验步骤 注意事项 结果比较分析 思考题
(Ack－AE)×V SOD总活性(U/g)＝ Ack×0.5×W×Vt
Ack照光对照管的吸光度
AE样品管的吸光度
V样品液总体积（ml） Vt测定时样品用量（ml） W样鲜重（g）
ห้องสมุดไป่ตู้
实验步骤
1. 酶液提取：取1 g材料（CK & 盐处理）于预冷的研钵中，加5 ml预冷磷酸 缓冲液在冰浴上研磨成浆，2000 g(4℃) 离心15 min，上清液即为SOD粗酶液。 2. 显色反应：取5ml试管4支，2支为测定管，另2支为对照管。 反应体系中各试剂的终浓度为130 mmol/L Met，75 μmol/L NBT， 4 μmol/L 核黄素， 100 nmol/L EDTA，按下列次序及量（ml）加入各溶液： 1 CK 2 盐处理 3 4 暗管 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 Met溶液 0.2 Met溶液 0.2 Met溶液 0.2 Met溶液 0.2 EDTA液 0.1 EDTA液 0.1 EDTA液 0.1 EDTA液 0.1 酶液 0.1 酶液 0.1 缓冲液 0.1 缓冲液 0.1 NBT溶液 0.2 NBT溶液 0.2 NBT溶液 0.2 NBT溶液 0.2 3. 测定 混匀后将2支试管（不加酶液而用缓冲液，为最大还原管）设为对照， 其中1支对照管置于暗处，其它3支置4000Lux光（或阳光）下反应20min（显 蓝色），反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定2支试管的OD560
MDA SOD Pr测定方法
丙二醛(MDA)含量的测定丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。
二酮)，其最大吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
双组分分光光度计法据朗伯一比尔定律：D＝kCL，当液层厚度为1cm时，kD／C，k称为该物质的比吸收系数。
当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度之和。
已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85．40、7．40。
MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸系数为155。
根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式：C1＝11．71D450C2＝6．45(D532-D600)-0.56D450式中：C1----可溶性糖的浓度(mmol·L-1)C2----MDA的浓度（·umol·L-1）D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。
仪器设备：紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台等。
试剂：10％三氯乙酸(TCA)；0．6％硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1mol·L-1)溶解，再用10％的三氯乙酸定容。
MDA提取方法1、取10ml藻液，将藻液放入离心管中,4 000rP/min离心10 min ,弃上清液,藻体中加入1ml 预冷的0. 05 mol/L pH为7. 8的磷酸缓冲液,0～4 ℃下超声波破碎, 破碎液在10000 rP/min 4℃离心机中离心30min ,上清液即为粗酶液。
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植物组织中SOD活性的测定超氧物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属酶。
它与过氧化物酶、过氧化氢酶等酶协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞系统的伤害；SOD可以催化氧自由基的歧化反应，生成过氧化氢、过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化成无害的分子氧和水。
【原理】
依据SOD抑制NBT在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧的条件下极易再氧化而产生02-，02- 可将NBT还原为蓝色的甲，后者在560 nm 处有最大吸收。
而SOD作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性越低，反正酶活性越高。
一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50%）时所需的酶量。
【仪器与用具】
离心机；分光光度计；进样器；紫光灯（4000 Lx）；15 mm×150 mm试管；黑色硬质套。
【试剂】
①0.05mol/L 磷酸缓冲液PBS（pH=7.8）
提取介质50mmol/L PBS（pH=7.8）内含1% 聚乙烯吡咯烷酮
② 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：称1.9397g Met，用PBS 7.8 进行溶解
并定容至100ml；
③ 750umol/L NBT：称0.06132g NBT，用PBS 7.8进行溶解并定容至
100ml，避光保存；
④20umol/核黄素溶液：称0.0075g核黄素，用蒸馏水溶解定容至
1000ml，避光保存，现用现配；
⑤ 100umol/L的EDTA-Na2溶液：称0.0372g EDTA-Na2 ，用PBS 7.8
定容至1000ml。
【方法】
1.酶液提取
称取植物叶片0.2g（去叶脉）于预冷的研钵中，加1ml预冷的提取介质在冰浴下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使最终体积为2ml，于4℃、10000r/min离心15min，上清液即为SOD粗提液。
2.显示反应
取透明度好、质地相同的15mm×150mm试管4支，2支为测定，2支为对照，按下表加入试剂。
混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬质套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30min，反应温度控制在25-35℃
【计算】
以遮光的对照管作空白，将上述处理好的试管在560nm 处比色，采用如下进行计算：
()V15.0V As -A SOD ⨯⨯⨯⨯=
FW Ao t
o
SOD 活性以每克鲜重酶单位表示 其中，Ao ——照光对照管的光吸收值；
As ——样品管的光吸收值； Vt ——样品液总体积(ml)； V1——测定时样品用品用量(ml)； FW ——样品鲜重(g)；
植物组织中MDA含量和可溶性糖含量的测定
【原理】
MDA是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温条件下，可与TBA 反应生成红棕色的三甲川（3,3,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），在532nm处有最大吸收。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的可溶性糖，糖与TBA显示反应产物在450nm处有最大吸收，在532nm也有吸收。
【试剂】
10% TCA；
0.6% TBA：先加少量的1mol/L NaOH溶解，再用10%的TCA定容；【方法】
1.MDA提取称取1g叶片，加2ml的10%TCA于研钵中研磨，然后再加8mlTCA继续研磨，匀浆在4000r/min离心10min,上清液即为MDA粗液。
2.显示反应取离心的上清夜2ml（对照用2ml蒸馏水代替），加入2ml 0.6%TBA，混合后于沸水反应15min,取上清夜测定450、532 及600nm处的吸光度。
【计算】
①可溶性糖浓度（mmol/L）=11.71D450（糖含量套用下面公式③）
② MDA浓度（umol/L）=6.45×(D532-D600)-0.56×D450
③ MDA含量（umol/g）=2MDA浓度（umol/L）×提取液体积（ml）
/鲜重（g）/1000。