地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞Tea-8113的抑制作用

地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞Tea-8113

的抑制作用

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

【摘要】目的研究地鳖虫蛋白对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制作用，探索地鳖虫蛋白质的抗肿瘤活性。方法采用MTT法测定地鳖虫蛋白质对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制效果。结果地鳖虫蛋白质在体外能显著抑制人舌癌细胞Tea-8113的增殖，药物浓度0.0902 g·ml-1，药物作用72 h抑制率最高，达到92.96％，并呈现明显的药物剂量依赖关系。结论地鳖虫蛋白质有较强的体外抗肿瘤活性。

【关键词】地鳖虫活性蛋白 Tea-8113细胞 MTT法抗肿瘤活性

Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of protein of Eupolyphaga on human tongue cancer cell line Tea-8113.MethodsThe MTT assay was used to examine the proliferation inhibitory activity.ResultsThe protein of Eupolyphaga had obvious anti-proliferation activity on Tea-8113 in vitro in concentration and time dependent manners, the inhibition rate was up to 92.96％ for 0.0902 g/ml and 72

hours.ConclusionThe protein of Eupolyphaga has an obvious inhibitory effect on the proliferation of Tea-8113 in vitro. Key words： Protein of Eupolyphaga； Tea-8113 cell line； MTT assay； Antineoplasmic activity

地鳖虫Eupolyphaga sinensis Walker 又名土元，土鳖, 是《中国药典》记载的正品动物类药材，具有破瘀血、续筋骨、消肿止痛等药用功效［1］，临床主要用于治疗淤血阻滞,癥瘕积聚,跌扑损伤等症。中医处方亦用其治疗肿瘤，目前将其用于治疗消化道肿瘤的较为普遍［2］。本实验室前期工作已证实地鳖虫提取物（Extract from Eupolyphaga sinensis Walker ，EES）对肿瘤细胞有显著的细胞毒性作用［3］。为了深入探讨EES的抑瘤作用，本文以新鲜地鳖为原料,采用硫酸铵分段盐析,离子交换和SDS-PAGE电泳分析等方法，分离得到地鳖蛋白，探讨该蛋白质对舌癌Tea-8113细胞生长、增殖的影响，为EES抗肿瘤临床应用及其作用机制的深入研究提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 细胞株人舌癌Tea-8113细胞株由中山大学附属肿瘤医院细胞库提供，用含10％小牛血清、100U /ml青霉素和100 U /ml 链霉素的RPMI1640培养基，37℃，5％CO2 培养箱中，完全饱和湿度条件下培养，3～4 d 传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2 药物及试剂地鳖虫成虫（雌性）购自广州市花鸟市场，由广东工业大学生药研究室鉴定。RPMI1640培养液、小牛血清均为美国

GIBCO公司产品，MTT（噻唑兰）、二甲基亚砜、胰蛋白酶均为美国AMRESCO公司产品，超纯水自制，其余试剂均用国产分析纯。常规培养。

1.3 仪器CO2培养箱为美国SHEL LAB公司产品，倒置显微镜购自重庆奥特光学公司，超净工作台为苏净集团产品，680型酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 地鳖虫活性蛋白质（EES）的制备取200 g新鲜地鳖虫剪碎，加入200 ml预冷的0.01 mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4),匀浆，再加300 ml上述缓冲液，4℃浸提过夜，4 000 r/min 离心20 min，弃沉淀，上清用sevag法提取蛋白质，收集40%～65%饱和度盐析组分［4］，透析除盐，层析分离并收集蛋白质组分，洗脱液为含1.0 mol/L NaCl 的0.02 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液梯度洗脱,恒流泵流速为40，10 min收集1管。分别收集各蛋白峰液体，真空冷冻将蛋白质制成粉末备用。

2.2 SDS-PAGE电泳［5］采用SDS-PAGE法分析制备蛋白质组成。浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12％，考马斯亮蓝G－250染色，甲醇/冰乙酸脱色。由低标准蛋白质绘制标准曲线，测定测试样品的迁移距离，计算相对迁移率(mR)，由标准曲线求得测试样品的分子量。

2.3 地鳖虫活性蛋白对人舌癌Tea-8113细胞的体外抑制作用（MTT 法）［6］用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的Tea-8113细胞，将5.0×104／ml细胞悬液接种于96孔培养板中, 每孔100 μl，培养15 h

细胞贴壁后，分别加入PBS(阴性对照)以及终质量浓度（0.010 1，0.030 2，0.050 1，0.070 2和0.090 2 g/ml）的EES各20 μl，每组均设4个复孔。置饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养24，48，72 h, 结束前4～6 h各培养孔分别加入5mg/ml MTT 20 μl, 继续培养4 h，弃培养上清液, 每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200 μl溶解液，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度(A)值, 测定波长为490 nm , 用不含细胞培养液而同样作其他处理组作本底,校正测量值,取4孔A 值平均数,按以下公式计算抑制舌癌细胞的生长抑制率。

细胞增殖抑制率（％）=［1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD 空白组)］×100％

2.4 统计学处理统计学分析采用SPSS10.0软件，结果以±s表示。实验均重复3次。

3 结果

3.1 地鳖虫活性蛋白质（EES）的分离纯化地鳖虫经匀浆、盐析、透析得到EES粗提物，将该粗提物上DEAE-32纤维素离子交换柱层析，介质经预处理后装柱，柱预先用0．05 mol／L，pH 7．8的PBS平衡，上柱后用含1.0 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液梯度洗脱至在280 nm波长无光吸收。洗脱液出现3个蛋白峰（见图1），分别收集各峰蛋白质，经检测峰1和峰2蛋白质含量较低，峰3蛋白质含量较高。进一步对各蛋白峰进行MTT检测，蛋白峰1和蛋白峰2组分对Tea-8113细胞增殖无显著抑制作用，而蛋白峰3组分能够显著抑制肿瘤细胞的生长。