微生物学3 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
微生物实验报告(微生物形态观察、分布、灭菌消毒)
微生物实验微生物实验细菌形态观察细菌分布消毒灭菌细菌形态观察一、实验目的1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护2.掌握细菌的三种形态3.掌握临床常见细菌的形态及染色4.掌握细菌的特殊结构5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点二、实验原理1. 普通光学显微镜（油镜）的使用1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰3. 根据需要调节显微镜亮度2. 普通光学显微镜的维护1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内4.做好使用记录3．微生物知识1．细菌按形态分类：球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等）杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等）螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等）2．细菌的基本结构细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体3．细菌的特殊结构荚膜：如肺炎双球菌鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。
如：变形杆菌为周毛菌菌毛芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。
原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体真核类：真菌、原生动物、显微藻类非细胞类：病毒、亚病毒5．真菌单细胞：圆形、芽生孢子。
如：酵母菌多细胞：菌丝及孢子、孢子出芽。
如：霉菌6．白假私酵母菌（白念）生物学性状：G+单细胞真菌、芽生孢子、类酵母型菌落厚膜孢子、假菌丝有助于鉴定致病性：皮肤粘膜——鹅口疮、内脏感染、CNS感染微生物学检查：直接涂片、染色后镜检——菌体、芽生孢子、假菌丝7．新型隐球菌生物学性状：圆形酵母型菌、外周有厚荚膜（比菌体大1-3倍）致病性：吸入后侵犯皮肤、粘膜等——慢性炎症和脓肿；侵袭CNS——亚急性或慢性脑膜炎微生物学检查：脑脊液离心后取沉淀、痰和脓标本直接检查；墨汁负染见出芽菌体外围有宽厚荚膜为阳性三、实验材料记号笔：1支；大镊子：1支；火柴：1盒；蜡笔：1支；试管架：1个；酒精灯：1个；接种环：1支；Olympus显微镜：1台；显微镜使用记录本：1个四、实验内容1. 观察细菌三种形态1）球菌链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌（子弹形）、脑膜炎双球菌（蚕豆形）、四联菌2）杆菌破伤风杆菌、白喉杆菌（异染颗粒）、绿脓杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌3）螺形菌弧菌——霍乱弧菌；螺菌；螺杆菌——幽门螺杆菌；弯曲菌2. 观察细菌的特殊结构芽胞、鞭毛、荚膜、异染颗粒、钩端螺旋体、幽门螺杆菌3. 绘图葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎双球菌(pneumo coccus)；脑膜炎球菌(meningococcus)；破伤风杆菌（Clostridium Tantenus）；霍乱弧菌（vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛（flagellum)；荚膜(capsule)；钩端螺旋体(leptospira)五、实验结果绘8幅细菌镜下图，已交。
实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察目的要求
二、基本原理
微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段， 个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作 为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或 细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、 平板计数法、光电比浊法等。
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类 鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下， 借助于特殊的测量工具即测微尺，包括目镜测微尺和镜台 测微尺。
实验三 细菌的芽孢染色
一、实验目的
了解芽孢染色的原理，学习并 掌握芽孢染色的制片技术
观察细菌芽孢的形态
二、实验原理
芽孢染色法的基本原理，用着色力强的染色 剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使 染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的 染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水 洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保 留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂 的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
➢培养基配制后还必须进行灭菌。灭菌和消毒是二个不同含义的名词。 消毒是指消灭病原菌或有害微生物，而灭菌则是杀死或消灭一定环境 中的所有微生物。
干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。
五、实验报告
1、结果记录：
将计数结果记录下表。A表示五个中方格中的总菌数。B稀释倍 数为102。
注:1 mL菌液总数=A/5×25×104×B=5×107×A
五、实验报告
1、思考题：
（1）在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？
（2）根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差 主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准 确？ （3）某单位要求知道一种干酵母粉的活菌存活率， 请设计1-2种可行的检测方法。
三、实验材料
微生物学3 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
（三）、实验操作
p.31，采用三区涂片法 步骤：
1、在玻片的左右端各加1滴水，用无菌接种环挑 少量金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有 金黄色葡萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻 片的中央。
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去细 胞上的残水，以免染色液被稀释。
（7）复染：用番红液染1—2min,水洗。 （8）镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先
在低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。 革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于 密集的细菌，常常呈假阳性。
图下标示： 1、菌种：杆菌（大
肠杆菌，G-） 2、放大倍数 3、观察方法
五、革兰氏染色
（一）、实验目的
学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术
（二）、 革兰氏染色的工作原理
• 革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽 孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌 都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病 性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。
四、细菌形态的观察
一、实验目的 进一步熟悉使用油镜观察微生物的方法，初
步认识细菌的基本形态和特殊结构特征
二、观察内容 基本形态：杆菌，球菌（注意大小、染色性、
排列） 特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜（先找到菌体，
再仔细观察特殊结构）
以画图的方式完成该实验的报告
画图注意事项：1、以圆圈表示视野 2、注意菌体大小比例合适 3、标出菌体颜色，显示典型排列方式 4、特殊结构标出菌体和特殊结构所在位置
优选微生物学显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取 菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚
菌体 水滴
涂片
载玻片
（2）干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。 （3）涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体。固定时通过火焰1—
根据公式D=0.61λ/n·Sinα/2 ，增大分母，使得D值减 小，分辨率增大。
（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光
洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油
镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使 用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可 单手拿，更不可倾斜拿。 5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去 多余的香柏油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头； 第三遍再用干净的擦镜纸擦去多余的二甲苯。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐 蚀镜片。
三.显微镜油镜观察操作方法
在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后 将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏 油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几 乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到 最合适的观察点。
油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭 去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏 油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净 的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
图下标示： 1、菌种：杆菌（大
肠杆菌，G-） 2、放大倍数 3、观察方法
微生物学实验教案
微生物学实验教案 TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】微生物实验教案实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察一、实验目的以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理1 显微镜油镜使用的原理（1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。
它使检视物放大, 造成物象。
（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
它起着支持、调节、固定等作用。
2显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：D=λ/2n·sin(α/2 )式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ：可见光的波长（平均μm）n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a：镜口角（即入射角）。
3油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。
四、实验方法与步骤（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
（3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。
（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
（6）绘出所观察到的细菌形态图像。
（7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
油镜的使用及细菌、真菌基本形态观察实验报告
实验二油镜的使用及细菌、真菌基本形态观察[实验目的]1、了解光学显微镜的简单构造原理、使用方法和保护要点。
熟练掌握油镜的使用方法。
2、认识细菌的基本形态和构造。
通过细菌标本片观察，进一步熟悉使用光学显微镜。
3、掌握真菌的分离培养方法，认识真菌的基本形态结构。
[实验原理]一、微生物个体微小，肉眼难以看见，必须借助显微镜才能观察到其个体形态及内部结构。
因此，显微镜是微生物学研究必不可少的工具，正是显微镜的发明使人类揭开了微生物世界的奥秘。
随着科学技术的进步及微生物研究的需要，显微镜从使用可见光源的普通光学显微镜发展到使用紫外线光源的荧光显微镜，进一步发展到用电子流代替照明光源的电子显微镜，使放大率和分辨率大大提高，为微生物学的发展提供了保障。
此外，根据不同的用途还有暗视野、相差显微镜等。
普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成。
机械系统包括有：镜座、载物台、镜臂、镜筒、物镜转换器、调节器；光学部分包括有目镜、物镜、聚光器、反光镜。
有些较好的显微镜自身带有照明装置。
在检查细菌标本，多用油镜进行。
油镜是一种放大倍数较高(95～l00倍)的物镜，一般都刻有放大倍数(如95×、100×等)和特别的标记，以便于认识。
国产镜多用油字表示，国外产品则常用“Oil”(Oil Immersion)或“HI”(Homogeneous Immersion)作记号。
油镜上也常漆有黑环或红环，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。
二、油镜的原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光量亦较少，其视野较高倍镜暗。
当油镜头与载玻片之间为空气所隔时，因为空气的折光指数与玻璃不同，故有一部分光线被折射而不能进入镜头之内，使视野更暗；若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相近的油类，如柏木油等，则光线不会因折射而损失太大，可使视野充分照明，能清楚地进行观察和检查。
三、油镜的使用方法：进行油镜检查时，应先对好光线，但不可直对阳光，采取最强亮度(升高集光器，开大光圈，调好反光镜等)。
实验一-显微镜油镜的使用和细菌形态和构造的观察
数目，不规则地堆在一起的形态
2024/4/16
2024/4/16
• ②杆菌：包括单杆菌、双杆菌、链杆菌 • 短杆菌：又称球杆菌，如大肠杆菌
• 链杆菌：注意其成链状排列，链的长短 ，菌体的外形、大小，菌端的形态，如 乳酸链杆菌、炭疽杆菌
2024/4/16
• 2、油镜的认识、使用原理和使用方法 • 油镜的认识 • 油镜的使用原理 • 晶片细小，进入的光线有限 • 光线因折射而损失 • 加入折射率相等的油，避免折射， 减少光线损失，使视野明亮
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• 油镜的使用方法 • 低倍镜对光：包括 升高聚光镜，开大光
圈，调好反光镜 • 将标本片置载物台上，在标本片上滴加
实验一 显微镜油镜的使用和细菌形 态和构造的观察
• 一、目的要求
• 1．认识细菌的基本形态和一些构造 • 2．通过细菌标本片观察，进一步熟悉光学
显微镜的使用，特别是显微镜油镜的使用 原理、使用方法及保护。
2024/4/16
二、内容
• （一）显微镜的构造和使用 • 1、显微镜的构造
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一滴香柏油 • 转换油镜头，使其侵入油滴中 • 转动粗螺旋至看到物象 • 转动细螺旋至物象清晰
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• 油镜的保护 • 油镜使用过后，用擦镜纸蘸少许二甲
苯溶解并擦拭去油渍，然后再用干净 的擦镜纸拭净镜头。
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（二）细菌的形态
• ①球菌：包括链球菌、葡萄球菌 • 链球菌：注意其链状排列，链的长短，
光镜下大肠杆菌
光镜下链杆菌
spor
芽胞
es
2024/4/16
枯草芽胞杆菌
实验一 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察本次实验主要介绍了显微镜油镜的使用以及细菌形态的观察。
显微镜是生物科学中最基本最必要的仪器，也被称为生命科学研究的窗口。
而观察细菌形态则是微生物学重要的研究内容之一，对于深入了解微生物的特性和分类十分关键。
一、显微镜油镜的使用1、准备工作在使用显微镜前，需要对仪器做一些准备工作，具体如下：（1）检查显微镜是否清洁干净。
使用棉花棒和无水酒精擦拭镜头和接口。
（2）插入镜片，拧紧螺丝。
注意，平光镜的凹面朝上。
（3）透镜的高度应调整至最高点，油镜周围涂上润滑油。
（4）在准备好玻片后，使用无菌针将样本划到玻片上。
2、操作步骤（1）将玻片插入载置物台。
调整光源，使其在镜片下方成圆形状。
（2）使用低倍放大的物镜，在载置物台下调整样本位置，然后转动焦点，调整到最清晰的位置。
（3）切换到高倍物镜。
在不移动载置物台的情况下，调整焦距直至视野内的细胞详细可见。
（4）将油镜轻轻接触载置物台上的镜片，调节光源以得到最佳观察效果。
（5）旋转调节管，使细胞从上到下等比例进入视野，观察细菌的形态、大小、数量等。
二、细菌形态的观察1、细菌分类根据细菌的细胞形态、大小、结构和移动方式等特征，可以将细菌分为不同的分类。
细菌形态既包含单细胞长条状物、圆球体等基本形态，又包括复杂的细胞、菌株组成的群体等。
常见的细菌形态有以下几种：（1）球菌（cocci）：球形或椭圆形的细胞。
（2）杆菌（bacilli）：棒状或柱状的细胞。
在实验过程中，使用显微镜观察样本，发现细菌形态上虽然存在一定的差异，但一般表现为以下情况：（1）球菌或细圆菌：呈球形，直径一般在0.5-2μm之间。
（3）螺旋菌：呈螺旋形，长度几乎无限制，直径0.5-1μm左右。
然而，即使细菌大小、形态有所不同，它们的细微结构也存在着明显的相似性，这种结构相似性在分类学上具有相当的意义。
细菌形态的观察是微生物学中非常重要的基础工作，通过观察细菌的形态、大小、数量等，能够更好地了解微生物的生长繁殖规律，对于深入研究微生物的特性、分类以及对环境的影响等方面具有非常重要的价值。
显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部分， 找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。
4.高倍镜的观察
使用高倍镜前，必须先用低倍镜观察，发现目的 物后将它移至视野正中处。 旋动转换器换高倍镜。如果高倍镜触及载玻片立 即停止旋动，这说明原来低倍镜并没有调准，目 的物并没有真正找到，必须用低倍镜重新调节。 如果高倍镜下观察目的物有点模糊，调节细准焦 螺旋，直到视野清晰。调节细准焦螺旋时要注意 旋转方向与载物台上升或下降的关系，防止镜头 与载玻片强力接触，损坏镜头或载玻片。
6. 清洁显微镜和还原显微镜
. 观察结束后，调节光源到最小再关掉电源 开关。调节粗调螺旋，使载物台下降到最 低，取下玻片。 . 把油镜转离光轴，擦镜纸擦1～2次，去油， 用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，再用擦镜纸 擦 1～2次，顺镜头直径方向擦，不要圆周 擦和来回擦。擦干净镜体，罩上防尘罩， 然后放回原处。 . 用擦油镜头的方法擦玻片。
(3) 画图时先用轻淡小点或轻线条画出轮廓，再依 照轮廓一笔画出与物象相符的线条。线条要清晰， 比例要准确。较长的线条要向顺手的方向运笔， 或把纸转动再画。同一线条粗细相同，中间不要 有断线或开叉痕迹，线条也不要涂抹。 (4) 绘出的图要正确，观察时要把混杂物、破损、 重叠等现象区别清楚，不要把这些现象绘上。
3. 数值孔径(N.A)=n×sinα/2 其意为玻片和物镜之间 的折射率（n）乘以光线投射到物镜上的最大夹角（a） 的一半的正弦。
四、实验器材
1、细菌三态装片 2、显微镜 3、香柏油 4、擦镜纸等
五、操作步骤Байду номын сангаас
1. 放置好显微镜 2. 调节光源 3. 低倍镜观察 4. 高倍镜观察 5. 油镜观察 6. 清洁和还原显微镜
显微镜油镜的使用与细菌形态观察课件
水弧菌
显微镜油镜的使用与细菌形态观察
细菌的特殊结构
破伤风杆菌 示：芽孢
炭疽芽孢杆菌 示：芽孢
肺炎链球菌 显示微：镜油荚镜膜的使用与细菌形态观伤察 寒沙门菌 示：鞭毛
菌毛和鞭毛 显微镜油镜的使用与细菌形态观察
空 霍肠 乱弯 弧曲 菌菌 鞭的 毛双
毛 菌
铜
伤
绿
寒
假
沙
单
门
胞
菌
菌
周
丛
毛
毛
菌
菌 显微镜油镜的使用与细菌形态观察
2.油镜的使用与保护
油镜原理示意图
光线从标本玻片经空气 进入镜头时，由于介质 密度不同而发生折射现 象，因此进入物镜中的 光线很少，结果视野很 暗，物像不清晰。如在 玻片上加上折光率和玻 片(n=1.52)相近的香 柏油(n＝1.515)，就可 避免光线的分散，加强 视野的亮度，获得清晰 的物像
显微镜油镜的使用与细菌形态观察
显微镜油镜的使用与细菌形态观察
5.观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个 方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应先用二 甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜 纸拭去镜头上沾有的二甲苯;
6.显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形， 集光器下降，光圈关上，关闭电源，罩上显微镜 罩
显微镜油镜的使用与细菌形态观察
• 不用时，将接物镜转开呈“八”字状，集光器下 降，罩上镜罩。对号归位。
显微镜油镜的使用与细菌形态观察
作业
• 认真书写实验报告。 • 仔细观察细菌的形态，排列及染色，绘图。 • 值日生做好值日
显微镜油镜的使用与细菌形态观察
显微镜油镜的使用与细菌形态观察
显微镜油镜的使用与细菌！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
实验一 油镜的使用及细菌形态的观察
五、实验结果
绘出各种形态细菌的图片
六、实验作业
1、使用油镜观察细菌的基本步骤？ 2、使用油镜时应注意哪些问题？ 3、香柏油起什么作用？
实验一 油镜的使用及细菌 形态的观察
一、实验目的
1、掌握油镜的工作原理及使用方法。 2、利用油镜观察并掌握各种细菌的形态
二、油镜工作实验原理
以香柏油为观察介质，微生物图像更清晰明亮。 主要有两个原因： 1、增加了视野的照明亮度。 2、香柏油为介质增加了分辨率。
1、增加了视野的照明亮度
当光线由聚光镜通过玻片与镜头之间的空气 时，由于空气与玻片的密度不同，使光线发生折 射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的 相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光 量，从而使物象更加清晰。
2、香柏油为介质增加了分辨率
显微镜的放大倍数和分辨率
放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力
D=λ/2n·sin(α/2) 式中：D——物镜分辨出物体两点间的最短距离
λ——可见光的波长（平均0.55mm) n——物镜和被检标本间介质的折射率 α——镜口角（即入射角）
单球菌
链球菌
3、细菌的基本形态
葡萄球菌
短杆菌
长杆菌
3、细菌的基本形态
链杆菌
3、细菌的基本形态
三、实验器材
1、仪器： 显微镜
2、材料： 球菌、杆菌、螺旋菌装片
3、其他 香柏油、擦镜纸、二甲苯
实验三 显微镜的使用和细胞形态的观察
四、实验步骤
（三）高倍镜观察 用细调节螺旋校正焦距使物像清晰为止，将
最适宜观察部位移至视野中心。
（四）油镜观察 1. 在玻片的标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一
滴香柏油，将油镜转至正下方，使油镜浸在油中，镜 头几乎与玻片接触，但不可压及玻片，以免损坏玻片 和镜头；
2. 将聚光器升至最高并开足光圈，用细调节螺旋调 节至物像清晰为止；
n sin θ
物镜
0.5 λ 能分辨的最小距离（D）= ————
n sin θ
数值孔径（NA）
n：玻片与物镜间介质的折射率 θ:为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和 工作距离
低倍镜
高倍镜
油镜（OI）
物镜
用香柏油取代空气的作用：
② 提高显微镜的 分辨率
肉眼分辨率一般只有 0.2mm 光学显微镜分辨率 0.2μm 电子显微镜可达 0.2nm
蘸少许镜头清洁液（或二甲苯）擦去镜头上残留的油 迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的清洁液；
3. 将显微镜各部分还原，物镜呈“八”字形降下， 放入显微镜厨。
五、实验报告
绘图表示在油镜下观察到的细菌形态和 特殊结构。
二、实验原理
物镜
低倍镜
高倍镜
油镜（OI）
镜头和玻片间以 香柏油
代替空气
物镜
用香柏油取代空气的作用：
①空当气增光加n=线视1从.野0其 照观它气大玻香明察介时于璃柏度效质，入油n=，果射折射n1=改入射角.510善空角.52
物镜
用香柏油取代空气的作用：
显微镜分辨 率示意图
物镜
0.5 λ 能分辨的最小距离（D）= ————
三、实验材料
显微镜、香柏油、镜头清洁液（二甲苯）、 擦镜纸等。
实验一、油镜的使用和细菌形态观察及革兰氏染色
油镜的使用方法和注意事项
1、用低倍镜对光。最大光圈 2、低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈 3、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 4、油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒-油镜转至正下方，在
载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头浸在油里-用粗 螺旋将镜筒缓慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使 物象清晰-观察记录。最大光圈 5、观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。 用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲 苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦 去残留在镜头上的二甲苯。 6、将显微镜各部分还原，放回箱中。
– 画图 – 文字描述
• 分析和讨论 • 思考题
实验一、显微镜油镜的使用和细菌形态的观察、 细菌的革兰氏染色
教学目标或要求：
※巩固和掌握显微镜油镜的正确使用； ※学习细菌制片和单染色技术； ※对 人 体 微 生 物 染 色 检 查 ， 初 步 建 立 无 菌 操
作的概念。 ※学习细菌的革兰氏染色方法
细菌的制片与染色
单染色 复染色
染料
多数染料都是中性有机盐。据着色基的不同可分为 以下类型：
①碱性染料（basic dye）—带正电染料。其阳离子部
分为发色基团，可与细胞中带负电的组分结合。如结晶紫 沙黄, 甲基蓝,碱性复红等。
②酸性染料（Acid dye）—带负电染料。其阴离子部
分为发色基团，可与细胞中带正电的组分结合。如刚果红、 酸性复红 等。
涂片——干燥——固定
结晶紫1min——水洗
95%乙醇脱色约10~20s——水洗
I-KI 1min——水洗
沙黄或石炭酸复红 1min——水洗
干燥——镜检
革兰氏染色注意事项
实验显微镜油浸系物镜的使用及细菌形态观察
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❖ 三 实验器材
❖ 普通光学显微镜、标准细菌片、香泊油、
❖ 擦镜纸等
❖ 四 操作步骤
❖ (一)、普通光学显微镜的构造
❖ 普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。 机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转 换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学 部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、 聚光镜（集光器）等（图1-1）。
是油浸系的使用及护理。 ❖ 2．认识细菌的基本形态和构造。
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❖ 二、油浸系的原理
❖ 使用原理是：由于香柏油与玻璃的折光率 相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。 镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可 能多的进入物镜中，避免光线通过折光率 低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能 提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰。
光线强弱可通过放大或缩小光圈升降聚光镜旋转反光镜调节加油将标本放在载物台上染色部位正对集光器的中央用标本夹固定好滴加香柏油1滴用油浸镜检查使油镜头浸入油滴中几乎与标本面接触为度然后由接目镜注视镜内同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒绝对不能下降镜筒
实验一、显微镜油浸系物镜的使用 及细菌形态观察
❖ 一.目的要求 ❖ 1．正确掌握使用及护理显微镜的方法，特别
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❖ 3.用过后应将显微镜各部复位，尤其注意 不要让接物镜对集光器，同时把集光器下 降，以免发生碰撞，然后置镜箱内锁好。
❖ 4.注意防潮，勿靠近热源及有腐蚀性的化 学药品。显微镜各零件不要任意拆卸，尤 其是光学部分，以免损坏。
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❖ 六.思考题 ❖ 显微镜油浸系的使用原理?
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❖ (四)、细菌正常形态的观察
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（6） 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片 倾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操 作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌， 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为：
D=0.61λ/n·Sinα/2
式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
2、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充 分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆 菌菌液延伸至玻片中央，与金黄色葡萄球菌混合 成含有两种细菌的混合区。
（四）、革兰氏染色的操作方法
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
无菌操作
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平
三.显微镜油镜观察操作方法
在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后 将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏 油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几 乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到 最合适的观察点。
油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭 去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏 油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净 的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样? 2.分析影响革兰氏染色结果的因素。
（9）显微镜用毕后的处理（p.26） 油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头，但
二甲苯量不可过多！
(10)实验结果的记录： 要求在用显微 镜观察（左眼观察）的同时在实验 记录本上画下你所观察到的细菌的 形态。
3、实验报告
本实验每人做一张。 实验报告中要画图表示结果。
思考题（回答在实验报告上）
• 而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含 量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透 性增大，结晶紫—碘复合物被洗脱，复染时细胞被染 上复染剂的颜色（红色）。
（三）、实验操作
p.31，采用三区涂片法 步骤：
1、在玻片的左右端各加1滴水，用无菌接种环挑 少量金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有 金黄色葡萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻 片的中央。
根据公式D=0.61λ/n·Sinα/2 ，增大分母，使得D值减 小，分辨率增大。
（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光
洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油
镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使 用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可 单手拿，更不可倾斜拿。 5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去 多余的香柏油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头； 第三遍再用干净的擦镜纸擦去多余的二甲苯。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐 蚀镜片。
图下标示： 1、菌种：杆菌（大
肠杆菌，G-） 2、放大倍数 3、观察方法
五、革兰氏染色
（一）、实验目的
学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术
（二）、 革兰氏染色的工作原理
• 革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽 孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌 都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病 性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。
三、显微镜及油镜使用原理
（一）普通光学显微镜构 造（p.23-27）
1.光学部分:接目镜 、 接物镜 、
照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等)。 它使检视物放大, 造成物象。
2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、
物镜转换器、载物台、载物台 转移器、粗调节器、细调节器 等部件。它起着支持、调节、 固定等作用。
板上取一小环培养24小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌菌体于生理盐水中涂片，（分别于斜面上挑取少许 菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开， 使其分布均匀。
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取 菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚
菌体 水滴
涂片
载玻片
（2）干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。 （3）涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体。固定时通过火焰1—
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
（二）油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
• 根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结 构差异来达到染色的目的的。
• 先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝 紫色；
• 然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复合 物，从而增强了染料与细菌的结合力。
• 然后再用乙醇脱色处理
经典法，四步法 （p.30-32）
• 由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、 壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫—碘 不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去细 胞上的残水，以免染色液被稀释。
（7）复染：用番红液染1—2min,水洗。 （8）镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先
在低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。 革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于 密集的细菌，常常呈假阳性。
实验三 油镜使用和细菌形态观察
1、显微镜油镜的使用 2、细菌形态的观察 3、革兰氏染色
一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在 油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。
二、实验材料
1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘 液、95％乙醇、复红染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜 纸
四、细菌形态的观察
一、实验目的 进一步熟悉使用油镜观察微生物的方法，初
步认识细菌的基本形态和特殊结构特征
二、观察内容 基本形态：杆菌，球菌（注意大小、染色性、
排列） 特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜（先找到菌体，
再仔细观察特殊结构）
以画图的方式完成该实验的报告
画图注意事项：1、以圆圈表示视野 2、注意菌体大小比例合适 3、标出菌体颜色，显示典型排列方式 4、必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定法。固定时尽量维持细胞原
有的形态。
注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞 形态。
（4）初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染 1--2分钟min，水洗。