ssr引物设计

引物设计原则：

1。长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度

2。碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个

GC含量一般40-60%

GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性

GC含量太高也易于引发非特异扩增。

3。引物Tm值一般要求：55℃-65℃。

计算：

对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算

对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。

Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15

4。引物二级结构引物二聚体

尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补

发夹结构

尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。5。引物3’端引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。

6。引物5’端引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。

5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。

6。引物的内部稳定性过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。

现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。

仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。

如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。

7。引物的保守性与特异性保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别

特异性：避免非特异性扩增

PCR引物又称为寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一对，引物1和引物2。由于DNA聚合酶只能从核苷酸链的5'端到3'端进行

复制，也就是只能识别3'的尾端，而且只能把核苷酸连到已经和DNA模板互补产生的多核苷酸链上，所以引物1和2分别于双链DNA的两条链的尾部（就是末尾是3'端的那一边）结合，为那些脱氧核苷酸提供3'的末端，就相当于开了个头。然后在DNA聚合酶的作用下合成两条新链。而那段引物就成了新链的一部分。

其实在生物体内的DNA复制也是这样的一个过程，只是引物是人体自身合成的引物设计原则

* 序列选取应在基因的保守区段

* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构

* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

* Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% * 引物之间的TM相差避免超过2℃

* 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基

* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

* Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp

* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。