微生物学3 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
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D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
（二）油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
实验三 油镜使用和细菌形态观察
1、显微镜油镜的使用 2、细菌形态的观察 3、革兰氏染色
一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在 油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。
二、实验材料
1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘 液、95％乙醇、复红染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜 纸
• 而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含 量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透 性增大，结晶紫—碘复合物被洗脱，复染时细胞被染 上复染剂的颜色（红色）。
（三）、实验操作
p.31，采用三区涂片法 步骤：
1、在玻片的左右端各加1滴水，用无菌接种环挑 少量金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有 金黄色葡萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻 片的中央。
三、显微镜及油镜使用原理
（一）普通光学显微镜构 造（p.23-27）
1.光学部分:接目镜 、 接物镜 、
照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等)。 它使检视物放大, 造成物象。
2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、
物镜转换器、载物台、载物台 转移器、粗调节器、细调节器 等部件。它起着支持、调节、 固定等作用。
四、细菌形态的观察
一、实验目的 进一步熟悉使用油镜观察微生物的方法，初
步认识细菌的基本形态和特殊结构特征
二、观察内容 基本形态：杆菌，球菌（注意大小、染色性、
排列） 特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜（先找到菌体，
再仔细观察特殊结构）
以画图的方式完成该实验的报告
画图注意事项：1、以圆圈表示视野 2、注意菌体大小比例合适 3、标出菌体颜色，显示典型排列方式 4、特殊结构标出菌体和特殊结构所在位置
（5）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
（6） 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片 倾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操 作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌， 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
2次即可。 染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定法。固定时尽量维持细胞原
有的形态。
注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞 形态。
（4）初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染 1--2分钟min，水洗。
wk.baidu.com
• 根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结 构差异来达到染色的目的的。
• 先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝 紫色；
• 然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复合 物，从而增强了染料与细菌的结合力。
• 然后再用乙醇脱色处理
经典法，四步法 （p.30-32）
• 由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、 壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫—碘 不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。
根据公式D=0.61λ/n·Sinα/2 ，增大分母，使得D值减 小，分辨率增大。
（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光
洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油
镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使 用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可 单手拿，更不可倾斜拿。 5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去 多余的香柏油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头； 第三遍再用干净的擦镜纸擦去多余的二甲苯。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐 蚀镜片。
1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样? 2.分析影响革兰氏染色结果的因素。
图下标示： 1、菌种：杆菌（大
肠杆菌，G-） 2、放大倍数 3、观察方法
五、革兰氏染色
（一）、实验目的
学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术
（二）、 革兰氏染色的工作原理
• 革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽 孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌 都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病 性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。
板上取一小环培养24小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌菌体于生理盐水中涂片，（分别于斜面上挑取少许 菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开， 使其分布均匀。
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取 菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚
菌体 水滴
涂片
载玻片
（2）干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。 （3）涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体。固定时通过火焰1—
2、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充 分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆 菌菌液延伸至玻片中央，与金黄色葡萄球菌混合 成含有两种细菌的混合区。
（四）、革兰氏染色的操作方法
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
无菌操作
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为：
D=0.61λ/n·Sinα/2
式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去细 胞上的残水，以免染色液被稀释。
（7）复染：用番红液染1—2min,水洗。 （8）镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先
在低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。 革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于 密集的细菌，常常呈假阳性。
（9）显微镜用毕后的处理（p.26） 油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头，但
二甲苯量不可过多！
(10)实验结果的记录： 要求在用显微 镜观察（左眼观察）的同时在实验 记录本上画下你所观察到的细菌的 形态。
3、实验报告
本实验每人做一张。 实验报告中要画图表示结果。
思考题（回答在实验报告上）
三.显微镜油镜观察操作方法
在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后 将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏 油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几 乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到 最合适的观察点。
油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭 去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏 油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净 的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
（二）油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
实验三 油镜使用和细菌形态观察
1、显微镜油镜的使用 2、细菌形态的观察 3、革兰氏染色
一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在 油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。
二、实验材料
1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘 液、95％乙醇、复红染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜 纸
• 而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含 量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透 性增大，结晶紫—碘复合物被洗脱，复染时细胞被染 上复染剂的颜色（红色）。
（三）、实验操作
p.31，采用三区涂片法 步骤：
1、在玻片的左右端各加1滴水，用无菌接种环挑 少量金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有 金黄色葡萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻 片的中央。
三、显微镜及油镜使用原理
（一）普通光学显微镜构 造（p.23-27）
1.光学部分:接目镜 、 接物镜 、
照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等)。 它使检视物放大, 造成物象。
2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、
物镜转换器、载物台、载物台 转移器、粗调节器、细调节器 等部件。它起着支持、调节、 固定等作用。
四、细菌形态的观察
一、实验目的 进一步熟悉使用油镜观察微生物的方法，初
步认识细菌的基本形态和特殊结构特征
二、观察内容 基本形态：杆菌，球菌（注意大小、染色性、
排列） 特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜（先找到菌体，
再仔细观察特殊结构）
以画图的方式完成该实验的报告
画图注意事项：1、以圆圈表示视野 2、注意菌体大小比例合适 3、标出菌体颜色，显示典型排列方式 4、特殊结构标出菌体和特殊结构所在位置
（5）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
（6） 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片 倾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操 作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌， 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
2次即可。 染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定法。固定时尽量维持细胞原
有的形态。
注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞 形态。
（4）初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染 1--2分钟min，水洗。
wk.baidu.com
• 根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结 构差异来达到染色的目的的。
• 先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝 紫色；
• 然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复合 物，从而增强了染料与细菌的结合力。
• 然后再用乙醇脱色处理
经典法，四步法 （p.30-32）
• 由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、 壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫—碘 不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。
根据公式D=0.61λ/n·Sinα/2 ，增大分母，使得D值减 小，分辨率增大。
（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光
洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油
镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使 用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可 单手拿，更不可倾斜拿。 5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去 多余的香柏油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头； 第三遍再用干净的擦镜纸擦去多余的二甲苯。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐 蚀镜片。
1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样? 2.分析影响革兰氏染色结果的因素。
图下标示： 1、菌种：杆菌（大
肠杆菌，G-） 2、放大倍数 3、观察方法
五、革兰氏染色
（一）、实验目的
学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术
（二）、 革兰氏染色的工作原理
• 革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽 孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌 都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病 性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。
板上取一小环培养24小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌菌体于生理盐水中涂片，（分别于斜面上挑取少许 菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开， 使其分布均匀。
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取 菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚
菌体 水滴
涂片
载玻片
（2）干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。 （3）涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体。固定时通过火焰1—
2、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充 分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆 菌菌液延伸至玻片中央，与金黄色葡萄球菌混合 成含有两种细菌的混合区。
（四）、革兰氏染色的操作方法
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
无菌操作
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为：
D=0.61λ/n·Sinα/2
式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去细 胞上的残水，以免染色液被稀释。
（7）复染：用番红液染1—2min,水洗。 （8）镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先
在低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。 革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于 密集的细菌，常常呈假阳性。
（9）显微镜用毕后的处理（p.26） 油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头，但
二甲苯量不可过多！
(10)实验结果的记录： 要求在用显微 镜观察（左眼观察）的同时在实验 记录本上画下你所观察到的细菌的 形态。
3、实验报告
本实验每人做一张。 实验报告中要画图表示结果。
思考题（回答在实验报告上）
三.显微镜油镜观察操作方法
在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后 将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏 油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几 乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到 最合适的观察点。
油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭 去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏 油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净 的擦镜纸擦去残留的二甲苯。