激光扫描共聚焦显微镜 ppt课件
合集下载
共聚焦激光扫描PPT课件
.
4
共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
.
5
Wide-field microscopy
.
6
Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
12
基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
.
13
.
14
色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
.
15
对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
.
10
原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
.
7
Confocal microscopy
.
8
Confocal Principle
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra（Vnieikwo™n）C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
精选课件PPT
精选课件PPT
35
荧光光谱
精选课件PPT
36
精选课件PPT
37
分隔发射的荧光
精选课件PPT
38
Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
精选课件PPT
39
（四）计算机系统
控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光 挡片位置。
（10）、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting，感兴趣区域） 实时（real time）显示
（11）、有线和帧方式的多重扫描功能
精选课件PPT
27
（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无 须很复杂地对仪器参数重新设置
（13）、有记忆功能
（14）、有专用的图象数据库 （15）、系统采用模块化设计，便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能
量共振转移）软件包。 精选课件PPT
41
精选课件PPT
42
三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
（一）样品制备
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
18Biblioteka THANK YOU19
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
10
11
12
Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
12
13
黑麦草
洋葱
13
北京化工 大学
14
15
15
16
16
A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
17
(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
共聚焦激光扫描显微术ppt课件
放
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
《激光共聚焦技术》课件
多模态成像技术结合
将激光共聚焦技术与其它成像技术（如超声、MRI等）相 结合，可以实现多模态、多尺度的成像，为科学研究提供 更多信息。
人工智能与大数据分析
结合人工智能和大数据分析技术，对激光共聚焦图像进行 深度挖掘和定量分析，提高实验结果的可靠性和可重复性 。
05
实验操作与注意事项
实验前的准备
实验材料
将激光束转换为扫描线，并控 制显微镜的X和Y轴移动。
检测器
用于检测荧光信号，并将信号 转换为电信号。
激光器
用于产生激发光，常用波长为 405nm、488nm、561nm和 640nm。
物镜
用于将激光束聚焦到样品上， 并收集荧光信号。
计算机
用于控制扫描头、物镜和检测 器，并收集和处理荧光信号。
性能指标
光漂白与光毒性
强激光束可能会引起荧光分子的光漂 白和光毒性，影响实验结果和细胞活 性。
未来发展与展望
提高成像速度
未来可以通过改进扫描技术和提高探测器性能来提高激光 共聚焦技术的成像速度，以适应更多动态观察的需求。
拓展应用领域
随着技术的进步和应用需求的增加，激光共聚焦技术有望 在更多领域得到应用，如医学诊断、药物研发等。
细胞生物学研究
细胞形态与结构研究
利用激光共聚焦技术观察细胞形态、细胞器结构以及细胞骨架等，有助于深入 了解细胞生物学特性。
细胞分子定位与相互作用
通过荧光标记技术，对特定分子进行定位和追踪，研究分子在细胞内的分布、 动态变化以及与其他分子的相互作用。
医学诊断与治疗
疾病诊断
利用激光共聚焦技术对活体组织进行无创检测，有助于早期发现和诊断肿瘤、炎 症等疾病。
显微镜设置
根据实验需求，设置 激光波长、扫描速度 、分辨率等参数。
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
17
18
Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
17
18
Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
细胞膜流动性研究
总结词
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
神经元突起研究
总结词 详细描述
细胞骨架结构研究
总结词
详细描述
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜的未 来发展与挑战
技术创新与改进
分辨率提升 高速成像 多维成像
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
确的依据。
药物研发
利用激光扫描共聚焦显微镜观察 药物对细胞的作用和影响，为新
药研发提供实验支持。
生物科学研究
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 生物科学研究，探索细胞和分子
层面的生命活动规律。
实验伦理与法规
动物实验伦理 数据处理与隐私保护 法规遵循
WATCHING
激光扫描共聚焦显微 镜教学课件
• 激光扫描共聚焦显微镜简介 • 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 • 激光扫描共聚焦显微镜实验技术 • 激光扫描共聚焦显微镜实验案例 • 激光扫描共聚焦显微镜的未来发展与挑战
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜简介
定义与特点
定义 特点
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑；
01
样品选择
02 样品预处理
03 载玻片准备
显微镜设置
光源选择
物镜选择
滤色片配置 扫描速度与分辨率设置
图像采集
校准
。
采集参数设置
多区域采集 实时预览
数据分析
图像处理
共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色PPT课件
左右
➢标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本
下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发
➢尽量去除非特异性荧光信号
➢封片剂多用甘油：PBS混合液（9：1)
第16页/共23页
激光共聚焦适用的器皿及要
求
第17页/共23页
一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）
（1）将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦
培养皿中间的圆形凹槽里；
（2）染色前吸除培养皿的培养液，用PBS洗2-3
次；
（3）向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或
Fluo-4/AM工作液200μL，使其覆盖凹槽里
全部细胞；
（4）37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育30 min；
（5）吸除染液，用PBS洗2-3次；
（6）再用800μL的PBS覆盖凹槽里全部细胞，
德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介
第1页/共23页
基本参数
➢型号：德国Leica SP5 II
➢激光器：4个 发射波长400nm-800nm
➢物镜：10倍
➢通道：多通道
20倍
63倍
多色
➢系统：windows 7＋LAS AF
➢活体细胞装置：配有
第2页/共23页
激光扫描共聚焦显微镜 的基本特点
37℃孵育60 min（避光）。
（5）染核并封片
用PBS（5min×3）冲洗后，滴加
DAPI染
核5min, PBS冲洗（5min×3），滴加
抗荧
光淬灭封片液。
（6）激光共聚焦显微镜拍照
第20页/共23页
Leica网上课程
Leica Science Lab网址：
➢标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本
下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发
➢尽量去除非特异性荧光信号
➢封片剂多用甘油：PBS混合液（9：1)
第16页/共23页
激光共聚焦适用的器皿及要
求
第17页/共23页
一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）
（1）将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦
培养皿中间的圆形凹槽里；
（2）染色前吸除培养皿的培养液，用PBS洗2-3
次；
（3）向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或
Fluo-4/AM工作液200μL，使其覆盖凹槽里
全部细胞；
（4）37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育30 min；
（5）吸除染液，用PBS洗2-3次；
（6）再用800μL的PBS覆盖凹槽里全部细胞，
德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介
第1页/共23页
基本参数
➢型号：德国Leica SP5 II
➢激光器：4个 发射波长400nm-800nm
➢物镜：10倍
➢通道：多通道
20倍
63倍
多色
➢系统：windows 7＋LAS AF
➢活体细胞装置：配有
第2页/共23页
激光扫描共聚焦显微镜 的基本特点
37℃孵育60 min（避光）。
（5）染核并封片
用PBS（5min×3）冲洗后，滴加
DAPI染
核5min, PBS冲洗（5min×3），滴加
抗荧
光淬灭封片液。
（6）激光共聚焦显微镜拍照
第20页/共23页
Leica网上课程
Leica Science Lab网址：
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
等)。
6
激光共聚焦显微成像技术的应用
单标，双标和三标图像
明场，DIC, 相差和透射光图像
出色的反射光图像
时间分辨和快速扫描动态图像
7
一.定位、定量
•免疫荧光标记（单标、双标或三
标）的定位、定量
如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与
共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化
2
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
Objective
F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
14
四.细胞膜电位的测量
标记膜电位探针(慢反应）：
JC1
510nm
530/590nm
Dioc5(3)
548nm
573nm
Dioc6(3)
484nm
快反应探针：
500nm
Di-4-ANEPPS 496nm
703nm
Di-4-ANEPPS 498nm
•细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
•荧光原位杂交： 染色体基因定位
•单细胞凝胶电泳
•GFP的表达
•活细胞或活体组织静息游离Ca2+ 的分布与定量
•活细胞内pH的定量、膜电位的测量
•活细胞内自由基水平的定量
8
Immuno-fluorecence label
Time
Recovery of fluorescence
Zero time
Hale Waihona Puke 10 secondsFRAP( Fluorescence recovery after photobleaching)原理
30 seconds
16
荧光光漂白后的回复：FRAP 生物膜脂质分子的侧向扩散； 胞间通讯的研究； 胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等 细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。
40.00
20.00
0.00
200.00
Physiology Chart (Time: 11:40:49)
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
•程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间
•序列的扫描测量
10
显微CT与三维重组
11
3D reconstruction
12
三.动态测量
游离Ca2+, Mg2+、K+、Na+测量
pH值的检测 •自由基的检测
13
•相对 测量
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00
200.00
Channel 2
Int.
80.00
60.00
• 荧光显微镜的缺点:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的 同时采集
2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作. 5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度. 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠
5
激光共聚焦显微镜的应用
• 单、双、三,四色标记检测。 • 精确的一、二、三、四维观察。 • 高品质的荧光成像、透射成像、物体表面
反射成像。 • 静态和动态观察(CA2+,pH,膜电位,膜流动
性等)。 • 定性以及定量分析。 • 光谱扫描,ROI扫描. • 特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED
713nm
细胞膜静息膜电位：-70mV
线粒体膜电位：-150mV
以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针
15
五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after
photobleaching）
%F
Intense laser Beam
Bleaches Fluorescence
18
荧光共振能量转移（FRET）技术
生物大分子结构和功能研究
免疫分析 核酸杂交分析 蛋白质间相互作用研究
D
A
D
A
r >2R0
r <2R0
r: 分子间距离 R0: 分子间发生50%能量转移的距离
19
检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。
Hela green-中心体 red- 纺锤体
9
二.光学切片和三维重组
光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能 ，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机 图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维 效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的 空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的 关系。
激光扫描共聚焦显微技术
Laser scanning confocal microscopy
•
1
激光扫描共焦显微镜的设计特点: • 1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole • 2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共
焦点即被探测点，被探测点所在的平面为 共焦平面 • 3.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 • 4. 激光作为光源 • 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探 测多个被标记物
Emission Filter
Emission Pinhole Filter
3
人眼分辨率：
0.2mm
光学显微镜分辨率：0.25mm
电子显微镜分辨率：0.2nm
共焦显微镜分辨率：0.18mm
4
• 电子显微镜的缺点：
1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难. 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象
17
六．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer)
能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递， 或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能 量供体，能量的接受者叫能量受体。
荧光能量共振转移的条件 •两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2 •供体与受体的距离在2-7nm •供体的发射波长与受体的激发波长一致
6
激光共聚焦显微成像技术的应用
单标，双标和三标图像
明场，DIC, 相差和透射光图像
出色的反射光图像
时间分辨和快速扫描动态图像
7
一.定位、定量
•免疫荧光标记（单标、双标或三
标）的定位、定量
如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与
共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化
2
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
Objective
F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
14
四.细胞膜电位的测量
标记膜电位探针(慢反应）：
JC1
510nm
530/590nm
Dioc5(3)
548nm
573nm
Dioc6(3)
484nm
快反应探针：
500nm
Di-4-ANEPPS 496nm
703nm
Di-4-ANEPPS 498nm
•细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
•荧光原位杂交： 染色体基因定位
•单细胞凝胶电泳
•GFP的表达
•活细胞或活体组织静息游离Ca2+ 的分布与定量
•活细胞内pH的定量、膜电位的测量
•活细胞内自由基水平的定量
8
Immuno-fluorecence label
Time
Recovery of fluorescence
Zero time
Hale Waihona Puke 10 secondsFRAP( Fluorescence recovery after photobleaching)原理
30 seconds
16
荧光光漂白后的回复：FRAP 生物膜脂质分子的侧向扩散； 胞间通讯的研究； 胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等 细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。
40.00
20.00
0.00
200.00
Physiology Chart (Time: 11:40:49)
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
•程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间
•序列的扫描测量
10
显微CT与三维重组
11
3D reconstruction
12
三.动态测量
游离Ca2+, Mg2+、K+、Na+测量
pH值的检测 •自由基的检测
13
•相对 测量
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00
200.00
Channel 2
Int.
80.00
60.00
• 荧光显微镜的缺点:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的 同时采集
2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作. 5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度. 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠
5
激光共聚焦显微镜的应用
• 单、双、三,四色标记检测。 • 精确的一、二、三、四维观察。 • 高品质的荧光成像、透射成像、物体表面
反射成像。 • 静态和动态观察(CA2+,pH,膜电位,膜流动
性等)。 • 定性以及定量分析。 • 光谱扫描,ROI扫描. • 特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED
713nm
细胞膜静息膜电位：-70mV
线粒体膜电位：-150mV
以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针
15
五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after
photobleaching）
%F
Intense laser Beam
Bleaches Fluorescence
18
荧光共振能量转移（FRET）技术
生物大分子结构和功能研究
免疫分析 核酸杂交分析 蛋白质间相互作用研究
D
A
D
A
r >2R0
r <2R0
r: 分子间距离 R0: 分子间发生50%能量转移的距离
19
检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。
Hela green-中心体 red- 纺锤体
9
二.光学切片和三维重组
光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能 ，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机 图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维 效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的 空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的 关系。
激光扫描共聚焦显微技术
Laser scanning confocal microscopy
•
1
激光扫描共焦显微镜的设计特点: • 1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole • 2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共
焦点即被探测点，被探测点所在的平面为 共焦平面 • 3.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 • 4. 激光作为光源 • 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探 测多个被标记物
Emission Filter
Emission Pinhole Filter
3
人眼分辨率：
0.2mm
光学显微镜分辨率：0.25mm
电子显微镜分辨率：0.2nm
共焦显微镜分辨率：0.18mm
4
• 电子显微镜的缺点：
1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难. 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象
17
六．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer)
能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递， 或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能 量供体，能量的接受者叫能量受体。
荧光能量共振转移的条件 •两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2 •供体与受体的距离在2-7nm •供体的发射波长与受体的激发波长一致