生物制药学第三章基因工程制药
生物制药:基因工程制药3
名称
重组链激酶 (SK )* 重组葡激酶 (SAK )* 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)*
人bFGF 牛bFGF融合蛋白 表皮生长因子(EGF)* EGF 衍生物* 生长激素(GH) 人胰岛素 白介素11 (IL-11) 抗IL-8 鼠源单抗乳膏剂* Anti-CD3 鼠源单抗 [131I]肿瘤细胞嵌合抗体注射液* 乙肝疫苗 痢疾疫苗* 霍乱疫苗* p53重组腺病毒注射液*
固体蛋白质比液体稳定,在室温或冰箱中保存比较稳定,长 期保存最好制成干粉或结晶
(十) 基因工程药物制造实例
我国已批准生产的生物技术药物和疫苗
名称
干扰素 IFN-α1b * IFN-α1b (滴眼液) IFN-α2a IFN-α2a (栓剂) IFN-α2b IFN-α2b (凝胶剂) IFN-γ
注射用水需高压灭菌,柱层析配制溶液用水一律使用超纯 化水。所配制溶液经高压灭菌后需4℃保存,有效期7d
细胞破碎前,大肠杆菌应进行革氏染色,镜检是否均一、 有无污染。细胞需在倒置显微镜下观察,是否形态饱满, 是否有其它污染物污染
纯化工艺过程的质量控制要保证能尽量除去污染病毒、核 酸、残余宿主菌蛋白、热原质和培养基残余细胞内蛋白及 其它杂质以及纯化过程带入的有害物质
福林-酚法和紫外光谱法等 相对分子质量测定
凝胶过滤法:测定完整的蛋白质相对分子质量 SDS-PAGE法:测定蛋白质亚基的相对分子质量
(5)蛋白质二硫键分析 维持蛋白质一级结构的重要共价键
方法有对氯汞苯甲酸法 (p-chloromercuribenzoate, PCMB)和5,5’-二硫双基-2-
检测方法
产品是否含内毒素
家兔热原法
蛋白质是否变异
肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳
基因工程制药
基因工程制药基因工程制药是指利用生物技术手段,通过基因克隆、遗传工程、细胞培养等技术制备的药物。
相比传统的制药技术,基因工程制药具有高效、精准、无毒副作用等优点。
本文将从基因工程制药的概念、制备过程、应用、发展现状等方面进行介绍。
一、基因工程制药的概念基因工程制药是指利用遗传工程技术,将DNA序列插入到细胞内,使细胞能够表达人类所需的有效蛋白质,从而制备出符合医疗需求的药物。
基因工程制药的研发已成为制药业的重要领域,具有广阔的市场前景和潜力。
二、基因工程制药的制备过程基因工程制药的制备过程包括基因选择、基因克隆、载体构建、转染细胞、发酵培养和纯化等步骤。
1、基因选择基因工程制药的制备过程首先要选择适合人体治疗的基因,可以是已知的治疗目标基因,也可以是新发现的疾病相关基因。
2、基因克隆基因克隆是将目标基因从DNA分子复制到载体上的过程。
其中包括PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤,最终得到包含目标基因的重组载体。
3、载体构建为了使目标基因的表达量达到较高水平,需要将目标基因克隆到适合的载体中。
典型的载体包括质粒和病毒。
4、转染细胞将重组载体转染到宿主细胞中,宿主细胞将目标基因表达成蛋白质。
常用的宿主细胞有哺乳动物细胞和真菌等。
5、发酵培养将转染后的细胞进行大规模培养,加入培养基和营养成分,进行培养和生长。
由于基因工程制药药物的生产量较大,通常采用发酵技术进行生产。
6、纯化将发酵得到的药物纯化出来,使其达到医药级别要求。
通常采用多种分离纯化技术,如超滤、离子交换和透析等,得到纯度高、活性好的药物制剂。
三、基因工程制药的应用基因工程制药已经广泛应用于多种疾病的治疗中,如慢性病、肿瘤、代谢性疾病和遗传性疾病等。
其中常见的基因工程制药药物有类风湿关节炎药物、肿瘤靶向药物、生长激素、重组人胰岛素和重组人血小板等。
1、类风湿关节炎药物抗肿瘤类药物通过影响免疫系统来治疗类风湿关节炎。
这些药物通常在类风湿关节炎患者无法耐受非甾体类抗炎药物和光合作用药物时使用。
生物技术制药 第三章-基因工程制药
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1、mRNA的纯化
mRNA的特点:3’末端含有一多聚腺苷酸组成
的末端。
方法:亲和层析法
2、cDNA第一链的合成
一般 mRNA都带有3’-polyA,所以可以用寡
聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始
cDNA链的合成。
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3、cDNA第二链的合成
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吉林工程职业学院教案首页 课程名称 任课教师 授课题目 生物技术制药 刘子明 第三节 授课班级 授课时间 目的基因的获得
教学目标(从传授知识、训练技能方面说明): 1、逆转录法获得目的基因 2、化学合成法获得目的基因 教学重点、难点: 重点:逆转录法获得目的基因 难点:逆转录法获得目的基因 教学进程设计(含教学内容、教学设计、教学方法(手段)、时间分配等): 1、逆转录法获得目的基因 2、化学合成法获得目的基因 时间分配:回顾:5min;讲授:80min;总结:5min
以cDNA第一链为模板合成第二链。
4、cDNA克隆
用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体。
又将其分为表达型载体和非表达型载体。
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cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法: 加同聚尾连接:在载体和cDNA的3’末端加上互补的 同型多聚酶序列。 人工接头连接:所谓人工接头是指由人工合成的、连 接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸 片断。
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基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素、白细胞介素、集落 刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子; (3)激素,如胰岛素、生长激素; (4)酶类,如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤 维蛋白溶酶原激活剂、SOD。
第三章 基因工程制药
抗虫棉
具有柠檬味的西红柿
能产生人胰岛素的大肠杆菌
转基因超级鼠
蓝玫瑰(转基因)
转基因食品
转基因荧光鱼
基因工程药物概述
应用基因工程技术,完全打破生物界种的
界限,在体外对大分子DNA进行剪切、加 工、重新组合后引入细胞中表达出具有新 的遗传特性的性状,定向改造生物。 不仅在动植物的高产、优质、抗逆新品种 的选育上,而且在生产新型药物、疫苗和 基因治疗的研究上做出了贡献。
5、荧光鱼
2003年,美国得克萨斯的一 家公司宣布,经过转基因技 术他们已经研制出能发荧光 的小型热带鱼——“荧光鱼”。 这种“光芒四射”的红色荧 光鱼,是利用转基因技术得 到商标注册的第一种商业性 荧光宠物鱼。改基因后的斑 马鱼散发出粉红色荧光,远 看像金鱼一样。目前,公司 以GloFish的商标对红色荧光 鱼进行了注册,这标志着转 基因荧光鱼可以被当作家庭 宠物出售。
以下是科学家“制造”
出的最神奇、最古怪的 10种转基因动物
1、荧光鼠
2007年末,荧光鼠脑细胞的图 片传遍世界各地,从“福利客” 超市的宣传海报到“自然”杂志 的封面。这些五彩斑斓的脑细胞 是单个的神经元,鲜艳的色彩帮 助科学家将它们区分开来。英国 哈佛大学的杰夫-里奇曼为首的 科研小组在实验鼠的基因组中导 入水母的绿色荧光蛋白基因,使 其在紫色光线的照射下呈现出绿 色荧光。这种绿色荧光基因对小 鼠无害,只起到标记作用。
很多科学家把蜘蛛丝叫做“生物钢”,有着超强 的抗张强度。研究人员称,如果把很多蜘蛛丝拧成一 股绳的话,它足够强韧,可制成防弹背心、降落伞绳, 或者从飞机到航母等设备。 但蜘蛛与蚕不同,把很 多蜘蛛放在一起它们会彼此蚕食。因此,科学家始终 致力于想出集中生产蜘蛛丝的方法。 帮助“生产”这些山羊的怀俄明大学分子生物学 家兰迪-刘易斯说:“从概念上讲,这个过程非常简 单。用于丝蛋白的蜘蛛丝基因与控制蛋白质构成组织 的山羊的DNA有关。在这种情况下,它是乳腺,只形 成于哺乳期。然后,细胞与卵结合生成胚胎,胚胎有 着合成其DNA的基因。当母羊开始分泌乳汁时丝蛋白 就产生了。”
第三章 基因工程制药技术
美国基因制药状况
药品名 原适应症 2000年新适应症 Actimmune 类风湿(1990) 恶性骨刺 Ambisone 细菌感染(1997) HIV感染 Apligraf 腿溃疡(1998) 糖尿病足 Enbrel 风湿病(1998) 类风湿关节炎 Helixate 血友病A(1994) 第二代VIII因子(血友病) KogenateES 血友病A(1989) 第二代VII因子(血友病) Novantrone 白血病(1996) 前列腺癌 Gonal-F 妇科感染(1998) 不育症 Renagel Capsules 肾透析(1998) 血透析 Tamiflu 流感初期(1998) 急性流感 Tripedia 百白破预防(1996) 4-6岁预防百白破
DNA合成仪细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 克隆载体* (1)从基因组 DNA获取目 的基因基因组DNA
存在于转化细胞内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合
重组DNA分子 受体菌
• 起步较晚,基础较差。α 1b 型基因工程 干扰素是由我国自行研制开发的具有国 际先进水平的生物高科技成果,于1997 年 通过Ⅲ 期临床,并获得国家一类新药 证书,成为“863”计划生物技术领域第 一个实现产业化的基因工程药物。它源 于中国人基因,最适于黄种人使用。 • 目前我国已批准15种基因工程药物和疫 苗上市,在研究开发中的也有10余种。
3’ 3’
3’ 变性、退火 3’
延伸
变性、退火、延伸
PCR原理图
* (2)化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
• 亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定 在固相载体上完成 DNA 链的合 成的,合成的方向是由待合成引 物的 3' 端向 5' 端合成的,相邻的 核苷酸通过 3' → 5' 磷酸二酯键连 接,
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组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 (oligo-dT 亲和层析法)
• 借助于逆转录酶,以 mRNA 为模板,以 oligo-dT 为引物, 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链; • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增,即“逆转录
-PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法:将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段,然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增, 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性,酶切位点丰富。含 T7lac 启动子;含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签,便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC(平末端)
Haemophilus parainfluenzae
生物制药学第三章基因工程制药
三、包含体复性方法
溶液中复性 反胶束环境复性 分子伴侣 固相复性
第八节 分离纯化实例
基因工程表达一药物蛋白 研究阶段和生产阶段 分离纯化策略
重组类人胶原蛋白
胶原是结缔组织的结构蛋白 胶原蛋白是在提取胶原时,结构没
有改变的一类蛋白
羟脯氨酸
重组类人胶原蛋白是通过逆转录在 人体中钓取基因后,进行了某些位 点的突变,并在大肠杆菌中表达的 重组蛋白
外源基因在大肠杆菌中表达,表达产物 对宿主菌而言,是异物,所以大肠杆菌 体内常会产生一些蛋白,消化表达产物,
采用融合表达, 分泌表达, 点突变(改 变外源蛋白的酶切识别位点), 选用蛋 白酶缺陷型的宿主菌
细胞的代谢负荷
大量复制质粒和表达外源基因,会破坏 宿主菌原有的代谢平衡
减轻细胞代谢负荷的一个方法是菌体的 生长和表达外源基因分为两个阶段
上清液用硫酸铵分级沉淀 收集15%~65%饱和度的蛋白质沉淀
沉淀溶解在缓冲溶液中(20 mmol/ LTrisHCl,pH8.0)
截流分子量30,000的超滤膜脱盐浓缩
脱 盐 的 样 品 和 平 衡 缓 冲 液 (1mmol/LNaCl)1:1混合
层析柱用锌离子充分螯合,并用10 倍体积的平衡缓冲液平衡
pYES2
半乳糖激 酶启动子
pPIC9K
甲醇氧化酶 启动子
目前已发现 的、最强的 真核启动子
第三节 基因工程制药上游技术
一、目的基因的获得
1. 化学合成法 在核酸合成以上可以自动合成一条单链的
寡聚核苷酸,准确率比较高,但是费用也 高
2. PCR法
如果知道基因序列,且基因没有内含子, 就可以通过合成引物,通过PCR的方法人工 合成基因
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酵 母 表 达 系 统 ———— 包 含 体 ? ? ?
一、减少包含体的策略
发酵温度 分泌表达 选用合适的宿主菌和载体 稀有密码子
二、包含体的复性
盐酸胍、去污剂(Triton)等处理 蛋白变成完全随机的结构 除去变性剂 重新折叠成结构活性的蛋白
三、包含体复性方法
溶液中复性 反胶束环境复性 分子伴侣 固相复性
(c) AB链同时表达法
二、重组干扰素α
1957年Isaccs等发现病毒干扰现象,即病毒感 染的细胞能产生一种因子,作用于其他细胞干 扰病毒复制,因而命名为干扰素。
根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物 活性等差异,可分为α、β、γ等3种,其中 IFN-α为多基因产物,有23种以上的亚型。
上个世纪50年代末期临床应用,从血液 中直接提取
通过适当发酵工艺,可以提高质粒的稳 定性,可以间隙改变发酵的环境参数, 如温度、溶氧量、酸碱度等
选择合适的宿主菌或质粒
根据表达蛋白的性质,选择合适的宿主 菌和质粒搭配
pET 系 统 中 的 宿 主 菌 有 BL21 、 DE3 、 DH10B 等 , 质 粒 有 pET - 3 、 5 、 12 、 14、、17、21、22、25、28、32、34、 40等
上游主要程序
目的基因的获得和克隆 重组载体的构建 重组载体转入宿主细胞 外源基因在宿中细胞中的表达 表达产物的检测
下游主要程序
工程菌的发酵 目的蛋白的分离纯化 逐步加工成药品
第二节 常用表达系统
一、大肠杆菌表达系统
载体要求 有自主复制起点 筛选标记 启动子,能被RNA聚合酶识别 终止子 翻译起始信号 多克隆位点
第四节 基因工程制药上游过程实例
例一
引物,PCR扩增 PCR产物连接到T载体上
转化到大肠杆菌 T载体双酶切 表达载体双酶切
体外连接 转化到大肠杆菌
提取质粒 转化到表达宿主菌
诱导表达 电泳检测蛋白
实例二
引物,PCR扩增 PCR产物连接到T载体上
转化大肠杆菌 T载体双酶切 表达载体双酶切
方法:亲和层析纯化
发酵后的工程菌,5000r/min离心30分钟 质液比1:6将菌体悬浮于细胞破碎缓冲
液中(1mmol/LEDTA,5mmol/LTris)
冰水浴中超声波破碎仪间断超声十次, 每次90秒
破碎液于4℃,5000r/min离心1小时,收集 上清液
上清液用硫酸铵分级沉淀 收集15%~65%饱和度的蛋白质沉淀
pBV220系统 pET系统
pBV220质粒
菌株
DH10B JM109 DH5α
pET质粒
菌株
BL21 DE3
二、酵母表达系统
原核筛选标记 真核转录和表达元件,包括启动子、终
止字、翻译起始信号 真核复制起始位点或整合位点 真核筛选标记 载体要求 原核复制起始位点
啤酒酵母表达系统 毕赤酵母表达系统 裂殖酵母表达系统 汉逊酵母表达系统
5. 发酵条件的优化
工程菌表达药物蛋白,表达量 越高越好?
• 高效表达的目的蛋白
•无活性 •无法有效复性 •美国每年损失几十亿
第七节 包含体
包含体(包涵体) :又称光折射体,大 肠杆菌高量表达外源基因时,大量的表 达产物和DNA碎片、RNA、核糖体等结 合在一起形成的一种颗粒
包含体中的蛋白质一般是不正确折叠的 蛋白,特别是二硫键的错配
第五节 基因工程菌的稳定性
工程菌的不稳定性大多数是由于 质粒不稳定造成的
一、工程菌的稳定性 质粒分裂的不稳定 :工程菌分裂时出现一
定比例不含质粒子代菌的现象
质粒结构的不稳定 : 指外源基因从质粒 上丢失或者碱基重排、缺失而导致的工 程菌性能的改变
1. 质粒不稳定产生的原因
含质粒菌产生不含质粒菌的比率
包含体产物分离工艺(牛生长激素分离提取)
发酵罐
搅拌混合罐
缓冲液
离心机
高压匀浆器
粗包含体
下相
搅拌混合罐 EDTA
细胞壁溶解酶缓冲液
水
搅拌混合罐 盐酸胍 空气
上相
水
超滤器
凝胶过滤柱
透析器
滤液
缓冲液
超滤器 7滤7 液
第十节 基因工程药物介绍
一、重组胰岛素
胰岛素的作用是降低血糖浓度,达到治 疗糖尿病的目的
3. 逆转录法
对有内含子的基因常采用的方法,具体工 程为:提取细胞或组织的总RNA,用逆转 录酶和OligodT合成cDNA的第一链,再通 过PCR方法合成第二连
二、目的基因的克隆
一般是将目的基因连接到T载体上,但有时 候这一步可以省略
三、基因的体外重组
双酶切T载体和表达载体,体外连接
四、重组产物转入到宿主菌中
体外连接 转化大肠杆菌
提取质粒 转化到酵母中
活性检测
实例三
鲨鱼肝总RNA OligodT 逆转录第一链 鲨肝活性肽N端序列,OligodT
cDNA双链 连接到T载体上 双酶切 T载体和表达载体 体外连接两个片段 转化到大肠杆菌中 测序,与多肽序列对照
诱导表达 电泳检测分子量,活性试验
沉淀溶解在缓冲溶液中(20 mmol/ LTrisHCl,pH8.0)
截流分子量30,000的超滤膜脱盐浓缩
脱 盐 的 样 品 和 平 衡 缓 冲 液 (1mmol/LNaCl)1:1混合
层析柱用锌离子充分螯合,并用10 倍体积的平衡缓冲液平衡
上样后,平衡液冲洗,挂柱 100 mmol/ L的NH4Cl洗脱
采用融合表达, 分泌表达, 点突变(改 变外源蛋白的酶切识别位点), 选用蛋 白酶缺陷型的宿主菌
细胞的代谢负荷
大量复制质粒和表达外源基因,会破坏 宿主菌原有的代谢平衡
减轻细胞代谢负荷的一个方法是菌体的 生长和表达外源基因分为两个阶段
发酵条件的优化
二、酵母表达系统
1. 外源基因的拷贝数 相对于大肠杆菌,酵母的质粒要少得多,而整合
体外连接的产物,用合适的方法转入到宿 主菌中,如用氯化钙或电转化法转入到大 肠杆菌中,酵母的转化还要经历大肠杆菌 阶段
五、外源基因的表达
根据启动子的类型,采用不同的表达条件, 如pET系统,用IPTG或乳糖诱导,pBV220 系统采用温度诱导,毕赤酵母用甲醇诱导
六、目的蛋白的检测
一般采用活性试验和/或电泳菌体总蛋白 质
水蛭素现在已经能用大肠杆菌和酵母进 行生产
再见
70年代,直接从供血的白细胞中直接提 取
目前一般采用大肠杆菌表达系统生产
干扰素α可以明显地抑制胸腺癌、某些 淋巴肿瘤和多发性骨髓瘤,还能抑制骨 髓型肉瘤手术后肿瘤的复发
三、重组水蛭素
1884年,John Haycraft发现了医用水蛭 的提取物中含有抗凝血的物质
1957年,德国的Fritz Markwardt 从医用 水蛭的唾液腺中分离纯化出这种抗凝血 的物质,并命名为水蛭素
pYES2
半乳糖激 酶启动子
pPIC9K
甲醇氧化酶 启动子
目前已发现 的、最强的 真核启动子
第三节 基因工程制药上游技术
一、目的基因的获得
1. 化学合成法 在核酸合成以上可以自动合成一条单链的
寡聚核苷酸,准确率比较高,但是费用也 高
2. PCR法
如果知道基因序列,且基因没有内含子, 就可以通过合成引物,通过PCR的方法人工 合成基因
相对而言,Kan抗性的质粒一般比Amp抗 性稳定
增大选择压力
Amp的工作浓度一般在50μg/ml,发酵培 养是可以加大到200μg/ml
固定化技术
将细胞固定在载 体上进行培养
第六节 重组蛋白高表达策略
一、大肠杆菌表达系统
1. 外源基因的拷贝数 2. 外源基因的表达效率 3. 表达产物的稳定性 4. 细胞的代谢负荷 5. 发酵条件的优化
两种菌的比生长速度差异的大小
插入的外源基因影响了质粒稳定区的结 构
2. 提高质粒稳定性的方法
两阶段培养法 发酵工艺条件的优化 选择合适的宿主菌或质粒 增大选择压力 固定化技术
两阶段培养法
菌体生长的一定阶段的时候,进行诱导 表达
大肠杆菌的pET系统 毕赤酵母
发酵工艺条件的优化
型的质粒,如毕赤酵母,由于拷贝数可以比较高, 所以现在用地非常普遍 2. 外源基因的表达效率 1)启动子 2)分泌信号的效率 3)终止序列的影响 4)偏好密码子的使用
3. 外源蛋白的糖基化
4. 宿主菌的选择 1)生长力强 2)内源蛋白酶活性弱 3)菌株性能稳定 4)分泌能力强
第八节 分离纯化实例
基因工程表达一药物蛋白 研究阶段和生产阶段 分离纯化策略
重组类人胶原蛋白
胶原是结缔组织的结构蛋白 胶原蛋白是在提取胶原时,结构没
有改变的一类蛋白
羟脯氨酸
重组类人胶原蛋白是通过逆转录在 人体中钓取基因后,进行了某些位 点的突变,并在大肠杆菌中表达的 重组蛋白
分子量70,000
猪胰岛素,不良反应 1982年开始,美国等批准用DNA重组技
术生产的人源化胰岛素 三种生物合成胰岛素的方法
(a) AB链分别表达法 体外折叠成功率 低,通常只有10~20%
(b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在 ,胰岛素原在复性条件下能形成天然的 空间构象,为三对二硫键的正确配对提 供了良好的条件,使得体外折叠率高达 80%以上 目前Ely Lily用这种工艺路线 年产几十吨的重组人胰岛素,其经济效 益相当可观。
外源基因的拷贝数
一般情况下,菌体内质粒的拷贝数越 多,外源基因就越多,转录的RNA也就 越多,翻译出来的蛋白也就越多
外源基因的表达效率
就目前人们的认识水平,许多因素影响 外源基因的表达效率
启动子 核糖体结合位点 SD序列起始密码子ATG的距离 密码子的组成
表达产物的稳定性