生化实验整理

1. 氨基酸的分离鉴定——纸层析法

一、实验目的

✓ 了解层析技术的一般原理

✓ 掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分

二、实验原理

➢ 层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的

➢ 固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用

➢ 流动相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂

➢ 分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比例，常用K 来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据

➢ 迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用R f 来表示

分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件，差异越大，分离效果越理想

➢ 层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等

➢ 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用R f 值表示：

在一定条件下，某种物质的R f 值是常数。R f 值的大小与物质的结构、

性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关

❖ 氨基酸显色反应——茚三酮反应原理：

所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物

质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质

该反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO 2、NH 3和醛，水

合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮结合另一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质

f R

三、实验器材

大试管及塞子，大头针，三角薄层喷瓶，毛细管，吹风机，层析滤纸（新华一号），分液漏斗

四、实验材料与试剂

扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物

氨基酸混合液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸的混合液（各组份浓度均为0.5%）显色剂：0.1%水合茚三铜正丁醇溶液

五、实验操作

➢取层析滤纸（20×2cm）一条，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔划一直线，取其中点作为原点。在大试管中加入适当的扩展剂，使扩展剂的液面处于

悬挂在橡皮塞上的层析滤纸的原点到底端的中间

➢点样：用毛细管将氨基酸混合液点在原点上，用吹风机吹干，干后再点一次。每次在纸上扩散的直径最大不超过3mm

➢扩展：将点好样的层析滤纸悬挂于橡皮塞的钩子上，点样端的底边浸入扩展剂约1.5cm。保持大试管的垂直，待溶剂上升15～20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，用吹风机热风吹干

➢显色：用三角薄层喷瓶将0.1％茚三酮正丁醇溶液均匀地喷在风干的层析滤纸条上，用热风吹干即可显出各层析斑点

➢计算各种氨基酸的R f值

六、注意事项

➢为了防止滤纸被手上的汗液污染，应尽量在操作时带手套

➢重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸

2.血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

一、实验目的

✓了解电泳技术的一般原理

✓学习醋酸纤维薄膜电泳的操作

二、实验原理

➢电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，

因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁

移率不同，因此可使它们分离

➢影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象

➢影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状➢按支持介质不同可将电泳分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳

➢另外，还可以按分离原理不同、支持介质形状不同、用途不同以及所用电压不同等将电泳分类

➢电泳的装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移；电泳槽可以分为水平式和垂直式两

类

➢采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小

➢醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术，它具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点

➢本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。

以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白

三、实验器材

醋酸纤维薄膜（2×8 cm），常压电泳仪，点样器（盖玻片），培养皿，粗滤，载玻片，镊子

四、实验材料与试剂

兔血清（实验室制备），巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07），

染色液（氨基黑10B），漂洗液

五、实验操作

➢浸泡：将2×8 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡30 min方可用于点样

➢点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线

➢电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥

➢电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电，调节电压至160 V，电流强度为0.4～0.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约25 min ➢染色：电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡

5 min

➢漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱