第三章 核酸化学 后

核酸的分离和纯化 核酸碱基顺序分析 聚合酶链式反应
Frederick Sanger
（自学内容）
Kary Mullis
3、分子杂交（Hybridization ）
不同来源的变性DNA，若彼此之间有部分互补 的核苷酸顺序，当它们在同一溶液中进行热变性 和退火处理时，分子间部分配对成双链，这个过 程称为分子杂交。
Southern印迹法( Southern blotting)
将胶浸泡在碱溶液中使DNA进行变性，然后 将变性DNA转移到硝酸纤维素膜上〔硝酸纤 维素膜只吸附变性DNA)，在80 ℃烤4－6小时， 使DNA牢固地吸附在硝酸纤维素膜上。
实际上，Tm是增色效应达到最大值的50%时的温 度。也就是说，DNA溶液的温度达到Tm时，将有 50%的DNA双链处于解链状态。
DNA的Tm一般为70～85℃。
Tm随DNA分子中G-C碱基对含量的增加而升高。 它也与溶液的离子强度有关，一般情况下，离子 强度低，Tm值小。
2、DNA的复性∶
在核酸和核苷酸分子 中，既含有可以给出 H+的磷酸基团，又含 有可以得到H+的碱性 基团(碱基上的-N=， 如嘌呤的N1和N7，胞 嘧啶的N3)，所以核酸 和核苷酸是两性化合 物，有等电点。
NH2 N O -O P O OH H OH O H H H N N N
5
´－脱氧腺苷一磷酸
四、核酸的变性、复性和分子杂交 1、变性∶
一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构 及生物活性的现象
退火（annealing） 缓 慢 冷 却
热复性
高温变性
急 速 冷 却
复性失败
与复性有关的因素∶
(1) 降温速度。若热变性的DNA从高温(Tm)迅速 冷却至低温(4℃以下)，则不能复性，此过程 称为淬火。 (2) DNA溶液的浓度越大，互补DNA链片段碰 撞机会越多容易发生复性。 (3) DNA片段越大，DNA内部的顺序越复杂， 扩散速度也越慢，互补链的相遇机会也越小， 复性也越难。
然后与放射性同位素标记的变性后的DNA探 针进行杂交。
杂交须在较高的盐浓度及适当的温度(68℃)下 进行数小时或十余小时。
应用类似的方法也可用于分析RNA、蛋白质。
• 将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜再进行杂交，这 方法称Northern印迹法(Northern blotting)。 • 根据抗体与抗原可以结合的原理，也可以分析蛋白 质。这个方法称Western印迹法(Western blotting)
增色效应(hyperchromic effect)∶当核酸变性或降 解时，其紫外吸收显著增强，这就是核酸的增 色效应。
减色效应(hypochromic effect)∶当变性的核酸在 一定条件下恢复其原有的性质时，其紫外吸收 的强度又可恢复到原有的水平，这种现象称为 减色效应。
三、核酸和核苷酸的两性解离∶
(1) 概念∶
核酸变性是指核酸分子中双螺旋区域的碱基对之 间的氢键受某些理化因素的作用而破坏，变成单 链的过程。
核酸变性不涉及共价键的断裂，所以变性后 相对分子量不变，但其理化性质和生物功能 都会发生变化，最重要的表现为∶
溶液粘度降低 沉降速率增加 紫外吸收显著增强∶DNA可增加20-25% RNA可增加10%左右。 生物功能丧失或减弱。
六、核酸的呈色反应
核酸分子中含有核糖和磷酸，它们可以分别与专一 性的化学试剂发生颜色反应，作为定性、定量检测 核酸的依据。
(1) 核糖的地衣酚(3，5-二羟基甲苯)反应∶ 用于定量测定RNA的含量。
(2) 脱氧核糖的二苯胺反应∶
用于定量测定DNA的含量。
(3) 核酸中磷酸的定量测定∶经典的钼蓝法 RNA和DNA的含磷量分别为9.2%和9.5%。
N 7 8 9 NH 5 4 6 3 N 1N 2
5
4
6 1 NH
N 3 2
核酸的紫外吸收性质可以用于鉴定DNA和RNA的纯度， 常用A260/A280比值来判断。 纯DNA ∶A260/A280=1.8 纯RNA∶A260/A280=2.0 若样品的蛋白质含量增加，A260/A280比值怎样变化？
变性的DNA在适当条件下，两条彼此分开的互 补单链又可以恢复碱基配对，重新成为双螺旋，这 个过程称为DNA的复性（DNA renaturation）。
复性后的DNA的某些理化性质和生物活性也可 以得到部分或全部恢复。如∶减色效应。 退火（annealing）: 即DNA由单链复性变成双链结构的过程。来源 相同的DNA单链经退wk.baidu.com后完全恢复双链结构，不同 源DNA之间、DNA和RNA之间退火后形成杂交分 子。
DNA变性的 本质：双链 间氢键的断 裂
(2) 引起核酸变性的因素∶ 高温 极端pH (pH>10或pH<4) 变性剂(如∶尿素等) (3) DNA的变性温度(Tm):
DNA的变性不是随温度升高而逐步发生的，而 是当温度达到某一数值时，在很窄的温度范围内， 变性突然发生并迅速完成，就象晶体物质达到熔 点时突然融化一样，这一温度就称为DNA的变性 温度，也称为DNA的熔点，用Tm来表示。
生 物 化 学
第三章 核酸化学
课堂测验
DNA双螺旋结构模型要点 信使RNA的主要结构特征
第四节
核酸及核苷酸的性质
一、一般理化性质∶
核酸为多元酸，具有较强的酸性；
DNA是线性高分子，粘度极大
均为极性化合物，难溶于有机溶剂。
二、紫外吸收性质∶
嘌呤碱和嘧啶碱均含有共轭双键，因此，核苷、核苷酸、 DNA和RNA在240～290nm范围内均有紫外吸收。 最大吸收峰在260nm左右。