第三章 分子克隆工具酶

2.1.7 位点偏爱
某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性 切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出 不同的切割效率，这种现象称作位点偏爱（site preference）。 EcoRⅠ酶切割噬菌体DNA中的5个位点时并不 是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点 切割快10倍；
2.1.8 酶切反应条件P66
2.1.4 同裂酶（isoschizomer）
来源与不同物种但能识别相同序列的限制酶称同裂酶， 但它们的切割位点可能不同。 ①同序同切酶 识别序列和切割位置都相同，如HpaⅡ与 MapⅠ识别切割位点为C↓CGG。 ②同序异切酶 KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但切 割位点不同，分别为GGTAC↓C和G↓GTACC。 ③“同功多位” 许多识别简并序列的限制酶包含了另一种 限制酶的功能。如EcoRⅠ为G↓AATTC，ApoⅠ为 R↓AATTY，后者可识别前者的序列。 ④其他 有些限制酶识别的序列有交叉，如SalⅠ位点 （G↓TCGAC），也可被AccⅠ（GT↓MKAC）和HincⅡ （GTY↓RAC）切割。
表格) (接下

常用的工具酶
主 要 功 能
(续上表格)
工具 酶 名 称
碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团 BAP or CIP 核酸外切酶III 降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基 exonuclease III 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链 核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸 nuclease Bal31 Taq DNA 聚合酶 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板， Taq DNA polymerase 从5’→3’方向合成新生的互补链 核糖核酸酶 专一性降解RNA RNase 脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase
5’----NCCC 3’----NGGG
↓ ↑
GGGN----3’ CCCN----5’ CCCN----5’ GGGN----3’
SmaI
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5’----NCCC 3’----NGGG +
平末端
产生平末端的DNA可任意连接，但连接效率较 黏性末端低。
3．限制酶产生非对称突出末端
当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的 末端是不同的，如BbvCⅠ，它的识别切割位点如 下： CC↓TCAGC GGAGT↑CG 有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几 种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如 下: GT↓AT/CGAC CATA/GC↑TG 有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任
常用的工具酶
工具酶 名称 主 要 功 能
限制性核酸内切酶 在DNA分子内部的特异性的 restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割 DNA连接酶 DNA ligase 将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体
DNA聚合酶I 通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链 DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性 多核苷酸激酶 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 DNA polymerase kinease 5’－OH末端上 反转录酶 以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链 reverse transcriptase DNA末端转移酶 将寡聚物尾巴加到了线性双链 DNA terminal Deoxynuc 或单链DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端 leatidy transferase
1．缓冲液
常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂、Mg2+、 DTT（二硫苏糖醇）以及BSA（牛血清白蛋白）。 pH 7.0-7.9（在25℃时）； Mg2+作为酶的活性中心，由MgCl2或乙酸镁提供；浓 度常为10 mmol/L；DTT浓度常为1 mmol/L。 有时缓冲液中还要加入100 g/ml BSA。 不同的酶对离子强度的要求差异很大，据此可将将限制 酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低3种类型， 离子强度以NaCl来满足，浓度分别为100 mmol/L、 50 mmol/L和0 mmol/L。
5’NNG↓AATTCNN 3’NNCTTAA↑GNN EcoRⅠ 5’NNG 3’ ＋ 3’NNCTTAA5’ 5’AATTCNN 3’ 3 ’ GNN5’
2．限制酶产生平末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产 生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoR V （GAT↓ATC）。
2．限制酶识别序列的结构
限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA两条链相对称的位置。 特例：（见下页举例） 识别序列不是对称的 识别多种序列 识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意 碱基。
CTTAA↑G TTCGA↑A 识别序列不是对称的 AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG GGC↑GAG GAGCA↑C 识别多种序列 AccⅠ GT↓MKAC，M=A或C, K=G或T 识别的序列呈间断对称 AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG GT↑CNNNGAC GANT↑C
Escherichia
Coli
Ry13
E c o RⅠ
属名 种类 株系 编号
2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和 是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少 可分为四类。 在已纯化分类的3000多种限制性内切酶 中，已发现了超过250种的特异识别序列。
表3-2 各种限制与修饰系统的比较
3 分子克隆工具酶（4学时）
概述 限制性内切核酸酶 甲基化酶（Methylase） DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ） 其他分子克隆工具酶
工具酶的定义
在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于 DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转 录等有关的各种酶系统称为工具酶。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为 “工具酶”。
AccⅠ HindⅢ EcoRⅠ
PstⅠ
限制性内切酶的活性单位
可用酶单位（unit）来描述其量的多少。 1个单位酶是指在建议使用的缓冲液及温度下， 在20l反应液中反应1 h，使1g DNA完全消 化所需的酶量。
应该记的缩写（酶切反应时用P67）：
Tris :三羟甲基氨基甲烷 BSA: 牛血清白蛋白 DTT: 二硫苏糖醇 DMSO: 二甲基亚砜
2.1.2 限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为 6个碱基。 当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在 完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出 现一个识别位点（44=256，46=4096）。 注意：识别位点存在的概率不同！
EcoRⅠ G↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
3．限制酶切割的位置
限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也 有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单 侧之别。
2.1.3 限制酶产生的末端
1．限制酶产生匹配粘端（matched end）
识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生 的末端为匹配黏端，亦即黏性末端（cohesive end）。 若在对称轴5′侧切割底物，DNA双链交错断开产生5′突 出黏性末端； 若在3′侧切割，则产生3′突出黏性末端。
MfeⅠ C↓AATTC NheⅠ G↓CTAGC BglⅡ A↓GATCT XbaⅠ
Sau3AⅠ/ MboⅠ ↓GATC
同尾酶 （isocaudamer）用途
MunI：5` - C A A T T G - 3`
3` - G T T A A C - 5`
5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5` 5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5` 5` - C A A T T C - 3` 3` - G T T A A G - 5`
2.1.5 同尾酶
许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端。这 些酶统称为同尾酶（isocaudarner）。这些酶切割 DNA得到的产物可进行互补连接。 EcoRⅠ G↓AATTC SpeⅠ A↓CTAGT T↓CTAGA BamHⅠ G↓GATCC
Ⅱ 酶分子 识别位点 切割位点 限制反应与 甲基化反应 限制作用是 否需用 ATP 内切酶与甲基化酶 分子不在一起 4-6bp, 大多数为回 文对称结构 在识别位点中或靠 近识别位点 分开的反应 No Ⅰ 三亚基双功能酶(R， M，S亚基) 非对称 无特异性，至少在识 别位点外 1000bp 互斥 Yes Ⅲ 二亚基双功能酶 5-7bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp 同时竞争 Yes
HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 ' 3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
限制性内切酶的命名P63
条目 基本原则 首字母 第2字母 第3字母 第4字母 顺序号 要点 3-4个字母组成, 方式是:属名+种名+株名+序号 取属名的第1个字母, 且大写 取种名的第1个字母, 小写 ①取种名的第2个字母, 小写; ②若种名有词头, 且已 命名过内切酶, 则取词头后的第一字母代替 若有株名, 株名则作为第4字母, 是否大小写, 根据原 来的情况而定 若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶, 则按 先后顺序冠以I、II、III,.....等
表 靠近DNA片段末端的切割效率（%）
限制酶 待测的寡核苷酸序列 CCGGTCGACCGG CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG GGAATTCC GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAG（N）14 CTGCAG（N）20 酶切活性 2h 0 0 0 10 ＞90 0 10 ＞90 0 20 h 0 0 0 75 ＞90 0 10 ＞90 0
2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification）
1.限制性内切酶的发现
1968年，Meselson从E.coli K株中分离出了第一个限制酶 Eco K，同年Linn和Aeber从 E.coli B株中分离到限制酶 Eco B。 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限 制性酶HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核 酸酶。
2.1 限制性内切酶 (restriction enzyme)
限制与修饰（Restriction and modification） 限制酶识别的序列 限制酶产生的末端 DNA末端长度对限制酶切割的影响 位点偏爱（Site preference） 酶切反应条件 星星活性（star activity） 单链 DNA 的切割 酶切位点的引入 影响酶活性的因素 酶切位点在基因组中分布的不均一性
EcoRI： 5` - G A A T T C - 3`
重新连接后的序列：
3` - C T T A A G - 5`
2.1.6 DNA末端长度对限制酶切割的影响
限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列 有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有 一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割 活性。 不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求。 在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切 位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应 在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。