第三章 分子克隆工具酶

2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification）
1.限制性内切酶的发现
1968年，Meselson从E.coli K株中分离出了第一个限制酶 Eco K，同年Linn和Aeber从 E.coli B株中分离到限制酶 Eco B。 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限 制性酶HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核 酸酶。
表格) (接下

常用的工具酶
主 要 功 能
(续上表格)
工具 酶 名 称
碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团 BAP or CIP 核酸外切酶III 降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基 exonuclease III 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链 核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸 nuclease Bal31 Taq DNA 聚合酶 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板， Taq DNA polymerase 从5’→3’方向合成新生的互补链 核糖核酸酶 专一性降解RNA RNase 脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase
2.1.2 限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为 6个碱基。 当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在 完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出 现一个识别位点（44=256，46=4096）。 注意：识别位点存在的概率不同！
2.1 限制性内切酶 (restriction enzyme)
限制与修饰（Restriction and modification） 限制酶识别的序列 限制酶产生的末端 DNA末端长度对限制酶切割的影响 位点偏爱（Site preference） 酶切反应条件 星星活性（star activity） 单链 DNA 的切割 酶切位点的引入 影响酶活性的因素 酶切位点在基因组中分布的不均一性
MfeⅠ C↓AATTC NheⅠ G↓CTAGC BglⅡ A↓GATCT XbaⅠ
Sau3AⅠ/ MboⅠ ↓GATC
同尾酶 （isocaudamer）用途
MunI：5` - C A A T T G - 3`
3` - G T T A A C - 5`
5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5` 5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5` 5` - C A A T T C - 3` 3` - G T T A A G - 5`
2．限制酶识别序列的结构
限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA两条链相对称的位置。 特例：（见下页举例） 识别序列不是对称的 识别多种序列 识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意 碱基。
CTTAA↑G TTCGA↑A 识别序列不是对称的 AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG GGC↑GAG GAGCA↑C 识别多种序列 AccⅠ GT↓MKAC，M=A或C, K=G或T 识别的序列呈间断对称 AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG GT↑CNNNGAC GANT↑C
2.1.7 位点偏爱
某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性 切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出 不同的切割效率，这种现象称作位点偏爱（site preference）。 EcoRⅠ酶切割噬菌体DNA中的5个位点时并不 是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点 切割快10倍；
2.1.8 酶切反应条件P66
Escherichia
Coli
Ry13
E c o RⅠ
属名 种类 株系 编号
2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和 是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少 可分为四类。 在已纯化分类的3000多种限制性内切酶 中，已发现了超过250种的特异识别序列。
表3-2 各种限制与修饰系统的比较
AccⅠ HindⅢ EcoRⅠ
PstⅠ
限制性内切酶的活性单位
可用酶单位（unit）来描述其量的多少。 1个单位酶是指在建议使用的缓冲液及温度下， 在20l反应液中反应1 h，使1g DNA完全消 化所需的酶量。
应该记的缩写（酶切反应时用P67）：
Tris :三羟甲基氨基甲烷 BSA: 牛血清白蛋白 DTT: 二硫苏糖醇 DMSO: 二甲基亚砜
3 分子克隆工具酶（4学时）
概述 限制性内切核酸酶 甲基化酶（Methylase） DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ） 其他分子克隆工具酶
工具酶的定义
在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于 DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转 录等有关的各种酶系统称为工具酶。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为 “工具酶”。
EcoRⅠ G↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
3．限制酶切割的位置
限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也 有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单 侧之别。
2.1.3 限制酶产生的末端
1．限制酶产生匹配粘端（matched end）
识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生 的末端为匹配黏端，亦即黏性末端（cohesive end）。 若在对称轴5′侧切割底物，DNA双链交错断开产生5′突 出黏性末端； 若在3′侧切割，则产生3′突出黏性末端。
2.1.4 同裂酶（isoschizomer）
来源与不同物种但能识别相同序列的限制酶称同裂酶， 但它们的切割位点可能不同。 ①同序同切酶 识别序列和切割位置都相同，如HpaⅡ与 MapⅠ识别切割位点为C↓CGG。 ②同序异切酶 KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但切 割位点不同，分别为GGTAC↓C和G↓GTACC。 ③“同功多位” 许多识别简并序列的限制酶包含了另一种 限制酶的功能。如EcoRⅠ为G↓AATTC，ApoⅠ为 R↓AATTY，后者可识别前者的序列。 ④其他 有些限制酶识别的序列有交叉，如SalⅠ位点 （G↓TCGAC），也可被AccⅠ（GT↓MKAC）和HincⅡ （GTY↓RAC）切割。
Ⅱ 酶分子 识别位点 切割位点 限制反应与 甲基化反应 限制作用是 否需用 ATP 内切酶与甲基化酶 分子不在一起 4-6bp, 大多数为回 文对称结构 在识别位点中或靠 近识别位点 分开的反应 No Ⅰ 三亚基双功能酶(R， M，S亚基) 非对称 无特异性，至少在识 别位点外 1000bp 互斥 Yes Ⅲ 二亚基双功能酶 5-7bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp 同时竞争 Yes
EcoRI： 5` - G A A T T C - 3`
重新连接后的序列：
3` - C T T A A G - 5`
2.1.6 DNA末端长度对限制酶切割的影响
限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列 有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有 一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割 活性。 不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求。 在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切 位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应 在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。
1．缓冲液
常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂、Mg2+、 DTT（二硫苏糖醇）以及BSA（牛血清白蛋白）。 pH 7.0-7.9（在25℃时）； Mg2+作为酶的活性中心，由MgCl2或乙酸镁提供；浓 度常为10 mmol/L；DTT浓度常为1 mmol/L。 有时缓冲液中还要加入100 g/ml BSA。 不同的酶对离子强度的要求差异很大，据此可将将限制 酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低3种类型， 离子强度以NaCl来满足，浓度分别为100 mmol/L、 50 mmol/L和0 mmol/L。
5’NNG↓AATTCNN 3’NNCTTAA↑GNN EcoRⅠ 5’NNG 3’ ＋ 3’NNCTTAA5’ 5’AATTCNN 3’ 3 ’ GNN5’
2．限制酶产生平末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产 生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoR V （GAT↓ATC）。
常用的工具酶
工具酶 名称 主 要 功 能
限制性核酸内切酶 在DNA分子内部的特异性的 restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割 DNA连接酶 DNA ligase 将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体
DNA聚合酶I 通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链 DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性 多核苷酸激酶 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 DNA polymerase kinease 5’－OH末端上 反转录酶 以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链 reverse transcriptase DNA末端转移酶 将寡聚物尾巴加到了线性双链 DNA terminal Deoxynuc 或单链DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端 leatidy transferase
2.1.5 同尾酶
许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端。这 些酶统称为同尾酶（isocaudarner）。这些酶切割 DNA得到的产物可进行互补连接。 EcoRⅠ G↓AATTC SpeⅠ A↓CTAGT T↓CTAGA BamHⅠ G↓GATCC