实验一 蛋白质的定量测定 Lowry法
Lowry法检测蛋白质含量
Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
实验一蛋白质的定量测定
蒸馏水(ml)
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
Fo1in-酚试剂甲(ml)
5
5
5
5
5
5
5
摇匀，室温下放置10分钟
Fo1in-酚试剂乙(ml)
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白， 在500nm处比色
A500
各管加入Fo1in-酚试剂乙后，立即摇 匀，放置30分钟后比色，在500nm处 记下各管光密度，以0号管为对照，以 光密度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
01
测定未知样品：
02
取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加5毫升
Fo1in-酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫
1
进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波 长：若蛋白质含量高时（25-100μg）在500nm波长处 进行测定，含量低时(5-25μg)在755nm波长处进行测 定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白 质的含量。
2
此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备， 灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵 敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以 稳定几个小时。
试剂乙： 称钨酸钠（Na2WO2•2H2O）100g，钼酸钠
（Na2MoO4•2H2O）25g置2000ml磨口回流装置内， 加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充 分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小 玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4） 150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸 15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过 滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带 任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存 液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分 钟，恢复原色仍可继续使用。 试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢 氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液 颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂 的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸 度应用。
蛋白质检测(Lowry)--方法学验证
Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。
2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。
4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。
0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。
0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。
0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。
酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。
3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。
生化实验：Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
试剂乙
深蓝色
(Folin试剂)
实验步骤
1．样品的稀释：准确取血清0.1ml (擦 慢 吹) ，置
于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，倒置摇匀。 2．取玻璃试管7支，
表1 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定血清蛋白质含量的测定步骤
3
实验结果
1 各管吸光值记录 2 制作标准曲线（坐标纸做，贴于实验报
Folin-酚试剂法（Lowry法）测 定蛋白质浓度
1
实验目的
1. 掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理及操作。 2. 掌握标准曲线的制作方法。
实验原理
碱性铜试剂 试剂甲
蛋白质（肽键）
铜-蛋白质络合物（双缩脲反应）
-CO-NH-
紫红色
铜-蛋白质络合物（酪氨酸，色氨酸）
磷钼酸-磷钨酸
磷钼蓝 + 磷钨蓝
标注于图中 文字说明：利用标准曲线求得待测蛋白浓度值
3 利用公式法求出待测蛋白浓度
4
实验讨论与分析 实验结论 思考题：绘制标准曲线的意义及制作注
意事项？
5
lowrry法检测蛋白质含量.
Lowry法测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定，可检测的最低蛋白质量达5μg，通常测定范围是20~250μg。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂（1）酚试剂（2）碱性铜溶液：摇匀，即得。
本液应临用配制。
标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支，用超纯水定量稀释至1mg/ml，作为贮备液。
精密量取贮备液1.0ml置10ml离心管中，用超纯水稀释至10ml，摇匀，即为100μg/ml 的标准蛋白质溶液。
测定法准确量取超纯水1.0 ml，作空白对照。
精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中，加超纯水至1.0 ml；精密量取一定体积供试品（含蛋白质50μg左右）置试管内，样品1α-IFN，分别取50ul和30ul，加超纯水至1.0 ml，稀释20倍和33.3倍；精密量取一定体积供试品2（含蛋白质50μg左右）置试管内，实验室样品2，分别取100ul和200ul，加超纯水至1.0 ml，稀释10倍和5倍；每管都加入碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟；快速加入酚试剂0.5ml，马上摇匀，室温放置8分钟，显色后，照紫外-见分光光度法，在波长650nm 处测定吸光度。
结果如下：以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。
方程：y=0.0023x + 0.0261 R2 =0.9961样品1α-IFN：7号管，稀释20倍，OD值0.163，经计算x = 59.52μg/ml，样品蛋白浓度为1.190 mg/ml。
8号管，稀释33.3倍，OD值0.110，经计算x = 36.48μg/ml，样品蛋白浓度为1.216 mg/ml。
则样品1 α-IFN的蛋白浓度为1.203mg/ml。
Lowry’s法(Folin-酚试剂法)测定蛋白含量
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原理
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白 质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标 准液比色即可求出蛋白质的含量。
即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品 中蛋白质的含量。
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血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
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本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
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即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与 碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白 质- Cu2+复合物。
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原理
第二步：Folin-酚显色反应
Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其 磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈 蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质 中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显 色反应。
– 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则 第1支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟 后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加 第3支试管，以此类推。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
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数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
实验一蛋白质的定量测定
实验一蛋白质的定量测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。
在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA 法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。
例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA 法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较测定范围（μ 不同种类最大吸收波方法特点g/ml）蛋白的差异长nm 标准方法，准确，操作麻烦，费时，凯氏定氮法小灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物100—1000 大280205 度法质有影响重复性、线性关系好，灵敏度低，测双缩脲法1000—10000 小540 定范围窄，样品需要量大Folin-酚试20—500 大750 灵敏，费时较长，干扰物质多剂法考马氏亮蓝灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会50—500 大595 G-250 转移灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时BCA 50—500 大562 较长由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250 染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
Lowry法检测蛋白质含量
Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
实验一-紫外吸收法和Lowry法测定蛋白质含量
五、实验结果
以吸光度值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度 为横坐标绘制标准曲线。根据所描点的分布情况， 作直线或光滑连续的曲线。
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中得出样品溶液的蛋白质含量，再乘以稀 释倍数，即可得出样品中的蛋白质含量。
六、思考题
（1）Lowry法测定蛋白质浓度的原理？ （2）请问该方法有哪些干扰因素，应如何避免？
紫外吸收法测定蛋白质含量
一、实验目的
学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原 理；
熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用 方法。
二、实验原理
由于蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸等芳 香族氨基酸残基，使蛋白质在280nm波长处有 最大吸收峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶 液280nm吸光度与其浓度呈正比关系，可利用 这一性质作蛋白质定量测定。
4
蛋白质浓度 /mg·mL-1
0
1 0.5 3.5 0.125
2 1.0 3.0 0.250
3 2.0 2.0 0.500
4 2.5 1.5 0.625
5 3.0 1.0 0.750
2．样品测定
（1）待测蛋白质溶液含量测定： 取待测蛋白质溶液1mL置于10mL试管中，加入 3mL0.9%NaCl溶液，混匀。以0.9%NaCl溶液为空白 溶液，按上述方法测定待测蛋白质溶液280nm的吸 光度值（A280），并从标准曲线上查出待测蛋白质 溶液的浓度。
四、实验方法
1．制作标准曲线
取6支试管，编号，按下表分别向试管内加入各 种试剂，混匀。选用光程为1cm的石英比色皿，
以0号管为空白管调零，在280nm波长处分别测定
各管溶液的吸光度值（A280）。以蛋白质浓度为 横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线。
蛋白含量(Lowry法)测定标准操作规程
细胞因子蛋白含量（Lowry法）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于细胞因子原液的检定。
目的：检测细胞因子原液的蛋白质含量。
原理：lowry法是在双缩脲反应的基础上发展起来的。
是由试剂A和试剂B二部分组成。
试剂A是碱性铜试剂；试剂B含有磷钨酸和磷钼酸。
在碱性条件下，蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色的蛋白质与铜的复合物，然后此复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原试剂B中的磷钼酸-磷钨酸，产生深兰色，为钼兰和钨兰的混合物，其呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，可用比色法测定蛋白质浓度。
内容：1 材料1．1样品：经二人核对好批号后测定。
1．2试剂钨酸钠Na2WO4·2H2O 化学纯钼酸钠Na2M O O4·2H2O 分析纯磷酸H3PO4 分析纯浓盐酸HCl 分析纯硫酸锂Li2SO4 分析纯酒石酸钾钠C4H4O6KNa·4H2O 分析纯硫酸铜CuSO4 分析纯氢氧化钠NaOH 分析纯无水碳酸钠Na2CO3 分析纯溴水Br2 分析纯1．3标准品：由中国药品生物制品检定所提供。
1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．5其它材料：试管架、吸球、硫酸纸、药勺、记号笔、玻璃比色杯。
1．6仪器、设备紫外分光光度仪,UV-265扭力天平，TN100B冰箱，BOD-170A1．7器皿试管、量筒（250ml、100ml）、玻璃瓶（500ml、250ml）、棕色磨口瓶（50ml、500ml）、吸管（1ml、5ml、10ml），以上均由本室洗刷组处理干净。
2 方法2．1准备工作2．1．1工作环境：控制区确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。
2．1．2调试仪器设备2．1．2．1紫外分光光度仪，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。
2．1．2．2扭力天平，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。
2．1．2．3冰箱，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。
蛋白质定量(LOWRY法)
蛋白质定量/蛋白质含量的测定(LOWRY法)实验原理Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。
因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
实验试剂Na2WO4•2H2O；Na2MoO4•2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4•H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4•5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。
实验设备试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。
实验材料可溶性蛋白质实验步骤1. 酚试剂的制备（1）取Na2WO4•2H2O 100g，Na2MoO4•2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。
安上回流冷却装置（使用磨口接头。
用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入Li2SO4•H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。
冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。
使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。
滴定终点由蓝变灰。
Lowry法和 Bradfard法测定蛋白质含量
Lowry 法和Bradfard法测定蛋白质含量一.试剂Folin酚试剂(甲) 70毫升Folin酚试剂(乙) 8毫升考马斯亮兰G250 70毫升BSA 10毫升二.实验材料血清 10 ml小白菜 2克(叶多梗少)三.实验仪器722分光光度计 ; 低速台式离心机;电热恒温水浴(37℃) ; 微型漩锅混合仪四.本次实验所需器皿洗涤普通试管 27只 0.5毫升移液管 2支离心试管4只 1毫升移液管 5支50毫升容量瓶 4只 5毫升移液管 2支￠7㎝布氏漏斗 1个研钵 1个150ml抽滤瓶 1个 50毫升烧杯 1个125毫升棕色试剂瓶 2个玻璃比色皿 1对说明:1.试剂乙加入后务必立即混合.2.血清与BSA在两种测定方法中浓度不同.用时从冰箱冷藏室取用.3.取试剂一律用本实验配给的专用干净量具,按给定取用量一次性取足,量具用毕放回原处,勿扯用.15ml以内试剂取用量可直接用自备试管(1.5×15)或具塞试管装取,其余用试剂瓶装取.4.实验材料一律用自来水、蒸馏水洗净,吸水纸吸干水分后再用称量纸称重.一般情况测定酶及RNA等材料都采用冰浴研磨.5.移液管、容量瓶用洗液洗涤.(洗瓶用毕倒回原瓶)其余用洗衣粉洗涤(务必用自来水反复冲洗十几遍后再用蒸馏水过一遍)6.使用所有仪器前必须清楚该仪器的正确使用方法及步骤,使用光度计时,自带洗瓶、废液杯(500ml塑料烧杯),并登记仪器使用情况.7.值日生负责本次实验工具取还,蒸馏水补充及实验室卫生.卫生要求:(1)所有实验台及公用台抹干净,地面拖干净.(2)检查所有仪器是否置正常关机位置.并拔出电源,盖好机罩.(3)垃圾倒干净,废液桶倒干净.。
蛋白质定量(LOWRY法)
蛋白质定量/蛋白质含量的测定(LOWRY法)实验原理Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。
因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
实验试剂Na2WO4•2H2O；Na2MoO4•2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4•H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4•5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。
实验设备试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。
实验材料可溶性蛋白质实验步骤1. 酚试剂的制备（1）取Na2WO4•2H2O 100g，Na2MoO4•2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。
安上回流冷却装置（使用磨口接头。
用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入Li2SO4•H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。
冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。
使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。
滴定终点由蓝变灰。
蛋白质的含量测定
蛋白质的定量测定方法一、Folin-酚试剂法(Lowry法)【实验目的】1.学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理。
2.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。
【实验原理】蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。
反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物；第二步：蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。
进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25-100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(5-25μg)在755nm波长处进行测定。
最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。
Folin-酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。
【实验材料】1.实验器材100毫升容量瓶 2只；移液管 1毫升4支，5毫升2支；721型分光光度计。
2.实验试剂(1) Fo1in-酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50ml 0.lmol／L氢氧化钠溶液中，再把0.5g硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶于100m1 1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50ml与后者lml 混合。
混合后1日内使用有效。
(2)Folin-酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、700ml蒸馏水、50ml 85％磷酸及100ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加150g硫酸锂、50ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml。
蛋白测定方法之Folin—酚试剂法(Lowry法)
蛋白测定方法之Folin—酚试剂法（Lowry法）来源：生物谷访问量：549评论(0)分享0（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。
过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。
以后在生物化学领域得到广泛的应用。
这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。
蛋白质检测(Lowry)--方法学验证
Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。
2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。
4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。
0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。
0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。
0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。
酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。
3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。
Lowry法检测蛋白质的含量
Lowry法检测蛋白质的含量一、实验原理：首先在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物，该复合物加入酚试剂后产生蓝色复合物。
该蓝色复合物在650nm处的吸光度值与蛋白质的含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
二、配液碱性酒石酸盐溶液：称取无水碳酸钠20.0g，氢氧化钠4.0g，酒石酸钾钠0.2g，加水至1L，溶解混匀。
硫酸铜溶液：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.0g，加水至200ml，溶解混匀。
碱性铜溶液（现用现配）:量取溶液A 100ml，溶液B 2ml，混匀即得。
标准蛋白质储备液（1mg/ml)：用纯化水将牛血清白蛋白对照品定量稀释至1mg/ml，混合均匀，用1.5ml离心管分装，1ml/管，贴好标签，于-20℃或以下低温冰箱贮存。
标准蛋白质工作液（100μg/ml）:将标准蛋白质贮备液用前10倍稀释至100μg/ml。
阳性对照（约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液）：精密称取牛血清白蛋白25mg，加纯化水溶解，加入500ml容量瓶中，定容至刻度，混合均匀，冷冻管分装，每管2.5ml，贴好标签，于-20℃或以下低温冰箱贮存，有效期两年。
三、步骤：1.将标准蛋白质贮备液（1mg/ml）稀释成100μg/ml的标准工作液。
2.量取标准工作液（双份）0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别加入刻度试管中，补水至1ml。
3.精密量取供试品和阳性对照1.0ml（双份）于刻度试管中；吸取1.0ml 纯化水作为空白对照。
4.加碱性铜溶液（溶液A100ml、溶液B2ml混匀）5.0ml到每一管中，涡旋混匀，室温条件放置10分钟。
5.加酚试剂（稀释至1N）0.5ml，摇匀，室温放置30分钟。
6.在650nm处用空白对照调零后，测定标准溶液的吸光度值，以及供试品和阳性对照的吸光度值。
根据标准蛋白浓度和其对应吸光度的标准曲线，计算供试品和阳性对照的蛋白含量。
实验一 蛋白质的定量测定 Lowry法
1、 熟悉改良Lowry法测定血清蛋白质含量的原理。
2 、掌握直接比色法和标准曲线法的应用。
3 、熟悉分光光度计的使用。
二、 实验原理
考马斯亮蓝法 紫外分光光度法 Lowry法
二、 实验原理
蛋白质
碱性铜试剂
肽键
酪氨酸、色氨酸等 紫红色蛋白质-铜的络合物 氨基酸残基
酚试剂
蓝紫色溶液
二实验原理考马斯亮蓝法lowry法紫外分光光度法二实验原理蛋白质紫红色蛋白质铜的络合物碱性铜试剂酚试剂蓝紫色溶液肽键肽键酪氨酸色氨酸等酪氨酸色氨酸等氨基酸残基直接比色法标准曲线法aklcaklc三实验步骤试剂ml标准蛋白溶液250gml0204060810稀释血清1009nacl10080604020610碱性铜试剂505050505050505050混匀37保温20分钟酚试剂050505050505050505混匀37保温30分钟四结果与分析血清蛋白质含量的计算标准曲线法
碱性铜试剂
5.0
混匀，37℃ 保温20 分钟 酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀，37℃ 保温30分钟
四、 结果与分析
血清蛋白质含量的计算
直接比色法：根据标准管吸光度值计算血清中蛋白质 的含量
标准曲线法：绘制标准曲线，根据标准曲线求得血清 中蛋白质的含量
A=KLC
直接比色法
标准曲线法
ห้องสมุดไป่ตู้
三、 实验步骤
试剂（ml） 标准蛋白溶液
（250μg/ml）
1
2
3
4
5
6
测 定 管
稀释血清
标 准 管
空 白 管
1.0
Lowry法测定蛋白质浓度
Lowry法测定蛋白质浓度Lowry法测定蛋白质浓度1.原理本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜—蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
2.试剂（1）酚试剂来源：a.配制：取钨酸钠（Na2WO4·2H2O ）l00g和钼酸钠（Na2MoO3 ）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水，85%磷酸50ml，盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10h。
取下回流管，加入l硫酸锂（Li2SO4·H2O ）150g，水50ml，溴液几滴，煮沸约15min，去除过量的溴，冷却加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。
酚试剂贮备液用NaOH滴定液（0.5mol/L）测定酸浓度，然后加水稀释至相当于1mol/L盐酸浓度。
b.购买：市售酚试剂在使用前用0.5mol/L NaOH滴定液，以酚酞为指示剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。
（2）碱性铜溶液取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)溶液各0.5ml，4％碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.8%NaOH溶液各25ml，摇匀，即得（注：现用现配）。
（3）0.5mol/L NaOH滴定液的配制及标定取NaOH适量，加水搅拌使溶液成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静止数日，澄清后，取澄清的NaOH饱和溶液28ml，加新煮沸后冷却的水，使成1000ml，摇匀。
取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新煮过的冷水50ml,摇匀，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。
每1ml NaOH滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。
根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。
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1、 熟悉改良Lowry法测定血清蛋白质含量的原理。
2 、掌握直接比色法和标准曲线法的应用。
3 、熟悉分光光度计的使用。
二、 实验原理
考马斯亮蓝法 紫外分光光度法 Lowry法
二、 实验原理
蛋白质
碱性铜试剂
肽键
酪氨酸、色氨酸等 紫红色蛋白质-铜的络合物 氨基酸残基
酚试剂
蓝紫色溶液
碱性铜试剂
5.0
混匀，37℃ 保温20 分钟 酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀，37℃ 保温3
直接比色法：根据标准管吸光度值计算血清中蛋白质 的含量
标准曲线法：绘制标准曲线，根据标准曲线求得血清 中蛋白质的含量
A=KLC
直接比色法
标准曲线法
三、 实验步骤
试剂（ml） 标准蛋白溶液
（250μg/ml）
1
2
3
4
5
6
测 定 管
稀释血清
标 准 管
空 白 管
1.0
5.0
0.2 0.8
5.0
0.4 0.6
5.0
0.6 0.4
5.0
0.8 0.2
5.0
1.0 5.0
1.0
0.4 0.6
5.0
1.0
5.0
0.9% NaCl