植物细胞及原生质体培养
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
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第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
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本章内容提要: 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法
1975年柑桔原生质体培养成功;
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现有:苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功;木本植物中柑桔最为成功。
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陈传红 制作 2007 / 5
番茄+马铃薯?
陈传红 制作 2007 / 5
3、融合方法
01
02
1、机械分离(Machanical isolation)
Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.
高度液泡化的细胞
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离(Enzymatic isolation)
双子叶外植体/培养细胞
单子叶植物胚性细胞
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体,来源方便,有明显的叶绿体,便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料,最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
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清新立春时节
什么是原生质体(Protoplast)?
1880, Hanstein:质壁分离时,能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义:去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
(三) 渗透压稳定剂
➢ 常用:甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类 等。
➢ 不同物种原生质体分离时,所需的渗透压稳定 剂也不同。
➢ 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更 为稳定。
➢ 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和 出芽,但同时也可能会抑制原生质体的分裂。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
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•马铃薯原生质体再生植株
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
四、原生质体培养过程中的遗传变异
• 适应性变异 为非遗传变异,会随着环境条件的改变丧失其变异 特征。
漂浮法 不连续梯度法
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
沉降法
• 方法:比重小的等渗溶液中,对酶解物先过滤, 再低速离心,使完整的原生质体沉降于管底。
• 渗透压调节剂:甘露醇。 • 筛网过滤:除去大的组织碎片和残渣,孔径
44~169μm,依原生质体大小来定。 • 离心:900~4500r/min。
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
(二)酶的种类、组合和酶解时间
• 草本植物:2~3种酶混合液。纤维素酶为 0.5%~3%,果胶酶为0.1%~1%。
• 木本植物 :纤维素酶同草本,果胶酶更多。 • 成熟花粉粒和四分体小孢子:除纤维素酶类和果
胶酶类外,尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质 酶,浓度为0.5%~2%。
➢ 温度: 一般为24~30℃,但不同物种间差异比较大。
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
三、原生质体再生过程
1、细胞壁再生 2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 3、植株再生
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术,用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》,供大家借鉴与参考,希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体(Protoplast)原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分,包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系,其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交,从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养(Protoplast Culture)原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养,以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合,克服远缘杂交障碍,实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合(Protoplast Fusion)原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞,可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生(Regeneration)再生是指通过培养技术,使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一,也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化(Genetic Transformation)遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内,并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分,也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术,可以将目的基因导入植物细胞内,并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养(Plant Tissue Culture)植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养,以获得再生的植物组织或细胞。
植物原生质体的培养与体细胞杂交
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第八章植物原生质体培养
一、原生质体的分离 二、原生质体的纯化 三、原生质体的培养方法 四、影响原生质体培养的因素 五、原生质体再生
原生质体: 原生质体:指脱去植物细胞壁 后裸露的、有生活力的原生质团。 后裸露的、有生活力的原生质团。 和植物正常细胞相比,除了没有细 和植物正常细胞相比, 胞壁外,具有活细胞的一切特征。 胞壁外,具有活细胞的一切特征。
封口后,离心, 封口后,离心,原生质体漂浮在上面
用吸管收集原生质体液面, 用吸管收集原生质体液面,放入液体培养基 或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次 或甘露醇悬浮洗涤原生质体 次
将原生质体悬浮在液体培养基中备用
漂浮法的优点: 漂浮法的优点:原生质体纯度高。 缺点:原生质体收率低。 缺点:
3、不连续梯度法 、
(2)酶分离法 )
两步法: 两步法:
果胶酶处理材料
优点:
所获得的原生质 体均匀一致、 体均匀一致、质 量好; 量好;
游离出单细胞
纤维素酶处理单细胞
缺点:
操作复杂, 操作复杂,已被 淘汰。 淘汰。
分离出原生质体
一步法
外植体
酶液配制:注意纤维素酶、 酶液配制:注意纤维素酶、果胶酶和渗 透压稳定剂(甘露醇)的配比及pH 透压稳定剂(甘露醇)的配比及 酶液离心 过滤灭菌后-20℃ 过滤灭菌后 ℃保存 外植体放入酶液, 外植体放入酶液,真空泵抽引渗透处理 26℃摇床振荡2-8小时 ℃摇床振荡 小时
3、原生质体的分离方法 、
首先对外植体进行预处理,有两种方法: 首先对外植体进行预处理,有两种方法:
低温处理:外植体放在4℃下,黑暗中1-2天。 外植体放在 ℃ 黑暗中 天 等渗溶液处理:外植体放在等渗溶液中数小时。 外植体放在等渗溶液中数小时。
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成,希望大家下载以后,能够帮助大家解决实际的问题。
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植物原生质体培养名词解释
植物原生质体培养名词解释嘿,朋友们!今天咱来唠唠植物原生质体培养这档子事儿。
你说这植物原生质体培养啊,就好比是给植物来一场特别的“变身之旅”。
植物细胞大家都知道吧,就像一个小小的城堡,外面有厚厚的城墙,那就是细胞壁啦。
而原生质体呢,就是去掉了这层城墙之后的精华部分。
想象一下,植物就像是一个有好多宝贝的大箱子,细胞壁就是那箱子的外壳。
咱们把外壳去掉,不就能更直接地接触到里面的宝贝啦?原生质体培养就是这么个道理呀。
这原生质体培养有啥用呢?用处可大啦!它能让我们更好地了解植物的秘密呀。
比如说,我们可以通过培养原生质体,看看植物是怎么生长发育的,就像看着一个小娃娃一点点长大一样。
而且啊,这还能帮我们培育出更好的品种呢!就好像是给植物来个大改造,让它们变得更厉害、更优秀。
培养原生质体可不是一件容易的事儿啊,就跟照顾小婴儿似的,得小心翼翼的。
首先得把细胞壁去掉吧,这可得有专门的技术和方法,可不是随随便便就能做到的。
然后呢,还得给它们提供合适的环境,就像给小婴儿准备温暖的小床和充足的食物一样。
培养的过程中还可能会遇到各种各样的问题呢。
哎呀,有时候就像小孩子会生病一样,原生质体也可能会出点小状况。
这时候就得靠我们这些“植物医生”啦,得赶紧想办法解决问题,让它们能健康成长。
你说这植物原生质体培养难不难?当然难啦!但这也是它有趣的地方呀。
就好像爬山,虽然过程很辛苦,但当你爬到山顶,看到那美丽的风景时,一切都值啦!咱们研究植物原生质体培养,不就是为了让植物世界变得更美好嘛。
让那些花儿开得更艳,那些树长得更高更壮。
这多有意思呀!所以啊,朋友们,可别小瞧了这植物原生质体培养。
它就像是一把神奇的钥匙,能打开植物世界的大门,让我们看到更多的奇妙和美好。
让我们一起加油,去探索这个充满神秘和惊喜的植物原生质体培养的世界吧!怎么样,是不是很有意思呢?。
条件培养基培养法
第一 节
植物细胞培养
植物细胞培养(plant cell culture):
指对植物器官或愈伤组织上分离出来的 单细胞(或小细胞团)进行培养,形成单细无 性系或再生植物的技术。
植物细胞培养的意义:
(1)研究细胞生理代谢过程及各种影响因子;
(2)用于植物品种的改良;
(3)用于植物次生代谢物质的生产。
单细胞培养 细胞的悬浮培养
一、单细胞培养(通常以叶片为材料) (一)单细胞的分离 分离方法:机械法和酶解法。各有优缺 点。
(二)单细胞培养 对分离得到的单个细胞进行培养,诱导 其分裂增殖,形成细胞团,再通过细胞分 化形成芽、根等器官或胚状体,直到长成 完整植株的技术。 培养方法:平板培养、看护培养、微室 培养、条件培养基培养法。
(1)平板培养法:分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散纯化的细胞,经计数及稀释,接种到加 热熔化而刚冷却至35℃左右的固体培养基中充分混 匀,倾入培养皿中,石蜡密封,于25℃培养,约20 天后细胞即可生长成团。统计生长情况。
2. 培养基:
(1)固体培养基:添加琼脂等
(2) 液体培养基:不加琼脂等
第二节 植物细胞培养的应用
一、植物次生代谢产物的生产 二、突变体的选择 三、诱导多倍体 四、生产人工种子
Synthetic seeds of Mulberry and banana
(云杉) (海藻酸钙凝胶)
第三节 植物原生质体培养及细胞融合
生长过程与微生物类似,有延迟期、对数生长期、 减慢期及静止期等阶段。接种时细胞要达到一定细 胞浓度,通常为0. 25 x l06细胞/ml -0. 5 x 106细胞/ m1。
植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养:对单离的细胞进行培养的方 法。
(1)平板培养法:分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞,洗涤离心除酶,细胞浓缩物经 计数及稀释,接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀,倾入培养皿中,石蜡密 封,于25℃含5%CO2空气的培养箱中培养,细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点:
培养过程中细胞总数不断增加,一定时间后产量达 最高点,生长趋于停止。然后进行移植继代培养,其过 程表现出严格可重复周期性变化,细胞增长规律与微生 物相同,有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度,通常为0. 25 x l0‘细胞/ml 一0. 5 x 10‘细胞/m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
(四)细胞培养过程: 1. 择适宜的外植体; 2. 诱导疏松愈伤组织; 3. 选择适宜的培养基; 4. 悬浮培养; 5. 悬浮细胞的继代与选择; 6. 悬浮细胞的同步化; 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生:
1.愈伤组织的诱导: (1)取水稻种子,人工去皮后用70%酒精表面消毒2 分钟,再用2.5%次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次,按每瓶3粒接入 附加2mg/L 2,4—D、3%蔗糖、0.3%酵母提取 物的Ms固体培养基中,25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后,将从胚部长出的愈伤组织切割,并转移 到新鲜培养基上继代培养,每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖.
•植物细胞培养及原生质体培养
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备:解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。
常用的解离液包含酶类,如纤维素酶和果胶酶,它们能够分解植物细胞壁。
根据不同植物材料的特性,调整酶液的浓度和pH值,确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。
原生质体的分离与纯化:解离后,将混合液通过筛网过滤,以去除未解离的细胞碎片。
然后,将过滤后的液体转移到离心管中,以低速离心收集原生质体。
使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体,去除细胞碎片和其他杂质。
二、原生质体的培养培养基的选择与准备:原生质体的培养需要合适的培养基,通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。
培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。
培养基在使用前需要经过高压灭菌,以确保无菌条件。
原生质体的接种:将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。
对于固体培养基,可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。
对于液体培养基,则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。
接种后,培养基应保持无菌环境,并在适宜的温度和光照条件下进行培养。
培养环境的控制:原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。
一般情况下,原生质体的培养温度为2528℃,光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。
保持适宜的环境条件,有助于原生质体的生长和分化。
三、原生质体的再生诱导再生:在适宜的培养条件下,原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。
根据不同植物的需求,可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂,如细胞分裂素、赤霉素等,以促进愈伤组织或芽的形成。
转化与选择:对于转基因实验,可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。
转化后的原生质体应在选择培养基上培养,以筛选出成功转化的细胞。
选择培养基通常含有抗生素,以筛选含有抗性基因的细胞。
分化与生根:成功转化的细胞在培养基中继续生长,并开始分化为完整的植物组织。
此阶段通常需要切换到生根培养基,以促使愈伤组织或芽生根。
植物原生质体培养及细胞融合
2.染色观察
• 取一滴0.02%的FDA液与一滴原生质体悬 浮液在载玻片上混匀,25E室温染色5~ 10min。用荧光显微镜观察,激发光波长 330~500nm,活的原生质体产生黄绿色 荧光。用计数器计算存活百分率。
(二)酚藏花红染色法
• 酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性 染料,溶于水显红色并带黄色荧光,其 最大激发和射波长分别为527nm和588nm 。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈 红色,无活性的原生质体因无吸收能力 而五色。
(三)不连续梯度离心法
• 在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll 溶液,构成不同的浓度梯度,在上部滴 人1~2ml酶一原生质体混合液,在150g 下离心5min,不同比重的原生质体漂浮 在不同的浓度梯度的界面上,用吸管收 集原生质体,悬浮洗涤备用。该方法的 优点是获得的原生质体大小均匀致,纯 度高;缺点是操作繁杂,原生质体的收 率低。
(五)分离方法 • 1.机械分离法 • 但由于该方法获得的原生质体产量低, 不能满足实验需要,而且液泡化程度低 的细胞不能采用该方法,因此,机械分 离法没有得到广泛应用。 • 2.酶分离法
• 1960年,德国诺丁汉大学的Cocking首先利用 纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体 ,而且收率高、完整性好、活力强。经过数十 年的不断完善,目前酶分离法已成为植物原生 质体分离最有效的方法。 • 酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先 用果胶酶处理材料,游离出单细胞,然后再用 纤维素酶处理单细胞,分离出原生质体。其优 点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但 由于操作繁杂,目前已逐渐被淘汰。 • 一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶 溅处理材料,一步获得原生质体。因操作简便 ,目前几乎均采用该方法。
植物原生质体培养及细胞融合过程
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
(一)材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高, 但浓度不来自太高; 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同,原生质体有可能涨破或收缩, 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同,或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽, 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等,浓度约在0.40-0.80mol/L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂;
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外,酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾,
提高原生质体的稳定性植物;原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化;并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50% 53%
5%
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C,作用于天然的和结晶的纤维素,具有分解天然纤维素的作用, 还含纤维素酶CX,作用于定形的纤维素,可分解短链纤维素, 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等,
原生质体培养-课件
目的与要求
掌握植物细胞原生质体培养的意义,了解原生质 分离方法,原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植 物原生质体的培养方法及其特点,以及存活率、密度、 产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生 质体融合方法,了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植 株的鉴定方法。
具备原生质体分离、纯化基本认知,具有原生质 体培养基本能力,能够理解原生质体融合概念及方法。
一般起始密度为5000-10000个/ml,看护培养可降 低培养密度。 3、渗透压稳定剂
在原生质体培养中除用2-3%蔗糖作为稳定剂外, 还使用0.3-0.5mol/l的甘露醇。有的用葡萄糖完全或 部分取代甘露醇,效果也很高。
五、影响原生质体培养的因素
4、培养基成分 1)基本培养基:MS,B5,Nitsch、N6、KM-8P 2)碳源:葡萄糖(大多数用) 3)无机盐浓度和氮形态:无机盐浓度不宜过高,尤 其铵态氮浓度不宜过高。 4)植物生长调节剂的浓度配比:
(一)双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100
(二)测定原生质体的密度 原生质体的密度(个/ml)=(原生质体数/1区域)
×104×稀释倍数
四、影响原生质体培养的因素
1、原生质体活力 选择生长健康植株上的外植体,或分裂旺盛的愈
伤组织或悬浮细胞,在酶解处理时酶制剂浓度不要过 高。 2、原生质体起始密度
四、杂种植株的鉴定 1、形态学鉴定 2、细胞学观察 3、DNA内切图谱分析法 4、同工酶分析法
思考题: 1、说明机械分离法和酶分离法的特 点 2、原生质体纯化方法有哪些?原生 质体活力的测定方法有哪些? 3、简述原生质体五种培养方法及特 点 4、原生质体融合有哪几种方法?
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第一 节
植物细胞培养
植物细胞培养(plant cell culture):
指对植物器官或愈伤组织上分离出来的 单细胞(或小细胞团)进行培养,形成单细无 性系或再生植物的技术。
植物细胞培养的意义:
(1)研究细胞生理代谢过程及各种影响因子;
(2)用于植物品种的改良;
(1)平板培养法:分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散纯化的细胞,经计数及稀释,接种到加 热熔化而刚冷却至35℃左右的固体培养基中充分混 匀,倾入培养皿中,石蜡密封,于25℃培养,约20 天后细胞即可生长成团。统计生长情况。
培养基中加入高密度的细胞进行培养。一
定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一 些物质,使培养基条件化。这样的培养被 利用来进行某些单细胞的培养的方法。
二、细胞的悬浮培养(cell suspension culture)
是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度,
悬浮在液体培养基中进行培养的方法。
适宜于大规模培养,细胞工程产业的技术
4.原生质体活力测定
纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。 (1)根据形态待征判断其活力:原生质体呈绿色 (若来源于叶片)及圆而鼓者为活原生质体。 (2)荧光染料活体染色法:荧光素染料可自由透过 细胞膜,在细胞内被酯酶水解为荧光素,后者不能自 由透过细胞膜而滞留于细胞内,在荧光显微镜下根据 荧光强度即可判断原生质体死活。 (3)酚藏花红染色法:活原生质体能吸收呈红色, 无活性的则不能吸收而无色。
2. 培养条件:
密度: 平板培养103~104个/ml,
液体培养104~105个/ml
温度: 多数为25-28 oC, 少数16~37 oC
光照:500 lx,18h 或2800 :
l一3天即再生新细胞壁,表现为体积增加、膨大, 再由圆变椭圆。可用质壁分离法证实。也可用0. 1% ST 型或WBL型荧光增白剂染色,经前者染色,有细胞壁 者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经后者染色,有细胞壁 者发射绿色荧光。
C . 半连续培养:
是利用培养罐等装臵进行细胞大量培养的 一种方式。在半连续培养时,当培养容器内细 胞增殖到一定数量后,倒出一半细胞悬浮液于 另一培养罐等容器,再分别加入新鲜培养基继 续培养。半连续培养能够重复获得大量均一的 培养细胞供进一步利用。
(三)优良悬浮培养体系要求:
A. 悬浮培养物分散性好,细胞团较小,一般由几 十个以下的细胞组成。
(5) 植物激素: 如生长素 、赤霉素、细胞分裂素 、脱落酸;其它有油 菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素 等; (6)氨基酸类: 如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮 氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、苏 氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等; (7) 核酸及其水解物: 如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、 鸟嘌呤及胸腺嘧啶等; (8) 其它成分: 如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等.
(二)原生质体培养:
1. 培养方法: (1)固体培养:平板培养法,1. 2%琼脂。 (2)液体培养: A. 浅层培养法: 其过程是将1m1原生质体悬液臵 于直径4cm培养皿或25m1三角瓶中使成薄层后于培 养箱中培养.初期振摇1—2次,防止粘壁; B. 固液结合培养法:在混好原生质体的固体培养 基表面加一层相同成分的液体培养基进行培养。效 果较好。
(2) 与原生质体培养基相反,细胞分裂素浓度高于生长 素;
(3) 在诱导器官分化过程中,一般采用15001x左右的高 光强。诱导器官分化的温度与原生质体培养基本相同。
(三) 原生质体培养的目的:
1、利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移 植和外源物的摄取,原生质体之间可以进行融合而产生 杂种细胞(即体细胞杂交)。 2、是植物基因工程的理想受体,用外源遗传物质对植 物原生质体进行改造和转化,然后诱导分裂、分化再生 出能育的完整基因工程植株。 3、也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系 变异和植物病理学研究的有用工具。
后再播种,从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。
2. 制备原生质体的酶类:
高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素,其次为半纤维 素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种 的细胞壁组成与结构不同,木质化及次生加厚的细胞壁 不被酶消化,故选择材料和消化细胞壁的酶类是制备原 生质体关键。
常用的酶类有: A. 纤维素酶,如Onozuka R—10及RS,国内常用的为 EA3—867,其中含少量果胶酶; B. 果胶酶,如Macerozyme R—10 又叫离析酶,主要含 果胶酶,活力较高,其含杂酶较多,用量不超过2%,作 用时间长有毒害作用;此外亦用Pectalyase Y—23,也叫 离析软化酶,活力极高,叶片用量一般为0.1%,悬浮 细胞为0.05%; C. 崩溃酶(Driselase),为一种粗酶制剂,具有纤维素酶 及果胶酶活性;
3.原生质体分离及纯化 (1)分离: 原生质体分离有机械法及酶消化法,
前者产量极低而不多用、后者又分一步法及二步法。
一步法是将材料在2l一28℃用纤维素酶及果胶酶 混合液一次性处理2—24h。
二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单 细胞,再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。
(2)纯化
A. 沉降法: 原生质体混合物经微孔过滤后,低速 (150g)离心5min, 沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶 液反复洗3-4次,后用培养液洗涤备用; B. 飘浮法: 离心法纯化的原生质体若含较多碎片及 少量老细胞时.可用20%蔗糖离心,原生质体浮于 液面.碎片及老细胞沉降而得以纯化,纯度高,但 产量低; C. 不连续梯度离心法:将原生质粗提液臵于不连续 浓度梯度的溶液中,经离心后分离不同比重的原生 质体。
在原生质培养过程中,胞质增加,液泡减少,叶绿 体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围.常 在1一2周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同。
4、愈伤组织或胚状体形成
原生质体再生的细胞一旦开始分裂,就可能继续 生长: A 形成细胞团,发育成愈伤组织; B. 形成胚状体,再产生植株;
C. 形成愈伤组织,再形成胚状体。
(3)用于植物次生代谢物质的生产。
单细胞培养 细胞的悬浮培养
一、单细胞培养(通常以叶片为材料) (一)单细胞的分离 分离方法:机械法和酶解法。各有优缺 点。
(二)单细胞培养 对分离得到的单个细胞进行培养,诱导 其分裂增殖,形成细胞团,再通过细胞分 化形成芽、根等器官或胚状体,直到长成 完整植株的技术。 培养方法:平板培养、看护培养、微室 培养、条件培养基培养法。
4. 培养时需供氧,培养液粘度大,不能耐受强力通风 搅拌;并具有群体效应 5. 培养细胞产物滞留于细胞内,且产量较低,培养过 程具有结构与功能全能性。
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四、 植物细胞培养的营养需求及培养基
1. 营养需求: 植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂, 除水分外,其它营养成分可分为如下几类:
(1) 无机营养: 如N、 P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I 等; (2)维生素:如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸等; (3) 碳源: 如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等; (4)天然物: 如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、 荸荠汁、生梨汁及苹果汁等;
随着细胞分裂及细胞团形成,已与常规细胞和 组织培养相同,故培养3—4周需添加含一定量低渗 稳定剂的新培养基,以满足细胞的营养,亦利于细 胞团及小愈伤组织的生长。
5. 植株再生
大多经愈伤组织诱导分化再生为完整植株。当愈伤 组织达到1—2mm时,转移至分化培养基上诱导器官分 化。分化培养基与原生质体培养基差别在于: (1) 只用蔗糖为碳源,不加渗透稳定剂;
原生质体培养包括原生质体的分离、培养、 植株再生等过程。
(一) 原生质体的制备:
1、材料来源与预处理:
(1)材料来源:
可以用各种组织和器官,但多应用叶片、 愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根 尖、子叶和胚性组织。
(2)预处理: A.预质壁分离:17-20 ℃ 酶液中静臵半小时,再于28—
34℃保温,或将材料臵于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养 1h左右,再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的;
D. 半纤维素酶,如Rhozyme HP150,用于悬浮细胞、豆 科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离;
E 蜗牛酶,主要用于体细胞原生质体分离。
酶液配制:
需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、 CaCl2· 20(0. 1mmol/l一10mo1/l)及KH2PO4 (0. 75mmol/l) 2H 等渗透稳定剂,以维持原生质体完整性。 酶液pH值相当重要,纤维素酶及果胶酶单独使用时,其 pH分别以5.4及5.8为宜;混合使用时pH5.4-pH5.6为宜,降 至4.8以下则原生质体破裂。酶液配制后需以0.45 um微孔 膜过滤除菌,而不可采用加热灭菌法。
(2)看护培养法:从悬浮培养物或脆弱愈伤组 织上用针或玻璃毛细管分离单细胞,每个细胞 放在一个方形滤纸片的上表面,而滤纸片放在 活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。
(3)微室培养法:悬浮单细胞接种于凹 玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的 固体培养基中的培养方法。
(4)条件培养基培养:条件培养基是在
2. 培养基:
(1)固体培养基:添加琼脂等
(2) 液体培养基:不加琼脂等
第二节 植物细胞培养的应用
一、植物次生代谢产物的生产 二、突变体的选择 三、诱导多倍体 四、生产人工种子
Synthetic seeds of Mulberry and banana
(云杉) (海藻酸钙凝胶)
第三节 植物原生质体培养及细胞融合