蛋白质的表达纯化共18页文档
合集下载
蛋白质的表达纯化
同时，通过蛋白质的表达和纯化，还可以进行药物作用机制的研究。例如，通过 亲和层析等技术，可以纯化出与药物结合的靶蛋白，进而分析药物的作用机制和 作用位点。这有助于深入理解药物的作用原理，为新药设计和开发提供重要依据 。
06
蛋白质的表达与纯化的挑战与 展望
高表达量和高纯度蛋白质的获得
表达量
优化基因克隆、宿主菌选择和培养条件，以提高蛋白质的表达量。
操作条件
操作过程中需要注意pH值、离子强度等参数的调节，以适 应不同蛋白质的分离需求。
亲和色谱法
1 2
原理
亲和色谱法利用生物分子之间的特异性亲和力进 行分离，如抗原-抗体、酶-底物等。
常用亲和剂
常用的亲和剂包括酶的抑制剂、免疫球蛋白、生 物素等。
3
操作条件
操作过程中需要注意亲和剂的再生和循环使用， 以提高分离效率。
生物学活性检测
通过生物学实验检测蛋白质的生物学活性，如酶活性、配体结合能 力等。
04
蛋白质的表达与纯化的影响因 素
基因的拷贝数和启动子强度
基因拷贝数
基因的拷贝数越多，蛋白质的表 达量越高。但过高的拷贝数可能 导致细胞死亡或蛋白质表达抑制 。
启动子强度
启动子是RNA聚合酶识别和结合 位点，启动子强度决定了蛋白质 的表达水平。选择合适的启动子 是蛋白质表达的关键。
蛋白质的表达纯化
目 录
• 蛋白质表达系统 • 蛋白质纯化方法 • 蛋白质的表达与纯化流程 • 蛋白质的表达与纯化的影响因素 • 蛋白质的表达与纯化的应用 • 蛋白质的表达与纯化的挑战与展望
01
蛋白质表达系统
原核表达系统
01
02
03
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌 表达系统能够高效表达外 源基因，产生大量的重组 蛋白质。
06
蛋白质的表达与纯化的挑战与 展望
高表达量和高纯度蛋白质的获得
表达量
优化基因克隆、宿主菌选择和培养条件，以提高蛋白质的表达量。
操作条件
操作过程中需要注意pH值、离子强度等参数的调节，以适 应不同蛋白质的分离需求。
亲和色谱法
1 2
原理
亲和色谱法利用生物分子之间的特异性亲和力进 行分离，如抗原-抗体、酶-底物等。
常用亲和剂
常用的亲和剂包括酶的抑制剂、免疫球蛋白、生 物素等。
3
操作条件
操作过程中需要注意亲和剂的再生和循环使用， 以提高分离效率。
生物学活性检测
通过生物学实验检测蛋白质的生物学活性，如酶活性、配体结合能 力等。
04
蛋白质的表达与纯化的影响因 素
基因的拷贝数和启动子强度
基因拷贝数
基因的拷贝数越多，蛋白质的表 达量越高。但过高的拷贝数可能 导致细胞死亡或蛋白质表达抑制 。
启动子强度
启动子是RNA聚合酶识别和结合 位点，启动子强度决定了蛋白质 的表达水平。选择合适的启动子 是蛋白质表达的关键。
蛋白质的表达纯化
目 录
• 蛋白质表达系统 • 蛋白质纯化方法 • 蛋白质的表达与纯化流程 • 蛋白质的表达与纯化的影响因素 • 蛋白质的表达与纯化的应用 • 蛋白质的表达与纯化的挑战与展望
01
蛋白质表达系统
原核表达系统
01
02
03
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌 表达系统能够高效表达外 源基因，产生大量的重组 蛋白质。
蛋白质表达纯化概述
昆虫表达系统的优缺点
• 1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确 折叠、二硫键的搭配
•
2，蛋白翻译后的加工修饰；
•
3，表达水平高，可达总蛋白量的50%；
•
4，可容纳大分子的插入片段；
•
5，能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋
白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时
由于病毒感染，细胞开始死亡。
2.3 采用什么培养基进行表达？LB,TB,SOB,SOC等等。 2.4 客户是否有Protocol、essay等参考文献 • 客户是否指定用某种纯化工艺：亲和层析、排阻层析、反向层析、疏水层析、离子交
换 2.5 表达前是否要做小量实验（预表达/预实验/小试）。是否要做表达条件的优化筛选？
如果有，需要做温度、IPTG浓度、诱导OD、抗生素浓度（不常用）、诱导时间中的哪 些优化筛选。 2.3 蛋白纯度要求、浓度要求（蛋白定量方法:分光光度法、旋光光度法等）、蛋白总量 要求。是否要去热源（又叫内毒素，常用于抗原抗体的制备以及药物的筛选。）是否 要去除RNA，是否要去除核酸，是否要去除DNA。 2.4 蛋白活性要求（如果用于抗体的制备可以不需要活性。） 2.6 蛋白WB检测：常用于真核细胞表达检测。
2.1是否需要蛋白标签 GST（常用，增加蛋白溶解性）、His（最常用，用于易表达纯化， 性质稳定的蛋白）、Strep（有I、II两种!!实验方法不同。）、Flag （Flag是一种抗体， 特异性高，表达量相对较低，常用于昆虫、哺乳动物细胞的表达）等
2.2 如果有标签，是在3‘端还是在5’端（或者是蛋白标签在N端还是C端）。需不需要 酶切位点（用于后续纯化中去除标签）。是否要进行基因突变，突变位点在哪里？
• 昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等 真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状 病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒 结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目 的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加 工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和 功能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%； 可表达非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一个感染昆虫细胞 内同时表达多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多 角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此 蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。。常用的杆状病毒包括苜蓿 银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病毒(BmNPV)，常 用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用于表达外源基因的质粒 来源于PUC系列，其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。
《蛋白表达纯化》课件
基础研究领域
用于解析蛋白质结构与功能、 探究生物过程和疾病机制等。
02
蛋白表达系统
原核表达系统
操作简便
原核表达系统通常在相对较低的 成本和较短的时间内实现蛋白表 达。
高表达量
原核细胞具有较高的繁殖速度， 因此可以快速获得大量的目标蛋 白。
原核表达系统
• 蛋白翻译后修饰少：原核细胞没有真核细胞复杂的翻译后 修饰机制，因此表达的蛋白通常不需要复杂的纯化步骤。
案例三：融合蛋白的表达与纯化
总结词
融合蛋白表达纯化的优势和应用
详细描述
融合蛋白是指将两个或多个蛋白质序列融合在一起形成的单一蛋白质。这种技术常用于 蛋白质标签、蛋白质相互作用研究、抗体药物等领域。融合蛋白的表达纯化具有一定的 复杂性，但通过选择合适的融合伙伴和优化表达纯化条件，可以获得高纯度和稳定性的
实验试剂的储存与使用
实验试剂应按照规定的要求进行储存， 避免因储存不当导致试剂变质或失效。
使用前应仔细核对试剂的名称、浓度、 使用过程中应控制试剂的用量，避免浪
有效期等信息，确保使用正确的试剂。
费和环境污染。
06
案例分析
案例一：重组蛋白的表达与纯化
总结词
重组蛋白表达纯化的基本流程和技术要点
详细描述
重组蛋白表达纯化是生物技术领域中常见的技术手段，主要涉及基因克隆、载体构建、转化、诱导表 达、纯化等步骤。其中，选择合适的载体和宿主细胞、优化表达条件以及纯化方案的制定是关键。
案例二：膜蛋白的表达与纯化
总结词
膜蛋白表达纯化的特殊技术和挑战
详细描述
膜蛋白是一类特殊的蛋白质，它们嵌入细胞膜中，具有跨膜结构域。膜蛋白的表达和纯化相对于可溶性蛋白具有 一定的难度。常用的表达系统包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。纯化时需考虑保持膜蛋白的天然状态和功能。
蛋白表达纯化学习教案
Protein G 琼脂糖凝胶
应用： 纯化抗血清或腹水中的总IgG,对人 IgG3, 小鼠 IgG1, 大鼠 IgG2a等具有高亲和力 第15页/共18页
第十六页，编辑于星期三：点 四十分。
蛋白纯化常见问题
没有出现纯化蛋白
－－纯化前将目的蛋白的表达量进行优化，确保表达量最大 －－保证蛋白在纯化过程中不降解，纯化条件低温、纯化速度快
第2页/共18页
第三页，编辑于星期三：点 四十分。
原核表达
I 重组表达载体克隆
目的基因的获取
选择载体、构建重组表达质粒
转化受体菌
重组体的筛选鉴定
1. 目的基因获取： 基因组DNA、mRNA反转录cDNA、人工合成
2. 常用载体 ： His标签： pET系列（pET28a、pET32a）、pQE系列
样品处理：
• 收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。离心，取上清。
缓冲液配制：
成分
Tris-HCl（PH 7.9）
咪唑
NaCl
Soluble Binding Buffer
20 mM
10 mM
0.5 M
请使用高纯度的S试o剂lu配b制l缓e 冲E液lu，ti并o通n过B0u.4f5feµrm过滤器过滤。为避免柱2子0 被m堵M塞，建议将裂解液50进0行m离M心，或者使用0.04.55µMm过滤器过滤。
GST标签：pGEX系列 3. 构建重组质粒：
选择合适的内切酶位点、酶切、连接
4. 转化感受态细胞： 热击法转化非表达型感受态菌
5. 重组体的鉴定：
阳性抗药克隆菌落PCR
阳性抗药克隆提粒、酶切鉴定
测序
第3页/共18页
应用： 纯化抗血清或腹水中的总IgG,对人 IgG3, 小鼠 IgG1, 大鼠 IgG2a等具有高亲和力 第15页/共18页
第十六页，编辑于星期三：点 四十分。
蛋白纯化常见问题
没有出现纯化蛋白
－－纯化前将目的蛋白的表达量进行优化，确保表达量最大 －－保证蛋白在纯化过程中不降解，纯化条件低温、纯化速度快
第2页/共18页
第三页，编辑于星期三：点 四十分。
原核表达
I 重组表达载体克隆
目的基因的获取
选择载体、构建重组表达质粒
转化受体菌
重组体的筛选鉴定
1. 目的基因获取： 基因组DNA、mRNA反转录cDNA、人工合成
2. 常用载体 ： His标签： pET系列（pET28a、pET32a）、pQE系列
样品处理：
• 收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。离心，取上清。
缓冲液配制：
成分
Tris-HCl（PH 7.9）
咪唑
NaCl
Soluble Binding Buffer
20 mM
10 mM
0.5 M
请使用高纯度的S试o剂lu配b制l缓e 冲E液lu，ti并o通n过B0u.4f5feµrm过滤器过滤。为避免柱2子0 被m堵M塞，建议将裂解液50进0行m离M心，或者使用0.04.55µMm过滤器过滤。
GST标签：pGEX系列 3. 构建重组质粒：
选择合适的内切酶位点、酶切、连接
4. 转化感受态细胞： 热击法转化非表达型感受态菌
5. 重组体的鉴定：
阳性抗药克隆菌落PCR
阳性抗药克隆提粒、酶切鉴定
测序
第3页/共18页
蛋白表达及纯化ppt课件
蛋白表达及纯化
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
蛋白质的表达纯化
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
蛋白质的表达纯化
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴