定量PCR原理及实验方法
定量pcr的方法
定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。
本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。
一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。
在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。
二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。
反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。
2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。
热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。
3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。
4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。
5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。
该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。
6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。
7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。
可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。
PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。
实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。
反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。
2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。
PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。
循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。
3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。
4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。
5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。
比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。
实时qPCR具有广泛的应用。
1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。
2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。
3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。
4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学和遗传学研究中的技术。
它利用荧光探针或荧光染料来实现对PCR产物的定量，从而测量样品中相应基因的拷贝数。
本文将介绍qPCR的原理、步骤以及应用。
qPCR的原理：qPCR利用PCR反应体系中的DNA聚合酶，在不断复制DNA的过程中将荧光探针或荧光染料标记的探针与靶标DNA结合，并释放荧光信号量。
PCR反应过程中，荧光强度与反应体系中的DNA 量成正比。
通过荧光信号的强度，可以在PCR反应结束后测量靶标DNA的数量。
qPCR的步骤：qPCR主要分为两个步骤：反应体系的制备和实验操作。
反应体系的制备：反应体系中主要包括模板DNA、引物和荧光探针等。
引物是两个齐端互补的DNA片段，能够在相应的温度下与模板DNA进行互补配对，从而在PCR反应中扩增目标DNA片段。
荧光探针是一种含有荧光染料和荧光猝灭剂的DNA分子，可以与PCR产物的靶标DNA结合，通过荧光信号来定量PCR产物。
实验操作：qPCR的实验操作包括PCR反应的设置和荧光信号的测量。
在PCR 反应中，引物和荧光探针与模板DNA结合，通过PCR反应体系中的DNA聚合酶进行扩增。
在PCR反应结束后，通过荧光信号的测量来定量PCR产物。
荧光信号可以通过实时荧光定量PCR仪器进行测量。
qPCR的应用：qPCR在分子生物学和遗传学研究中有着广泛的应用。
例如：1.基因表达分析：qPCR可以对特定基因的表达进行定量，从而研究基因的表达模式和变化。
2.病毒和微生物检测：qPCR可以检测病毒和微生物的DNA/RNA，从而进行快速和准确的病原体检测。
3.遗传疾病的诊断：qPCR可以检测遗传疾病相关基因的突变和拷贝数变化，从而进行遗传疾病的诊断。
4.转基因生物检测：qPCR可以对转基因生物中外源基因的拷贝数进行检测，从而进行转基因生物的鉴定和检测。
qPCR是一种快速、准确、可重复的分子生物学技术，广泛应用于遗传学、生物医学、环境科学和农业等领域。
PCR定量方法概述
PCR定量方法概述PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学研究中的技术，可通过扩增特定DNA片段数量来进行定量分析。
PCR定量方法的发展使得我们能够更加准确、快速地测量和定量目标DNA序列或基因表达水平。
本文将概述PCR定量方法的原理、步骤和应用。
一、PCR定量方法的原理PCR定量方法是基于PCR技术的扩增效率与起始模板浓度成正比的原理。
在PCR反应中，模板DNA以指数级倍增，而每个PCR周期后，扩增效率会逐渐降低。
通过确定PCR周期数和目标序列浓度之间的关系，可以利用定标曲线或计算方法来定量目标DNA的起始浓度。
二、PCR定量方法的步骤1. DNA提取：从样本（如细胞、组织或血液）中提取DNA，并纯化得到高质量的模板DNA。
2. 靶序列选择：根据需要定量的目标序列，设计引物和探针，保证其特异性和高效性。
3. PCR反应设置：根据目标序列的长度和特性，确定PCR反应体系中的引物和探针的浓度，优化反应条件（如温度和时间）。
4. 制备标准曲线：通过系列稀释的已知浓度的标准品，构建定标曲线，用于后续定量计算。
5. PCR扩增：将模板DNA与引物和探针加入PCR反应体系中，进行一系列PCR循环，扩增目标序列。
6. 实时监测：利用实时荧光PCR仪或其他检测方法，监测PCR反应过程中探针的荧光信号强度。
7. 数据分析：根据定标曲线和荧光信号强度，计算出目标DNA的起始浓度。
三、PCR定量方法的应用1. 基因表达分析：通过比较不同样品中目标基因的表达水平，研究基因在生理和病理过程中的变化。
2. 病原体检测：定量PCR可用于检测和定量病原体DNA，用于快速诊断与预后评估。
3. 肿瘤检测：通过定量PCR检测肿瘤标志物，提供肿瘤早期诊断和治疗效果监测。
4. 遗传病筛查：利用PCR定量方法可以检测和定量与遗传病相关的突变或多态性位点。
5. GMO检测：定量PCR可用于识别和量化转基因生物的成分和含量。
6. 受精能力评估：通过检测精子和卵子中特定基因的数量，评估生殖健康和受精能力。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
定量PCR基本原理及方法-PPT精品文档
成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
Ampliflour Probe，LUX
定量分析
基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman
根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green
利用扩增信号的种类来分型 双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突 变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有 一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效 地扩增出来，则样本为杂合型。
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
荧光定量PCR的定量原理
PCR的理论方程： Y=x×(1+ Ev)n Real-time Chemistries
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理
前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司 黄妤
内 容
一． 荧光定量PCR基本原理 二． 荧光定量PCR标记方法 三． 荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种常用的分子生物学技术，可以快速、准确地检测和定量DNA或RNA分子。
本文将介绍荧光定量PCR实验的原理和应用。
一、实验原理1. PCR反应PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA序列的技术。
在PCR反应中，通过加热使DNA双链解旋成单链，然后利用引物（primer）与目标序列互补配对，聚合酶（polymerase）在引物的作用下沿着模板链合成新的互补链。
这个过程会不断重复，每个循环会使目标序列数量翻倍。
2. 荧光探针荧光探针是一种特殊的引物，在其5'端连接有一个荧光染料（如FAM），在3'端连接有一个荧光抑制剂（如BHQ1）。
当荧光探针与目标序列互补配对时，聚合酶可以沿着模板链合成新的互补链，并将荧光染料从抑制剂中释放出来。
这个过程会导致荧光信号强度随着PCR反应进行而逐渐增加。
3. 标准曲线为了定量PCR反应产生的荧光信号，需要建立一个标准曲线。
标准曲线是一系列已知浓度的目标序列样品，通过在PCR反应中使用不同浓度的目标序列样品，可以建立一个荧光信号强度与目标序列浓度之间的关系。
这个关系可以用于计算未知样品中目标序列的浓度。
二、实验步骤1. 样品制备将待检测的DNA或RNA提取出来，并用电泳等方法检查其质量和纯度。
将样品稀释至适当浓度，并制备好质控样品和模板对照。
2. PCR反应体系制备根据PCR反应体系所需的组分（如聚合酶、引物、dNTPs等）按比例混合，并加入模板DNA或RNA，最终制备出PCR反应混合液。
3. 荧光探针设计和合成根据目标序列设计荧光探针，并将其合成。
荧光探针需要与引物配对，共同作为PCR反应体系中的一部分。
4. PCR反应程序设置根据所选用的PCR仪器和荧光探针类型设置PCR反应程序，包括温度梯度、反应循环数、荧光信号检测时间等。
5. qPCR实验将PCR反应混合液加入PCR管或板中，放入PCR仪器中进行反应。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
定量pcr实验报告
定量pcr实验报告定量PCR实验报告引言：PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增目标DNA片段，可以在短时间内生成大量的DNA。
定量PCR是PCR的一种应用，可以精确测量目标DNA的数量。
本实验旨在使用定量PCR技术，对一种特定基因的DNA进行定量分析。
材料与方法：1. DNA样本：从人体组织中提取的DNA。
2. 基因特异性引物：设计用于扩增目标基因的引物。
3. TaqMan探针：与目标基因序列互补，携带荧光染料和荧光素。
4. 定量PCR试剂盒：包括PCR反应缓冲液、聚合酶、dNTPs等。
5. 实时荧光定量PCR仪：用于检测PCR反应过程中的荧光信号。
实验步骤：1. 样本制备：将DNA样本提取并纯化。
2. 引物设计：根据目标基因序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系制备：将PCR反应缓冲液、引物、探针、聚合酶、dNTPs和DNA样本混合。
4. PCR扩增：在热循环仪中进行PCR扩增，包括一系列的变温步骤。
5. 荧光信号检测：实时荧光定量PCR仪会在每个循环结束后检测PCR反应体系中的荧光信号。
6. 数据分析：根据荧光信号的变化，计算目标基因的相对表达量。
结果与讨论：通过实时荧光定量PCR仪检测，我们获得了PCR反应体系中的荧光信号数据。
根据这些数据，我们计算出了目标基因的相对表达量。
通过对多个样本进行定量PCR实验，我们可以比较不同样本中目标基因的表达水平。
本实验的结果表明，在不同样本中目标基因的表达水平存在差异。
这些差异可能与个体的遗传背景、环境因素以及疾病状态等有关。
通过定量PCR技术，我们可以更加准确地研究基因表达的变化，从而深入了解相关生物学过程。
定量PCR技术的优点在于其高灵敏度和高特异性。
相比于传统的PCR技术，定量PCR可以提供更加准确的结果。
此外，定量PCR还可以同时检测多个基因的表达水平，从而为生物学研究提供更多的信息。
然而，定量PCR也存在一些局限性。
首先，PCR反应的成功与否取决于引物和探针的设计。
定量PCR基本原理及方法
✓ Ct值与起始模板的关系
logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数 的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。
Y轴—Ct值
6
X—起始拷贝数的对数
✓ 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较
Excitation
R
3’
11
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
12
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
野生型 突变型 杂合型
21
利用熔解曲线检测基因突变 FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型
FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时， FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程 中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定 的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。
8
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
5’
3’
SG
Emission
SG
SG
3’
SG
5’
SG
9
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
SG
5’
3’
pcr定量实验方案
PCR定量实验方案实验目的本实验旨在通过聚合酶链式反应（PCR）定量检测目标DNA的数量。
通过PCR 定量实验，可以快速、准确地确定目标DNA的含量，为后续实验提供数据支持。
实验原理PCR定量实验基于聚合酶链式反应的基本原理，通过反复复制目标DNA序列，使其数量呈指数增加，并通过荧光信号在PCR循环的各个阶段实时监测目标DNA的增长情况。
荧光信号的强度与目标DNA的初始量成正比，从而可以定量测量目标DNA的数量。
实验步骤1.样本处理：–收集待检测样本，并提取目标DNA。
–使用核酸定量仪检测目标DNA的浓度，并计算出适当的稀释倍数。
–将目标DNA按照所需的浓度稀释，并制备出一系列不同浓度的DNA标准曲线样品。
2.PCR反应体系准备：–准备PCR反应混合液，包括模板DNA、引物、荧光探针、酶和缓冲液等。
–按照所需的PCR反应体系，按比例向反应管中加入相应的试剂，确保反应混合液的配制准确。
3.反应条件设置：–设置PCR反应的温度和时间参数，包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。
–根据目标序列的特性和引物设计，调整PCR反应的温度梯度、循环次数等参数，以实现最佳放大效果。
4.PCR反应实施：–将PCR反应混合液分装到反应管中，注意避免产生交叉污染。
–将反应管放入PCR仪中，按照设定的温度和时间参数运行PCR反应。
–实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化，记录关键点的荧光信号值。
5.数据分析：–将PCR反应过程中记录的荧光信号值绘制成实时荧光曲线图。
–根据所制备的DNA标准曲线样品，通过荧光信号值反推目标DNA的初始量。
–根据目标DNA的初始量和稀释倍数，计算样本中目标DNA 的浓度。
实验注意事项1.实验操作前，准备好PCR反应所需的所有试剂和设备，并保持反应管和工作台的清洁。
2.操作过程中，注意避免产生交叉污染，尤其是在样本处理和PCR反应准备阶段。
3.严格按照PCR反应体系准备说明书中的比例和操作要求进行试剂的配制和混合。
定量PCR基本原理
定量PCR基本原理定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于测定DNA样品中特定序列的数量的技术。
它是通过扩增目标DNA序列并将其与已知浓度的标准样品进行比较来实现的。
以下是定量PCR的基本原理。
1.反应组分准备：在定量PCR中，需要准备一系列的反应组分，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液。
引物是专门设计用于扩增目标序列的短片段DNA，它们会在PCR反应中与DNA模板结合并使其扩增。
酶是一种聚合酶，用于将单链DNA合成为双链DNA。
缓冲液用于提供适当的pH和离子浓度，以维持PCR反应的稳定性。
2.PCR反应步骤：定量PCR通常包括三个主要的温度周期：变性、退火和扩增。
-变性：在初始变性步骤中，PCR反应体系中的DNA双链会被加热至95-98°C，使其解离为两条单链DNA。
这个步骤一般持续数秒至数分钟。
-退火：在退火步骤中，PCR反应体系中的温度会降低至45-68°C，这样引物就可以与DNA模板结合起来。
引物将寻找目标DNA序列中的互补序列，并结合在其上。
这个步骤一般持续数秒至数分钟。
-扩增：在扩增步骤中，PCR反应体系中的温度会升高至64-72°C。
聚合酶会结合到DNA模板上，并在引物指导下合成新的DNA链。
这个步骤一般持续数分钟至数小时。
3. 反应过程监测：定量PCR通常通过监测反应过程中累积的产物数量来确定目标序列的浓度。
有多种检测方法可供选择，包括荧光探针、SYBR Green染料和分子质量测定。
-荧光探针：荧光探针是由一个荧光染料和一个荧光猝灭器构成的DNA探针。
当荧光探针与目标序列结合时，它会在PCR反应中被降解并释放出荧光信号。
通过监测荧光信号的强度，可以确定目标序列的浓度。
- SYBR Green染料：SYBR Green是一种荧光染料，它可以结合到所有双链DNA上。
当SYBR Green与扩增产物结合时，它会发出荧光信号。
荧光定量pcr原理和操作方法
荧光定量pcr原理和操作方法荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）是一种基于PCR技术，通过荧光信号来实时监测和定量PCR反应中的目标序列数量的方法。
本文将从原理和操作方法两个方面来详细介绍荧光定量PCR。
一、原理：荧光定量PCR的原理基于PCR反应进行，但其独特之处在于在PCR反应中引入荧光探针，通过荧光信号的实时监测来定量PCR反应中的目标序列数量。
1.引物设计：荧光定量PCR中仍需要设计引物。
引物是一对DNA片段，分别位于目标序列的上下游，用于对目标序列进行扩增。
扩增反应是由引物特异性地结合到目标序列上，并在PCR过程中进行DNA链的合成，增加DNA片段的数量。
2.荧光标记探针：与常规PCR不同的是，荧光定量PCR还需要引入荧光标记的探针。
探针是一个具有荧光标记物和荧光猝灭物（quencher）的特殊DNA片段。
探针要与目标序列上某一特定区域的序列互补，使探针与目标序列结合。
在探针结合的情况下，荧光标记物和荧光猝灭物相互靠近，导致荧光信号被猝灭。
3.荧光信号监测：荧光定量PCR在PCR反应过程中，实时检测荧光信号。
在荧光信号监测仪器的作用下，对PCR试管中的荧光强度进行连续采样。
在PCR初期，目标序列数量较少，探针与目标序列结合较少，荧光信号较小。
随着PCR反应的进行，目标序列数量增加，探针与目标序列结合增多，荧光信号增强。
通过监测PCR过程中荧光信号的变化，可以得到PCR反应过程中目标序列的实时数量。
二、操作方法：荧光定量PCR的具体操作步骤如下：1.实验室准备：准备好PCR试剂盒，包括引物、探针、聚合酶、dNTPs等。
根据实验需要，配制PCR试剂的工作液。
2.样品提取：根据实验的需要，从样本中提取出DNA模板。
如血液、组织、细胞等。
3.PCR反应体系的配制：根据实验需求和试剂盒说明书，配制PCR反应体系。
包括目标序列特异性的引物和探针，以及其他试剂如聚合酶、dNTPs等。
荧光定量pcr原理和步骤
荧光定量pcr原理和步骤荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，能够快速、准确地定量检测DNA或RNA的含量。
下面将介绍荧光定量PCR的原理和步骤。
荧光定量PCR的原理主要基于传统PCR技术和荧光探针技术的结合。
传统PCR通过不断复制DNA模板，使其数量呈指数增加，但并不能定量测定模板初始含量。
为了解决这一问题，qPCR引入了特定的荧光标记探针，该探针可与扩增产物特异性结合，通过荧光信号的增加来反映模板的初始数量。
荧光定量PCR的步骤如下：1. DNA模板制备：从待检测样本中提取DNA，并进行纯化处理，确保所得到的DNA质量较高。
2. 反应体系配置：根据实验需要，准备PCR反应液，包括DNA模板、引物（forward primer和reverse primer）、DNA聚合酶、核苷酸和缓冲液等。
3. 反应条件设定：根据引物序列的特性和所需扩增产物的长度，确定PCR反应的温度周期条件，包括退火温度、延伸时间和循环次数等。
4. 荧光探针设计：根据待检测序列的特点，设计合适的荧光探针，通常这些探针包括一个荧光染料和一个猪尾巴。
5. 温度循环程序：将配置好的PCR反应液放入热循环仪中，根据反应条件进行温度循环，使DNA发生退火、延伸和复性，并产生大量的扩增产物。
6. 荧光检测：热循环仪会不断读取PCR反应体系中荧光信号的变化，通过荧光强度来定量检测DNA的含量。
荧光信号的强度与模板DNA的初始含量成正比。
7. 数据分析：通过计算荧光信号和模板DNA的标准曲线，可以得到待检测样本中目标序列的初始含量。
8. 结果解读：根据数据分析的结果，可确定待检测样本中目标DNA的绝对或相对含量。
荧光定量PCR凭借其高度敏感和快速准确的特点，已广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传病筛查等领域。
随着技术的不断发展，荧光定量PCR将在医学诊断和疾病预测中发挥更加重要的作用。
定量pcr的原理和应用
定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。
相比传统的定性PCR，定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。
本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。
二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术，通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。
其主要原理包括：1.设计引物和探针：定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列，引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。
2.实时检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列发生特异性结合，形成荧光信号。
通过实时监测PCR产物的荧光信号强度，可以确定目标序列的起始数量。
3.标准曲线法：定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。
标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成，根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系，可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。
三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤：1.样本处理：将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化，以获得高质量的核酸模板。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特异性和相关基因信息，设计引物和荧光探针。
3.PCR反应体系的配置：根据实验需求和PCR仪器要求，配置PCR反应混合液，包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。
4.PCR反应条件的设置：确定PCR反应的温度和时间参数，包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。
5.实时荧光监测：将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中，监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
6.数据分析：利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析，绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。
四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是定量PCR的主要应用领域：1.基因表达分析：通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平，揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
实时荧光定量pcr的原理和方法
实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。
它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。
实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。
这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。
在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。
在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。
当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。
这种现象被称为荧光淬灭。
当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。
由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。
实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。
探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。
在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。
SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。
使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。
而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。
实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。
2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学的实验技术，可以对DNA或RNA目标序列进行定量分析。
本文将介绍荧光定量PCR的原理和结果分析，包括实验步骤、PCR曲线的解读以及测定目标序列的相对表达水平等。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR技术主要基于PCR的原理，即通过模板DNA的逐渐扩增，来定量分析起始模板DNA或RNA的数量。
在实验中，荧光定量PCR通常使用DNA合成酶来合成目标序列的拷贝，通过在每个扩增周期后测量荧光信号的变化，来定量反应的进程。
1.准备试剂和反应体系：包括引物、合成的目标序列等。
2.PCR反应：在热循环PCR仪中，通过一系列不同温度的循环，使模板DNA的扩增合成逐渐发生。
3.荧光信号检测：通过在每个循环后侦测荧光信号的变化，来定量PCR反应的进程和模板DNA的数量。
4.数据分析：通过荧光信号的变化来计算模板DNA或RNA的相对表达水平。
二、荧光定量PCR结果分析1.PCR曲线的解读在荧光定量PCR反应中，通常会绘制荧光信号与PCR循环数的关系图即PCR曲线。
根据PCR曲线的形状，可以得到以下几个关键结果：(1)阈值循环数（Ct）：阈值循环数是PCR曲线上荧光信号超过背景信号的循环数。
Ct值越小，目标序列的初始模板数量越多。
(2) 扩增效率（Efficiency）：扩增效率可以通过计算PCR曲线斜率的反向值得到，通常表达为百分比。
扩增效率越高，说明PCR反应的有效性越好。
(3)Ct值偏移：Ct值偏移是指实验组与对照组（如阴性对照或基准组）之间的Ct值差异。
Ct值偏移的大小可以用于计算相对表达水平。
2.相对表达水平的测定相对表达水平是指在不同实验条件下，目标序列在不同组织或细胞中的表达量相对比较和定量分析。
常用的计算方法有：(1)∆∆Ct法：通过计算实验组与对照组的相对Ct值差异来获得相对表达水平。
∆∆Ct值越大，目标序列的表达水平差异越明显。
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。
实时定量RTPCR的原理及方法
实时定量RTPCR的原理及方法一、本文概述实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的实验技术，用于检测和分析RNA样本中特定基因的表达水平。
该技术结合了反转录和聚合酶链式反应（PCR）的基本原理，通过实时监测PCR过程中产生的荧光信号，实现对基因表达量的高精度定量。
本文将对实时定量RT-PCR 的原理、实验方法以及应用进行详细的阐述，旨在为读者提供全面且深入的了解，从而能够在实际研究中灵活应用该技术，提高实验效率和准确性。
二、实时定量RT-PCR的基本原理实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在DNA扩增过程中，通过荧光信号实时监测反应产物量的变化，从而得到起始模板量的分析方法。
这种技术结合了反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个过程，使得RNA模板也能进行定量分析。
实时定量RT-PCR的基本原理可以分为三个步骤：反转录，PCR 扩增，以及实时荧光信号检测。
反转录步骤中，RNA模板在反转录酶的作用下，被转换成互补的DNA（cDNA）。
这个过程中，RNA的特异性序列被保留下来，为后续的PCR扩增提供了模板。
然后，PCR扩增步骤中，特定的DNA片段在DNA聚合酶的作用下，通过引物的引导，进行指数级的扩增。
在这个过程中，DNA的数量以2的n次方（n为循环次数）增长，从而大大提高了检测的灵敏度。
实时荧光信号检测步骤中，通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，使得在DNA扩增的每一个循环中，都能实时监测到荧光信号的变化。
这种荧光信号的变化与DNA产物的量成正比，因此可以通过实时监测荧光信号，来推算出起始模板的量。
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定量PCR原理及实验方法方法简介所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA质量评价现在RNA 定量的程序很多。
最近EMBO qPCR course(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28) 比较了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。
结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。
所以用不同的方法进行定量是不明智的。
因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
RNA质量RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。
传统的RNA 质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。
Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。
Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。
样品的RINs 在10-4之间。
10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100％准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。
这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。
设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。
探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。
扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。
如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
QRT-PCR抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin 以及IgG.是否有抑制物的评价体系：1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况3.用细菌检测临床样品的抑制4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统1.RT和PCR单一酶系统2.RT和PCR分离的酶系统3.RNA逆转录引物的选择引物主要有三种：1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难3.特异引物：最特异最灵敏的方法。
特别RNA量足够情况下建议使用此法。
PCR优化PCR优化主要有：1.引物的浓度2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程:I．靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件. RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),PrimerBank (/primerbank/index.html)Real Time PCR Primer Sets ()如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer()B.DIY的软件Primer ExpressC.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys )的服务方案,详细周到D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序:/products/probe_design.asp您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR引物设计简介DNA引物长度:15-25 个碱基GC含量:50%左右如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:<10 kcal/mol.没有连续的G/C.引物探针的保存一般遵循以下原则:正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2.输入靶序列，用BLASTn在/blast进行比对3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。
5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。
一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。
这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。
最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。
我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。
6.在RT步骤时，用(/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低7.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。
GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。
短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。
用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域量PCR除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。
还包括基因表达调控情况的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如何在一台定量PCR仪上实现的呢？下面将进行一一介绍。
利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量：用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量，首先要有一组稳定的标准品。
标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳定。
一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
以Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。
软件可在反应尚在进行时就对结果进行分析，结果随着反应的进行可实时更新，当然也可以等反应完全结束后再进行分析。
点示“Analysis”，弹出分析框，默认分析功能即为“Quantitation”，点击“Show”，软件即自动给出包括标准曲线（包括R值，R平方值，扩增效率、标准曲线公式等）、标准化的荧光曲线、各样品计算浓度（包括标准偏差、变异系数等）在内的结果。
若是使用SYBR Green I法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。
对于SYBR Green I的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。
同样，点击“Analysis”，在分析窗口中选择“Melt”，点击“Show”，自动给出分析结果。
完成了所需的分析之后，如还需给出分析结果报告，点击“Analysis”边上的“Report”选项，选择报告模板，软件自动给出报告。
利用定量技术进行基因型分析研究：常用的分析方法有两种，一种是Taqman探针法，一种为FRET探针法（又称Hyb探针），运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR仪。
Taqman探针分析基因型是以扩增信号的有无来判定，而FRET探针则根据扩增后片段熔解温度的不同来判定。
以下为用Taqman探针判断基因型的实例：这里，突变型的探针以FAM荧光素标记，野生型的探针以VIC荧光素标记，检测时分别同时检测了FAM通道和VIC通道的荧光情况。
这里，3、4号样品只在FAM通道有信号，而在VIC通道里无信号，表明这两个样品为突变型；1、2号样品在FAM通道无信号，在VIC通道有信号，表明这两个样品为野生型；而5、6号样品在两个通道都有信号，但荧光强度恰为其它样品的一半，说明这两个样品为杂合型。