亚慢性毒性试验

毒理学作业

农药2,4-滴钠盐原药为白色粉末，水溶性，表1是其对SD大鼠的急性经口试验结果，请根据表中结果，给出该农药的90天亚慢性试验的试验方案，以及如何对保证实验质量予以控制。

表1 2，4-滴钠盐原药对SD大鼠急性毒性实验结果

剂量设置高剂量为25%LD50，中剂量为12.5%, 低剂量为6.3%。

雌性LD50为584mg/kg，高剂量为146mg/kg,中剂量为73mg/kg,低剂量为37mg/kg；雄性为501mg/kg，高剂量为125mg/kg，63mg/kg,低剂量为31mg/kg。

根据GB15670《农药登记毒理学实验方法》的农药急性毒性分级标准，2，4-滴钠盐原药的LD50>500mg/kg，属于低度农药。因此试验时选择SD大鼠的LD50为584mg/kg。

农药2,4-滴钠盐原药SD大鼠亚慢性毒性试验

目的;研究喂饲农药2,4-滴钠盐原药对大鼠的亚慢性毒性。

方法：取初断乳SD大鼠80只，雌雄各半按照体重随机分为4组。将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别拌入饲料经口喂饲染毒90d。

观察：大鼠外观体征、体质量、进食情况等。在实验中期和末期采血检测检测血液学。试验末期检测血生化指标以及尿常规检查。实验结束时处死实验动物，计算脏器指数，并对主要脏器进行病理组织学观察。

1 材料和方法

1.1 受试物

农药2,4-滴钠盐原药，白色粉末，水溶性，由某地某农药公司提供。SPF级初断乳大鼠80只，雌雄各半，体质量50~100 g，由XXX实验动物研究所繁育场提供，动物合格证号为医动字第XX-XXXX号。

1.2 饲养与管理

SPF 环境条件下，同组同性别两只一笼喂养，自由进食和饮水。环境温度21～25℃，相对湿度40%～60%。严格控制昼夜交替。

1.3实验方法

试验前将雌、雄大鼠各半按体重随机分为3个剂量组和1个对照组，每组20只，将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别均匀混入饲料中制成颗粒饲料辐照灭菌后分别供高、中、低剂量组动物食用，连续每日一次喂养90d；对照组给予不加受试物的正常饲料。

1.4 观察指标

1.4.1一般情况

试验期间观察动物的一般情况包括外观体征和行为活动、粪便性状、食物摄入量及体重变化等。

1.4.2血常规

在实验中期和末期按常规方法测定血液学指标

1.4.3血液生化指标

试验末期检测血液生化指标

1.4.5尿常规检查

尿常规测定颜色、pH值、比重(SG)、尿糖(GLU)、尿蛋白，将尿液离心，并对尿中沉淀物进行镜检。

1.4.6脏器病理

解剖动物，取心、肝、脾、肺、肾、胃肠、肾上腺、胸腺、脑和卵巢、睾丸等脏器，观察大体变化并称重（胃肠除外），计算脏器指数[脏器质量/体重）×100%]。

将解剖取得的脏器福尔马林固定，常规制片，HE 染色，光学显微镜进行病理组织学检查。

1.5 统计学分析

亚慢性毒性试验结果经正态性检验后，符合正态的指标采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，否则经变换后分析。

２结果

2.1 一般状况

2.2 体重变化见表2

2.3 血常规检验结果见表3

2.4 血生化检测结果见表4

2.5 尿常规检查

2.5 脏器指数见表5

2.6 病理组织学检查

表2 2，4滴原药大鼠90 d亚慢性毒性试验体质量变化情况

表3 2，4-滴钠盐原药大鼠90 d亚慢性毒性试验血液常规检验

雄性试验前0 37 73 146

雌性试验后0 37 73 146

雄性试验后0

37

73

146

表4 2，4-滴钠盐原药大鼠90 d亚慢性毒性试验血生化检测结果

表5 脏器指数%

3.讨论

控制实验质量

1 大鼠毒理学实验中实验技术因素的质量控制

1. 1 动物临床观察指标的质量控制

在药品临床前大鼠毒理学实验研究过程中, 其临床观察指标主要包括行为活动、体质量、增质量、饲料生物利用度等，而体质量、增质量、饲料生物利用度指标均为需要统计分析的客观指标。因其贯穿于整个实验周期,数据的客观性与实验环境、给药过程中动物感受是否舒适、动物密度、动物健康状况等因素相关。在动物临床指标统计分析前控制体系中, 实验环境应选择S P F级动物实验室;每笼2只;体质量在实验前应适应环境周期≥1周; 计算饲料摄入量每日应称质量, 每周给药完毕即计算大鼠的饲料生物利用度,比较分析各组动物饲料生物利用度的统计学意义; 分析产生差异的原因,讨论差异是否与动物自发性疾病( 如大鼠自发性糖尿病会引起大鼠饲料生物利用度明显增大) 有关, 同时应排除营养因素或给药途径对动物的损伤因素; 在动物行为活动指标观察中应在每日投药过程中重点观察大鼠投药部位是否发生充血、水肿、呕血,是否发生动物争斗外伤、皮毛稀疏竖散、粪便性状改变等变化,并及时处理与药物因素无关的改变,并详细记录,认真分析。

1. 2 血液学样本的质量控制

大鼠慢性毒理学实验中血液学常规的检测项目主要有红细胞计数( R B C ) 、血红

蛋白定量( H b ) 、白细胞计数及其分类计数( WB C+D C ) 、血小板计数( P T ) 、凝血时间( C T ) ; 血清生物化学检测项目主要有天门冬氨酸氨基转移酶( A S T ) 、丙氨酸氨基转移酶( A L T ) 、碱性磷酸酶( A L P ) 、总蛋白( T P ) 、清蛋白( A L B ) 、总胆固醇( T -C H O ) 、总胆红素( T - B I L ) 、空腹血糖( G L U ) 、尿素氮( B U N ) 、肌酐( C r ) 。选择合适的血样采集法，不仅对动物损伤小、样本溶血率低、可重复采样等优势,而且使大鼠慢性毒理实验中分阶段检测药物对造血系统、生化系统的影响成为可能。

1. 3 动物病理组织标本分析前的质量控制

组织病理学检查对于判断实验动物的毒性靶器官或靶组织具有重要意义。在长期毒理学实验中有重要地位, 是评价药物毒性的重要依据。组织病理学检查对判断动物的毒性靶器官或靶组织具有重要意义。实践中使用的组织学检测前优质标本取材流程可以为: ①根据实验取材项目设计表格,需要取得脏器系数的器官或组织和其他器官或组织分别标示于一个完整的记录单元中; ②使用250 m L广口瓶贮存新鲜配制的10%甲醛溶液180 ～200 m L 备用; ③对拟取材的大鼠进行解剖分组顺序编号; ④大鼠麻醉状态下,股动脉放血致死→胸腔组织( 胸腺、心、肺) →腹腔组织( 胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、肝、脾、胰腺、肾上腺、肾、卵巢、子宫、膀胱、前列腺、睾丸、附睾) →颈、脑部组织( 甲状腺、脑、垂体、脊髓) 。其中胸腺、胰腺、肾上腺、卵巢、甲状腺、垂体、脊髓等腺体组织或微小组织应使用擦镜纸或纱布非挤压式包裹置于3. 6% ～4. 0%甲醛。这样使浸泡于甲醛溶液中的易混淆脏器在进行石蜡包埋时容易分辨,同时保证病理组织学检查中组织样本数目完整; 其他组织除大体观察有明显病灶的组织外,要求动物组织样本均取自该组织的代表区。