种子扩大培养

需要种子就增多
目的: 为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种 子
第一节 种子制备工艺

1、固体培养法

2、液体培养法
二、种子制备工艺
实验室种子制备阶段：
琼脂斜面
固体培养基扩大培养 摇瓶液体培养
生产种子制备阶段：
种子罐扩大培养
1、实验室种子制备
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的 菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作 为种子罐的种子；这样操作简便，不易污染杂菌。
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
一般根据菌种生长特性、菌体繁殖速度以及所采用发 酵罐的容积而定。
对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应 也少。
如： 谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于 32℃培养7～10h，菌体浓度达108～109个/ml，即可接入发酵罐 作为种子。 这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
4、接种量 接种量要适中，过大或过小都会对孢子质量 产生影响， 要求：接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约 可分辨菌落

（二）、影响种子质量的因素
1、培养基 控制类似于孢子培养基 必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要 充足的氮源和生长因子。 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主 要成分相近。

2、培养温度和湿度 温度： 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。 如龟裂链霉菌在高于37˚C培养时，孢子接入 发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前， 菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生 产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。


湿度：制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量 和质量有较大影响。
一、种子质量的标准
种子质量的优劣取决于：菌种本身的遗传特 性和培养条件 作为种子的准则: 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，迟缓期短； 生理形状稳定； 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力。

种子质量优劣的判断
1，细胞或菌体 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、 颗粒等）
（2）冷藏时间


斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有 关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即 于4˚C冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始 自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在 链霉素生产中，斜面孢子在6˚ C冷藏两个月后的 发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后 降低35%。
生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌， 一般采用三级种子罐扩大培养（四级发酵） 在小型罐（5～500L）中进行实验时，通常采用直 接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可称为一级发酵。
种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并 可减少由于多次移种而带来的染菌的机会。
但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩 短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高 发酵罐的生产率。
虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但 也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体 的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
2）各级种子的移种方法
孢子悬浮液一般采用微孔接种法接种，摇瓶菌丝种子 可在火焰保护下接入种子罐。 种子罐与发酵罐间的接种方式主要采用差压法
第二节 影响种子质量的因素
蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢 子影响也不同。 水质的硬度、污染程度对生产均有影响

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原材料质量的波动，起主要作用的是其中的 无机离子含量不同
培养基氮源选择原则：
1）供生产用的孢子培养基或作为制备沙土孢 子或传代所用的培养基要用单一氮源，以保 持正产菌落类型的优势 2）作为选中或分离用的平板培养基，须采用 复杂的有机氮源，便于选择特殊代谢类型菌 落

2、培养条件 温度：

通气：
3、种龄
种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发 酵罐时的培养时间。
选择适当种龄的菌种接种十分重要 通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养液 中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。 过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、 发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，造成异常发酵的情 况。
单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，
有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色 力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况 好。
2，生化指标 种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。 培养液外观（色素、颗粒等）
3，产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种 子质量的重要指标，因为种子液中产物 生成量的多少间接反映种子的生产能力 和成熟程度。

不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的 影响
相对湿度 斜面外观


活孢子数（×108/支
16.5～19 上部稀薄，下部稠，略黄 25～36 上部薄，中部均匀，发白 40～45 一片白，孢子丰富，稍皱

1.2 2.3 5.7
3，培养时间和冷藏时间
（1）培养时间 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子， 因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段， 核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子 会导致生产能力的下降。 措施：孢子培养的时间应该控制在孢子 量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段 终止培养。
如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产生大量 孢子直接用于种子罐接种。
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以 用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶 中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 如：用灰色链霉菌生产链霉素
用卡那链霉菌生产卡那霉素
对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管 斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养 如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸
5~10 L卡氏罐 （15 °C ~20 °C ，3~5天）
对接种物的一般要求：
1）应以高产菌株中分离获得的纯系作为出发菌株。菌株纯度 高，性状稳定，不易发生变异。 2）生理活性强。
若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生长的繁殖期细胞， 菌体细胞应均匀，同步率高。以孢子为接种物，应采用易于萌 发的孢子。
生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一 级种子罐扩大培养于27℃培养40h，此时孢子发芽，长出短菌丝， 再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于27℃培养10～24h， 菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子。 这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。 一般50m3发酵罐都采用三级发酵
第五章 种子扩大培养
种子扩大培养 是指将保存在砂土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在 经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数 量和质量的纯种过程。
目前工业规模的发酵罐容积已达几十、几百甚至上千立方米； 如按5%接种量计，就需投入大量的种子；
逐级扩大
种子扩大培养的目的 工业生产规模的增大 种子的扩大培养
除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的个阶段接种量 一般均需0.5～10%的接种量。
采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖 到达高峰的时间，使产物的形成提前到来
近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰富培养基作为获得 高产的措施；有的产品采用两个种子罐接一个发酵罐的双种法。 如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%，且 达到产量高峰的时间提前。
但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、培养液 黏度增加，造成溶氧不足，从而影响产物的合成。
如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，1%接种量产酶 活最高，在0.5～4%之间虽有差别，但影响不大；如超过4%则 酶产量明显下降。
（三）影响种子质量的其他因素
必须保证生产菌种的稳定性 提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌 侵入 杂菌检验的方法： 1、种子液显微镜观察 2、肉汤或琼脂斜面接入种子液无菌试验 3、对种子液进行生化分析
为了提高孢子的萌发率，有时需采取一些特殊措施 如：
丙酮丁醇梭菌的孢子在沸水中处理90秒后在放入液体培养基 底部，可获得较高的发芽率。 有的孢子不被水浸润，浮在液体培养基表面或贴在培养容器 内壁，不形成悬液。可在培养基中加入少量无毒的表面活性剂， 帮助形成悬液。
二、生产车间种子制备
1）种子罐级数的确定
4，酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的 产量有一定的关联。
如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关 系，可通过测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量
二、影响种子质量的因素
（一）影响孢子质量的因素
1、培养基
构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用 量都会对孢子的质量造成影响 如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的 麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢 子质量均有一定影响。 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不 同，孢子质量也不同。
Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌） 原始菌种（出发菌种） 固体试管斜面（32 °C ，18~24小时）
三角瓶培养（摇床）(flask culture)
种子罐培养 Yeast：（酵母） 原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养
（27 °C ~28 °C ，3天） （25°C， 2天）
过老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶。
不同品种或同 一品种的工艺条 件不同，其菌龄 也不一样，一般 要经过多次试验， 考察其发酵罐中 产量的多少来确 定最适种龄。
嗜碱性芽孢杆菌种龄对产酶
（碱性蛋白酶）的影响
4、接种量
指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖的速度。 大多数抗生素发酵的最适接种量为7～15%，有时可增加到20 ～ 25%；而由棒状杆菌生产谷氨酸接种量只需1%