第三章 固定化酶与固定化细胞
酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞演示文稿
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和 的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考
虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素
如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用
DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附
此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及
酶和载体的特性相关
➢ pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附
酶与蛋白质工程固定化酶与固 定化细胞演示文稿
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（优选）酶与蛋白质工程固定 化酶与固定化细胞
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固定化酶
固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：
(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化 了提纯工艺
(2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性
(5) 较能适应于多酶反应
(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低
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固定化酶
砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可 与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶
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例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
高中生物第三章酶的应用技术实践第二节固定化酶的制备和应用学案苏教版选修1
⾼中⽣物第三章酶的应⽤技术实践第⼆节固定化酶的制备和应⽤学案苏教版选修1第⼆节固定化酶的制备和应⽤学习导航明⽬标、知重点难点固定化酶和固定化细胞的应⽤。
(重点)固定化酶与固定化细胞的制备⽅法。
(难点)[学⽣⽤书P43]⼀、阅读教材P63分析固定化酶1．概念：是指⽤物理学或化学的⽅法将酶与固相载体结合在⼀起形成的仍具有酶活性的酶复合物。
2．优点：在催化反应中，它以固相状态作⽤于底物，反应完成后容易与⽔溶性反应物和产物分离，可被反复使⽤，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和⾃动化。
3．制备固定化酶的常⽤⽅法⽬前，制备固定化酶的⽅法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。
⼆、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应⽤1．应⽤：固定化细胞可以取代游离的细胞进⾏发酵，⽣产各种物质。
2．优点(1)固定化细胞技术⽆须进⾏酶的分离和纯化，减少了酶的活⼒损失，同时⼤⼤降低了⽣产成本。
(2)固定化细胞不仅可以作为单⼀的酶发挥作⽤，⽽且可以利⽤细胞中所含的复合酶系完成⼀系列的催化反应。
(3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更⾼。
(4)细胞⽣长停滞时间短，反应快等。
3．缺点(1)固定化细胞只能⽤于⽣产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。
(2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到⼀定限制。
(3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。
4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程准备各种实验药品和器材↓制备麦芽汁↓活化酵母菌细胞↓配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液↓制备固定化细胞↓浸泡凝胶珠，⽤蒸馏⽔洗涤↓发酵麦芽汁判⼀判(1)酶在催化时会发⽣变化，不可反复利⽤。
(×)(2)某种固定化酶的优势在于能催化⼀系列⽣化反应。
(×)(3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作⽤。
(×)(4)制备固定化细胞的⽅法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。
(×)连⼀连固定化酶技术[学⽣⽤书P44]由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本⾼、不利于⼤规模使⽤。
5.酶的固定化与酶反应器
♫在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活； ♫只有水分子可以通过，高分子凝胶的网格扩散，只适用
于作用小分子底物和产物的酶。
孙利芹2013制作
逆胶束酶反应系统
逆胶束：表面活性剂等两性分子在有机相中自发形成聚集体，表面 活性剂亲水端连接成逆胶束的极性核，而疏水端向外进入有机相中。
酶以逆胶束形式被固定，并在有机相中参与反应。
孙利芹2013制作
微囊型：将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称
为微囊型。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
制备微囊型固定化酶的方法：
♫界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相界面上溶
解度极低而形成皮膜将酶包埋的方法。 常用的作为膜材料的高聚物有：硝酸纤维素、聚苯乙烯、 聚甲基丙烯酸甲酯等。 例如：三醋酸纤维能溶于二氯甲烷，但在甲苯溶液中沉 淀析出。酶水溶液+含醋酸纤维的二氯甲烷 乳浊液，在 搅拌的条件下，混入甲苯中，三醋酸纤维便在水相界面沉淀， 形成薄膜。
将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。
例如，将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶 用硅胶等吸附后再进行交联等。这种固定化方法称为双重 固定化法。双重固定化法已在酶和菌体固定化方面广泛采 用，可制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定 化菌体。
孙利芹2013制作
包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法称为包埋法，又分为网格型和微囊型 两种方法。
一、基本概念
所谓固定化酶指在一定空间内呈闭锁状态存在 的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收利 用。
固定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有 一定纯度的酶，也可以是结合在菌体(死细胞)或细胞碎 片上的酶或酶系。固定在载体上的菌体或菌体碎片称为 固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。在固定化细胞 (活细胞)出现之前，也有人将固定化菌体称为固定化细 胞。
酶与细胞固定化
③共价键结合法： 载体： 纤维素，琼脂糖凝胶，甲壳素等。 过程： 首先使载体活化，即借助于某种方法在载体上引进某一活 泼基团，然后这一活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形 成共价键。 特点： 结合牢固，酶不会脱落，可连续使用较长时间，但载体活 化的操作复杂，比较麻烦。同时由于共价结合时可能影响酶的 空间构象而影响酶的催化活性。 2．交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用制成 网状结构的固定化酶方法。 试剂： 戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐等。 特点： 结合牢固，可长时间使用，但交联反应条件较为剧烈，酶 分子的多个基团被交联，使酶活力损失较大，
3．包埋法：将酶或细胞包埋在各种多孔载体中，使酶或细胞固 定化的方法。 ①凝胶包埋法： 网格型 ，凝胶的孔径应控制在小于酶分子或细胞直径的范围 内。所以该方法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定 化。 ②半透膜包埋法： 微囊型，适合于底物和产物都为小分子物质的酶的固定化。 固定化方法的选择： ①使酶活性中心的氨基酸残基不发生变化； ②避免那些导致酶蛋白高级结构破坏的操作； ③固定化过程应尽量在温和的条件下进行。 三．固定化酶的性质： ①稳定性：固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表 现在：热稳定性提高，保存稳定性好，对蛋白酶的抵抗性增强， 对变性剂的耐受性提高。 ②最适温度：一般变化不大，但可能固定化方法和固定化载体会 对其有一定影响。
固定化酶与固定化细胞
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
反应工程第三章 固定化酶反应过程动力学.
rso
•外扩散控制：酶的催化效率很高，底物的传质速率很慢。
R si k La(Cso - Csi ) kLaCso rd
•介于上述两种情况之间
第三章 固定化酶反应动力学
Rsi总是接近于动力学反应速度和扩散速度两者中比较小的那个。
Rs rso
rd Rsi
主体浓度co
第三章 固定化酶反应动力学
2.0×10-4
第三章 固定化酶反应动力学
3.3.3影响固定化酶促反应的主要因素
1）分子构象的改变
溶液酶
分子构象改变
2）位阻效应
第三章 固定化酶反应动力学
溶液酶
位阻效应
3）分配效应
第三章 固定化酶反应动力学
宏观环境
cS0 cSg
cSi
由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定化酶 载体内部底物或产物浓度与溶液主体浓度不同的现象称为分 配效应。
E
有外扩散影响时的实际 反应速率 无外扩散影响时的固定 化酶外表面处的反应速
率
R si rso
R si
rmax csi Km csi
rso
rmax cso Km cso
E
cs (1 K) cs K
cs csi / cso
Km
Km cso
Da rmax k Lacso
第三章 固定化酶反应动力学
3.3.2 颗粒内的浓度分布与有效因子
（1）颗粒内的浓度分布
第三章 固定化酶反应动力学
De
(
dcS dr
4r2 )
r r
D
e
(
dcS dr
第三章固定化酶
活
化 载
辅基
体
连接臂
载体的选择
没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。
目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻 璃珠及合成高分子材料等。
4、化学结合法－共价结合法
原理: 酶蛋白分子上的功能基
团（酶的非活性必需侧 链基团）和固相支持物
表面上的反应基团之间 形成共价键，因而将酶 固定在支持物上。
最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚 基、咪唑基
两种固定方式
1. 将载体有关基团 活化，然 后此活泼基团再与酶分子上 某一基团反应形成共价键。
第三章
酶的固定化
第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
交联法常与吸附法结合使用，或者与 包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合 于载体上。
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。
固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离 子强度、温度和反应时间之间的平衡。
例：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊 二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h，可形成固 定化酶。
定向固定化方法
① 酶和抗体的亲和连接 ② 酶通过糖基部分固定化 ③ 酶和金属离子连接 ④ 分子生物学方法 基因融合法
翻译后修饰法 特定位点基因突变法
第二节 辅酶的固定方法
原因
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
2013年苏教版生物选修1全册精品课件 第三章第二节
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第三章
酶的应用技术实践
【问题与探究】 如何检验凝胶珠的质量是否合格？
【提示】
检验凝胶珠的质量是否合格，可
以采用以下方法。一是用镊子夹起一个凝胶 珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不破
裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成
功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果 凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是 成功的。
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第三章
酶的应用技术实践
2.制备固定化酶 目前，制备固定化酶的方法主要有________、 吸附法 交联法 ________、包埋法等。 (1)吸附法的显著特点是工艺简便且 ____________，在生产实践中应用广泛； 条件温和 (2)交联法是利用多功能试剂进行酶与载体之间 的交联，在酶和多功能试剂之间形成 共价键 _________，从而得到三维的交联网架结构；
该实验的关键是海藻酸钠的配置。(3)如果海 藻酸钠的浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的
酵母细胞的数量过少，影响实验效果。(4)如
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第三章
酶的应用技术实践
变式训练 2. (2012· 南通高二检测)下列关于固定化细胞技
术的说法中，正确的是(
)
A．吸附法的优点是操作简单，吸附牢固 B．包埋法的优点是操作复杂，条件温和，对 细胞无毒性 C．吸附法容易对酶活性产生影响 D．凝胶包埋法常用的凝胶种类有琼脂、海藻 酸钠凝胶、角叉菜胶和明胶等
A．吸附法、交联法、包埋法 B．交联法、吸附法、包埋法
C．包埋法、吸附法、交联法
D．包埋法、交联法、吸附法
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第三章
酶的应用技术实践
【解析】
①图表示酶包埋在细微网格里，
应属包埋法；②图表示许多酶分子通过特殊 试剂连接起来，成网状结构，应属交联法； ③图表示固定在一定的支持物上，可用物理 吸附法、离子结合法和共价结合法固定，应
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
3.2制备和应用固定化酶
第三章酶的应用技术实践3.2制备和应用固定化酶探究目的：1、说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。
探究预习：固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。
20世纪70年代后期出现了固定化细胞技术。
通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。
固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。
细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。
吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。
动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。
吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。
包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。
凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。
凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。
海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。
通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。
用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。
固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。
材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaCl2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三角架，石棉网，注射器等。
探究反思：固定化酵母菌技术有哪些优点？探究示例：请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。
（1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是____________________________________________________________________。
（2）包埋法固定化是指_________________________________。
固定化酶与固定化细胞
不变
不变
可变
可变
36
三 细胞的固定化方法
• 1.固定化细胞的分类 • 2. 固定化方法
37
1.固定化细胞的分类
分类方式 固定化细胞 分类方式
固定化细胞
细胞类型 微生物 植物 动物
生理状态 死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器
活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞
38
2. 固定化方法
1) 直接固定法
本章讲授
①固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包 埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基 本技术和原理；
②细胞固定化的基本技术和原理； ③简要介绍固定化酶基本性质的影响及辅因
子的固定化方法和辅酶的再生体系。
1
2
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，使用成本高。 3.酶在游离体系中更容易自水解 4.分离纯化困难，也使产物中混杂酶蛋白
22
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
23
戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
45
46
47
（一）酶的活性 ：
通常低于天然酶（有例外）。
（二）酶的稳定性
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、 蛋白酶的抵抗力增加。
48
可能的原因：
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形；
高中生物苏教版高二选修1课件：第三章_第二节_固定化酶的制备和应用
1．直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的比较
项目 直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
酶的 一种或几种
种类
一种
一系列酶
常用 载体
纤维素、琼脂糖、硝 明胶、琼脂、海藻酸
酸纤维素、聚丙烯酰 钠凝胶、角叉菜胶
胺凝胶
一分耕耘一分收获
项目 直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
制作方法
物理吸附法、化学 包埋法、物理 结合法、包埋法 吸附法
一分耕耘一分收获
固定化酶和固定化细胞的原理、作用
[例 1] (江苏高考)下列有关固定化酶和固定化细胞的叙
述，正确的是
()
A．可用包埋法制备固定化酵母细胞
B．反应产物对固定化酶的活同
D．固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应
一分耕耘一分收获
[思路点拨]
一分耕耘一分收获
(3)某同学用图丙所示的装置来进行葡萄糖发酵。a 代表________，
b 代表________。从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原
因是__________________________________________________。
为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复利用，实验过程
质，反应效率下降
一分耕耘一分收获
酵母菌细胞的固定化技术
一分耕耘一分收获
一分耕耘一分收获
1．酵母细胞固定前要活化，原因是什么？ 提示：在缺水状态，微生物处于休眠状态。活化就是让处于 休眠状态的酵母细胞恢复正常的生活状态。 2．为什么麦芽汁可以被质量分数为 10%的葡萄糖溶液替代？ 提示：酵母菌也可以利用葡萄糖作为营养物质。 3．为什么说海藻酸钠适用于多种细胞的固定化？ 提示：用海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞，除对细胞无 毒性外，还具有操作简便、条件温和等特性。通过改变海藻酸钠 的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。
第三章 酶和细胞的固定化技术及其应用
固定化酶的活性 固定化酶的活性较水溶性酶有所下降 原因： 原因： 酶分子空间结构的变化，影响活性中心氨基酸。 空间位阻影响底物与酶的定位作用。 外扩散和内扩散阻力影响底物与酶的接触。 个别固定化酶活力增强可能是酶得到化学修饰或稳定性增 加。
共价结合法由于反应剧烈，最容易改变酶蛋白构象，对酶 活性影响很大。 载体材料可通过影响反应组分的分配效果而改变固定化酶 的反应活性。 提高搅拌速度、加快流体流动可以改善外扩散限制。
常用固定化材料
无机材料 碳酸钙 氧化铝 活性炭
有机材料 聚乙烯醇 聚乙烯 尼龙
生物材料 纤维素 葡聚糖 海藻酸盐
新型固定化载体
纳米材料
磁性微球
等离子体材料
固定化方法
酶的固定化方法主要可分为五类：吸附法、包埋法、 微囊法、共价键结合法和交联法等。吸附法和共价键结合 法又可统称为载体结合法。
吸附法
细胞固定化
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化 技术。 被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。 一般采用对细胞伤害较小的吸附法和包埋法。 特点： 特点： 密度大、可增殖。 提高生产能力，缩短发酵周期。 稳定性高，可反复利用。 有利于产品分离纯化。
吸附法固定细胞
采用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定 化的方法称为吸附法。 吸附法是细胞固定化中使用最广泛的方法。
载体和固定化方法
Байду номын сангаас
固定化酶性质
目标要求、反应器特点、 目标要求、反应器特点、各部分特性
载体选择的原则
必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催 化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性 中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状 态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构 成活性中心的氨基酸残基不发生变化。这就要求酶与载体
第三章-固定化酶与固定化细胞
⏹第三章固定化酶与固定化细胞⏹第一节概述⏹第二节固定化酶的性质及其影响因素⏹第三节固定化酶的制备⏹第四节固定化细胞⏹第五节固定化辅酶和原生质体⏹第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用⏹第一节概述⏹什么是固定化酶？⏹第一节概述二．固定化酶的优缺点⏹多次使用⏹可以装塔连续反应⏹优点：纯化简单⏹提高产物质量⏹应用范围广⏹缺点：首次投入成本高⏹大分子底物较困难⏹第一节结束⏹点击返回⏹第二节固定化酶的性质及其影响因素⏹一．影响固定化酶性质的因素⏹二．固定化后酶性质的变化⏹三．评价固定化酶的指标⏹一．影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
⏹二．固定化后酶性质的变化⏹1．固定化对酶活性的影响：⏹酶活性下降，反应速度下降2．固定化对酶稳定性的影响⏹稳定性提高（原因）⏹3．pH的变化（原因）⏹载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
⏹载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
⏹催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离⏹酶的pH值高；反之则低⏹固定化后酶稳定性提高的原因：⏹ a. 固定化后酶分子与载体多点连接。
⏹ b. 酶活力的释放是缓慢的。
⏹ c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。
⏹PH 对酶活性的影响：⏹（1）改变酶的空间构象⏹（2）影响酶的催化基团的解离⏹（3）影响酶的结合基团的解离⏹（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。
⏹4．最适温度变化一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5．底物特异性变化⏹作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化⏹既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶⏹特异性往往会变化。
6．米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化（链接）⏹米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境Km'=Km/ρ(表观米氏常数)⏹（1）载体与底物带相同电荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。
生物中图版课后训练：第三章第四节酶的固定化
酶的固定化练习1 细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是( )。
A．成本更低、操作更容易、不能连续生产B．成本更高、操作更难、不能连续生产C．成本更低、操作更容易、能连续生产D．成本更低、操作更难、能连续生产2 关于固定化酶的叙述中，不正确的是（）。
A．既能与反应物接触，又能与产物分离B．固定在载体上的酶可被反复利用C．可催化一系列反应D．酶的活性和稳定性受到限制3 在包埋固定法中，下列哪一项不是常用的载体？（)A．明胶B．琼脂糖C．海藻酸钠D．纤维素4 用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时,发现无酒精产生,原因不可能是( )。
A．瓶内氧气充足,进行了有氧呼吸，通过出芽生殖繁殖了后代B．实验瓶口被密封了C．固定化酵母细胞内可能没有酵母细胞D．所谓的葡萄糖溶液可能是其他物质,使酵母菌无法进行酒精发酵5 下列不属于固定化酶在利用时的特点的是（）.A．有利于酶与产物分离B．可以被反复利用C．能自由出入依附的载体D．一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应6 下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述,正确的是（）.A．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显B．固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧C．利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件D．利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物7 乙醇等“绿色能源”的开发备受世界关注.利用玉米秸秆生产燃料酒精的大致流程为：(1)玉米秸秆经预处理后，应该选用________酶进行水解，使之转化为发酵所需的葡萄糖。
（2）（多选)从以下哪些微生物中可以提取上述酶?（）A．酿制果醋的醋酸菌B．生长在腐木上的霉菌C．制作酸奶的乳酸菌D．生产味精的谷氨酸棒状杆菌E．反刍动物瘤胃中生存的某些微生物（3）若从土壤中分离产生这种酶的微生物，所需要的培养基为________（按功能分），培养基中的碳源为________。
（4）从生物体提取出的酶首先要检测________，以便更好地将酶用于生产实践。
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⏹第三章固定化酶与固定化细胞⏹第一节概述⏹第二节固定化酶的性质及其影响因素⏹第三节固定化酶的制备⏹第四节固定化细胞⏹第五节固定化辅酶和原生质体⏹第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用⏹第一节概述⏹什么是固定化酶？⏹第一节概述二．固定化酶的优缺点⏹多次使用⏹可以装塔连续反应⏹优点：纯化简单⏹提高产物质量⏹应用范围广⏹缺点：首次投入成本高⏹大分子底物较困难⏹第一节结束⏹点击返回⏹第二节固定化酶的性质及其影响因素⏹一．影响固定化酶性质的因素⏹二．固定化后酶性质的变化⏹三．评价固定化酶的指标⏹一．影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
⏹二．固定化后酶性质的变化⏹1．固定化对酶活性的影响：⏹酶活性下降，反应速度下降2．固定化对酶稳定性的影响⏹稳定性提高（原因）⏹3．pH的变化（原因）⏹载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
⏹载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
⏹催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离⏹酶的pH值高；反之则低⏹固定化后酶稳定性提高的原因：⏹ a. 固定化后酶分子与载体多点连接。
⏹ b. 酶活力的释放是缓慢的。
⏹ c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。
⏹PH 对酶活性的影响：⏹（1）改变酶的空间构象⏹（2）影响酶的催化基团的解离⏹（3）影响酶的结合基团的解离⏹（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。
⏹4．最适温度变化一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5．底物特异性变化⏹作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化⏹既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶⏹特异性往往会变化。
6．米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化（链接）⏹米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境Km'=Km/ρ(表观米氏常数)⏹（1）载体与底物带相同电荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。
⏹（2）载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则ρ>1,Km'<Km⏹三．评价固定化酶的指标：⏹1．酶活定义（IU)：⏹在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。
——计量单位⏹ 2. 酶比活定义（游离）：⏹每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位——品质的体现⏹ 3. 固定化酶的比活：⏹每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。
⏹ 4. 操作半衰期：⏹连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）——衡量稳定性的指标。
⏹ 5.⏹ 6.⏹或称偶联效率，活力保留百分数。
⏹7.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化⏹酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。
⏹⏹四固定化酶的活力测定方法介绍⏹ 1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶加入一定量的底物溶液，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应取出一定量的反应液进行酶活力测定。
⏹ 2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中让底物溶液以一定的流速流过酶柱收集流出的反应液测定其中产物的生成量或底物的消耗量。
⏹ 3. 连续测定法⏹利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。
⏹第二节固定化酶的性质及其影响因素提要⏹影响固定化酶性质的因素⏹固定化酶的性质⏹评价固定化酶的指标⏹第二节结束⏹点击返回⏹第三节固定化酶的制备⏹一．一般方法及特点⏹二．酶的固定化方法⏹一．一般方法及特点1．四大类方法：⏹吸附法（包括电吸附法）⏹结合法（无机多孔材料）⏹交联法（双功能试剂）⏹包埋法（微胶囊法）⏹各类固定化方法的特点比较:⏹2．选择方法依据：⏹（1）酶的性质⏹（2）载体的性质⏹（3）制备方法的选择⏹3．固定化后酶的考察项目：⏹（1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过⏹程的活力回收率。
⏹（2）考察固定化酶稳定性⏹（2）考察固定化酶最适反应条件⏹二．酶的固定化方法⏹（一）吸附法⏹（二）结合法⏹（三）交联法⏹（四）包埋法（entrapping method）⏹酶和细胞固定化示意图⏹（一）吸附法1．物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。
⏹ 2. 常用载体：⏹（1）无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。
一般吸附量<1mg蛋白/克吸附剂⏹（2）有机载体：淀粉、白蛋白等。
一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂⏹研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷⏹（二）结合法⏹ 1. 离子键结合法⏹ 2. 共价键结合法☆⏹ 1. 离子键结合法⏹概念⏹常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶⏹使用注意：pH、离子强度、温度⏹ 2 .共价键结合法⏹（1）概念⏹（2）可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键⏹（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体⏹（4）载体活化的方法⏹A．重氮法⏹B．叠氮法⏹C．烷基化反应法⏹D．硅烷化法⏹E．溴化氰法⏹A．重氮法⏹反应示意式如下⏹A．重氮法⏹目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等⏹该方法需要载体具有芳香族氨基⏹A．重氮法⏹反应式及原理⏹A．重氮法例⏹5′-磷酸二酯酶的固定化。
此酶用来降解核酸，可分离得到四个5′-单核苷酸⏹（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）⏹ B 叠氮法⏹例⏹用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：⏹⑴酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。
⏹⑵肼解。
把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤干燥。
⏹⑶叠氮化。
肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶⏹(4) 偶联。
经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时，过滤，用0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）⏹C．烷基化反应法⏹D．硅烷化法⏹一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。
⏹多孔玻璃特点：⏹①机械强度好，表面积大。
⏹②耐有机溶剂和微生物破坏。
载体可以再生，寿命长等。
⏹D．硅烷化法⏹D．硅烷化法⏹D．硅烷化法⏹ E ．溴化氰法⏹本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。
如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等.⏹（三）交联法⏹概念：⏹借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
⏹用处：⏹可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
⏹（三）交联法的形式⏹交联法有2种形式：酶直接交联法⏹酶辅助蛋白交联⏹双重固定法（1）吸附交联法⏹（2）交联包埋法⏹酶直接交联法⏹概念：⏹在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。
⏹影响因素：⏹固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。
⏹酶辅助蛋白交联⏹概念：⏹为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质.⏹（1）吸附交联法⏹概念：⏹先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。
⏹用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。
⏹（2）交联包埋法⏹概念：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。
⏹优点：这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。
⏹（四）包埋法（entrapping method）⏹定义：⏹将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
⏹（四）包埋法⏹包埋法分为网格型和微囊型⏹1．网格型⏹2．微囊型⏹1．网格型⏹(1) 概念：⏹将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。
也称为凝胶包埋法。
⏹2．微囊型包埋法⏹是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
⏹微囊化法制备固定化酶有两种方法⏹①界面沉淀法⏹②界面聚合法⏹①界面沉淀法⏹这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。
此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。
⏹②界面聚合法⏹是用化学手段制备微囊的方法。
利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。
⏹②界面聚合法⏹第三节提要⏹一般方法及特点⏹酶的固定化方法⏹第三节结束⏹点击返回⏹第四节微生物、植物和动物细胞固定化⏹细胞特性比较⏹概念：⏹固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.⏹该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。
⏹细胞固定化方法⏹吸附法⏹包埋法⏹吸附法⏹它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。
⏹影响吸附法的主要因素⏹（1）Z-电位：Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小⏹（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质⏹（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料⏹包埋固定法⏹包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。
⏹包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。
⏹包埋法分类⏹常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺⏹常用凝胶包埋法⏹通过改变载体溶液参数包埋细胞⏹改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。
⏹研究热点——光交联树脂包埋法⏹例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得⏹固定化细胞的目的⏹微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期⏹植物细胞⏹动物细胞⏹第四节固定化细胞提要⏹特点⏹方法⏹目的⏹第四节结束⏹点击返回⏹第五节固定化原生质体和辅酶⏹一原生质体固定化的方法⏹制备原生质体——将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液——包埋法固定化原生质体。
⏹关键：原生质体如何制备？⏹二原生质体的制备⏹将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——去细胞壁——分离纯化——得到原生质体-活性鉴定⏹三酶解注意要点⏹ 1 酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。