(优选)分子生物学常用技术凝胶电泳
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（优选）分子生物学常用技术 凝胶电泳
德厚行远，因尔成道
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于 待分离样品中各种分子带电性质以及分子 本身大小、形状等性质的差异，使带电分 子产生不同的迁移速度，从而对样品进行 分离、鉴定或提纯的技术。
德厚行远，因尔成道
二、主要方法
有支持物的电泳技术：
1、纸上电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳 3、薄层电泳 4、非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等) 5、凝胶支持体区带电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：
蛋白质分子的分离鉴定 蛋白质分子量的测定
核酸的分析 核酸序列测定
德厚行远，因尔成道
德厚行远，因尔成道
迷你垂直型电泳槽
德厚行远，因尔成道
DNA序列分析电泳槽
德厚行远，因尔成道
中型双垂直电泳槽
德厚行远，因尔成道
蛋白电泳
德厚行远，因尔成道
（三）醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成 的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称 为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样 品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出 现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比 较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电 流的大部分由样品传导，所以分离速度快， 电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可 得到满意的分离效果。因此特别适合于病 理情况下微量异常蛋白的检测。
德厚行远，因尔成道
（四）等电聚焦电泳技术
等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60 年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等 电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可 达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近 而等电点不同的蛋白质组分。
现在它经常与SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳构成 二维电泳中的第一向，主要用于分离蛋白质。
①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂糖凝胶
德厚行远，因尔成道
不用支持体的电泳技术：
1、Tiselius电泳 2、显微电泳 3、等电点聚焦电泳技术 4、等速电泳技术 5、密度梯度电泳
德厚行远，因尔成道
DNA电泳
德厚行远，因尔成道
DNA分子带负wk.baidu.com，向正电方向游泳
德厚行远，因尔成道
（一）琼脂糖凝胶电泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
德厚行远，因尔成道
紫外灯下观察电泳结果
德厚行远，因尔成道
照相
德厚行远，因尔成道
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体 和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的 作用下聚合而成 可以分离小片段（5～500bp）DNA分子
方
于EB分子的插入，在紫外光的照射下，
向
凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧
光，易于检测。可以检测10ng 的DNA
注意：EB是一种诱变剂，操作时一定 要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套
德厚行远，因尔成道
环形双链的质粒DNA分子具有三 种不同的构型
1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的 环形结构时，称之为共价闭合环形DNA （cccDNA），这样的DNA通常呈现超 螺旋的SC构型；
德厚行远，因尔成道
琼脂糖凝胶电泳主要实验器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
德厚行远，因尔成道
电泳槽结构
德厚行远，因尔成道
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相
德厚行远，因尔成道
琼脂糖Agarose
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型
D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactopyranose. Melting at 85 ℃ and solidifying from 32-40 ℃
德厚行远，因尔成道
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持 着完整的环形结构，另一条链出现有一 至数个缺口时，称之为开环DNA （ocDNA），此即OC构型；
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制 酶切割之后，发生双链断裂形成线性分 子（IDNA），通称L构型。
德厚行远，因尔成道
琼脂糖凝胶中DNA的观察
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光
德厚行远，因尔成道
质粒DNA分子有三种构型，即
CCCDNA、OCDNA和LDNA，这三种
构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的
泳动率不同，因此电泳后呈三条带，
CCCDNA泳动最快，其次是LDNA，
最慢的是OCDNA
OCDNA
电
EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分 LDNA
泳
子中的碱基对之间而与DNA结合。由 CCCDNA
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶 孔径的大小决定于琼脂糖的浓度
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具 有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离 相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子 可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE 三种缓冲体系
琼脂糖浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
分离范围（kb） 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
德厚行远，因尔成道
琼脂糖浓度（%） 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0
分离范围（kb） 1.0 ～30 0.8 ～12 0.5 ～10 0.4 ～7 0.2 ～3 0.05～2
德厚行远，因尔成道
溶
胶
德厚行远，因尔成道
准备胶槽
德厚行远，因尔成道
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
德厚行远，因尔成道
铺胶
德厚行远，因尔成道 凝胶凝固后取出梳子
德厚行远，因尔成道
加缓冲液
德厚行远，因尔成道
准备样品
德厚行远，因尔成道
点样
德厚行远，因尔成道
电泳
德厚行远，因尔成道
德厚行远，因尔成道
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于 待分离样品中各种分子带电性质以及分子 本身大小、形状等性质的差异，使带电分 子产生不同的迁移速度，从而对样品进行 分离、鉴定或提纯的技术。
德厚行远，因尔成道
二、主要方法
有支持物的电泳技术：
1、纸上电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳 3、薄层电泳 4、非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等) 5、凝胶支持体区带电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：
蛋白质分子的分离鉴定 蛋白质分子量的测定
核酸的分析 核酸序列测定
德厚行远，因尔成道
德厚行远，因尔成道
迷你垂直型电泳槽
德厚行远，因尔成道
DNA序列分析电泳槽
德厚行远，因尔成道
中型双垂直电泳槽
德厚行远，因尔成道
蛋白电泳
德厚行远，因尔成道
（三）醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成 的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称 为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样 品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出 现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比 较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电 流的大部分由样品传导，所以分离速度快， 电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可 得到满意的分离效果。因此特别适合于病 理情况下微量异常蛋白的检测。
德厚行远，因尔成道
（四）等电聚焦电泳技术
等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60 年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等 电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可 达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近 而等电点不同的蛋白质组分。
现在它经常与SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳构成 二维电泳中的第一向，主要用于分离蛋白质。
①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂糖凝胶
德厚行远，因尔成道
不用支持体的电泳技术：
1、Tiselius电泳 2、显微电泳 3、等电点聚焦电泳技术 4、等速电泳技术 5、密度梯度电泳
德厚行远，因尔成道
DNA电泳
德厚行远，因尔成道
DNA分子带负wk.baidu.com，向正电方向游泳
德厚行远，因尔成道
（一）琼脂糖凝胶电泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
德厚行远，因尔成道
紫外灯下观察电泳结果
德厚行远，因尔成道
照相
德厚行远，因尔成道
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体 和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的 作用下聚合而成 可以分离小片段（5～500bp）DNA分子
方
于EB分子的插入，在紫外光的照射下，
向
凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧
光，易于检测。可以检测10ng 的DNA
注意：EB是一种诱变剂，操作时一定 要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套
德厚行远，因尔成道
环形双链的质粒DNA分子具有三 种不同的构型
1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的 环形结构时，称之为共价闭合环形DNA （cccDNA），这样的DNA通常呈现超 螺旋的SC构型；
德厚行远，因尔成道
琼脂糖凝胶电泳主要实验器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
德厚行远，因尔成道
电泳槽结构
德厚行远，因尔成道
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相
德厚行远，因尔成道
琼脂糖Agarose
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型
D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactopyranose. Melting at 85 ℃ and solidifying from 32-40 ℃
德厚行远，因尔成道
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持 着完整的环形结构，另一条链出现有一 至数个缺口时，称之为开环DNA （ocDNA），此即OC构型；
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制 酶切割之后，发生双链断裂形成线性分 子（IDNA），通称L构型。
德厚行远，因尔成道
琼脂糖凝胶中DNA的观察
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光
德厚行远，因尔成道
质粒DNA分子有三种构型，即
CCCDNA、OCDNA和LDNA，这三种
构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的
泳动率不同，因此电泳后呈三条带，
CCCDNA泳动最快，其次是LDNA，
最慢的是OCDNA
OCDNA
电
EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分 LDNA
泳
子中的碱基对之间而与DNA结合。由 CCCDNA
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶 孔径的大小决定于琼脂糖的浓度
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具 有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离 相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子 可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE 三种缓冲体系
琼脂糖浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
分离范围（kb） 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
德厚行远，因尔成道
琼脂糖浓度（%） 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0
分离范围（kb） 1.0 ～30 0.8 ～12 0.5 ～10 0.4 ～7 0.2 ～3 0.05～2
德厚行远，因尔成道
溶
胶
德厚行远，因尔成道
准备胶槽
德厚行远，因尔成道
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
德厚行远，因尔成道
铺胶
德厚行远，因尔成道 凝胶凝固后取出梳子
德厚行远，因尔成道
加缓冲液
德厚行远，因尔成道
准备样品
德厚行远，因尔成道
点样
德厚行远，因尔成道
电泳
德厚行远，因尔成道