表2：标准叶绿素铜钠盐标准曲线
叶绿素铜钠盐的制备与分析检测
叶绿素铜钠盐的制备与分析检测[摘要]叶绿素类色素主要包括叶绿素及其衍生物，高等植物和藻类中包含大量的叶绿素，本文在前期提取蓝藻叶绿素的基础上，研究了叶绿素铜钠盐的制备条件并分析了其结构，结果表明：温度60℃、时间40min以上时皂化较彻底；酸化置铜ph1-2、温度50℃、时间超过60min铜化较彻底，再成盐结晶得到叶绿素铜钠盐，得率为1.91%；通过hplc、uv、lc/ms等方法，分析测试所得到的叶绿素铜钠盐并进行结构鉴定，得出cu chlorin p6为叶绿素铜钠盐主要成分，根据它的分子结构和产生的分子离子峰碎片，推测分析了其电离机理。
[关键词]叶绿素铜钠盐制备分析检测蓝藻为原核生物，又称蓝绿藻或蓝细菌。
蓝藻是所有藻类生物中最简单、最原始的一种光合放氧生物，蓝藻在地球表面从无氧的大气环境变为有氧环境过程中起了巨大的作用，蓝藻中含有丰富的藻胆蛋白、天然色素、多糖、油脂等，因此综合利用蓝藻成为近年来开发研究的热点，其中研究得最为广泛为蓝藻中的叶绿素。
叶绿素类色素主要包括叶绿素及其衍生物，高等植物和藻类中包含大量的叶绿素[1]。
叶绿素类似物中的卟啉环结构类似人体血红素结构，可促进创伤和溃疡愈合、活化细胞、抗贫血、抗菌消炎等多种活性功能，同时它也能预防心血管疾病、护肝以及抗衰老；研究表明，叶绿素能有效抑制多环芳烃类的诱变作用，对抑制癌细胞生成也有一定的效果[2]。
叶绿素衍生物也得到较为广泛的应用，如叶绿素铜钠可作食品添加剂和日用化工的染色剂[3]、脱臭剂[4]，且还可用来制造光敏剂[5]、汽油和涂料的添加剂等，叶绿素铜钠盐还可作为医药原料起到保肝、护胃、抗贫血的作用[4]，对传染性肝炎、十二指肠溃疡、慢性肾炎、胰腺炎、以及白血病等疾病有一定的疗效[6]。
本文在提取蓝藻叶绿素的基础上，研究了叶绿素铜钠盐的制备并对其结构进行了分析。
一、材料与方法（一）材料与试剂干蓝藻取自无锡某公司：新鲜蓝藻脱水后再喷雾干燥，4℃冰箱储存。
叶绿素铜钠的制备、合成与分析
叶绿素铜钠的合成、分离与分析一、实验目的：1、从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率。
2、初步研究叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件。
3、分析叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率；4、利用光谱技术对合成的叶绿素铜钠进行初步表征。
二、实验原理:叶绿素铜钠盐是一种具有很高稳定性的金属卟啉，呈墨绿色粉末，着色力强，色泽亮丽，其水溶液呈蓝绿色澄清透明液，钙离子存在时则有沉淀析出。
当其水溶液pH 值小于6 时，溶液底部出现粉末状沉淀，这是由于平面空间结构的叶绿素铜钠分子在酸性条件下易于聚集。
叶绿素铜钠盐已被国际有关卫生组织批准用于食品上，广泛应用作食品添加剂、化妆品添加剂、食品着色剂、药品等领域。
叶绿素铜钠盐可以通过叶绿素卟啉环中的镁原子被铜置换来制成。
蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。
所得的叶绿素再添加适量硫酸铜、使得叶绿素卟啉环中的镁原子被铜置换即可制得叶绿素铜钠盐。
叶绿素是一种含有卟吩环的物质，在其结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环。
卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面。
在制叶绿素铜钠过程中，叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被甲基所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：Ｃ55Ｈ72Ｏ5Ｎ4Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2 + ＣＨ3ＯＨ + Ｃ20Ｈ39ＯＨ在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸：C34H30O5N4MgNa2 + 4 H+ →C34H34O5N4 + Mg2+ + 2 Na+叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐：C34H34O5N4 + Cu2+ →C34H32O5N4Cu + 2 H+C34H32O5N4Cu + 2 NaOH = C34H30O5N4CuNa2 + 2 H2O三.实验仪器及材料：仪器：721分光光度计、PHS-2B酸度计、电子天平、PH试纸、旋转蒸生器一台、恒温加热磁力搅拌一台、搅拌子一个、烘箱、温度计、500ml蒸馏烧瓶、蒸馏装置、索氏提取器、回流冷凝管、减压过滤装置、滤纸、研钵、分液漏斗、容量瓶（10ml、100ml、250ml若干），移液管（2ml、10ml）、量筒（10ml、50ml、100ml）、吸耳球、玻璃棒、沸石、烧杯（100ml、250ml、500ml、1000ml若干）、胶头滴管等玻璃仪器。
叶绿素铜钠盐的制备研究
叶绿素铜钠盐的制备研究作者：郭海蓉王晓飞李媛媛来源：《湖北农业科学》2011年第16期摘要：以甘蔗糖厂滤泥中提取的叶绿素为原料，探索了叶绿素铜钠盐的制备条件，结果表明，叶绿素铜钠盐在５０℃下皂化６０ｍｉｎ；在ｐＨ值为４的酸性条件下铜代６０ｍｉｎ效果较好，对制得的叶绿素铜钠盐按ＧＢ３２６２－８２进行各项检测，均符合国标要求。
关键词：叶绿素铜钠盐；甘蔗糖厂；滤泥；制备中图分类号：Ｓ３９；Ｏ６２９．９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）16－3381-03ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＳｏｄｉｕｍＣｏｐｐｅｒＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎＧＵＯＨａｉ－ｒｏｎｇ，ＷＡＮＧＸｉａｏ－ｆｅｉ，ＬＩＹｕａｎ－ｙｕａｎ（ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒy ａｎｄＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３０００４，Cｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｆｉｌｔｅｒｍｕｄｆｒｏｍｓｕｇａｒｃａｎｅｍｉｌｌｗａｓｕｓｅｄａｓ the ｒａｗｍａｔｅｒｉａｌ．Ｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｆｏｒｓｏｄｉｕｍｃｏｐｐｅｒｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂｅｓｔｓａｐｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｒｅａｔｅｄａｔ５０℃ｆｏｒ６０ｍｉｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｐｐｅｒｅｘｃｈａｎｇｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎｐＨ４ｂｕｆｆｅｒ for 60 min．Ｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｏｄｉｕｍｃｏｐｐｅｒｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎｗａｓｕｐｔｏｐａｒａｆｔｅｒｅｖａｌｕａｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇ to ＧＢ３２６２－８２．Ｋｅｙｗｏｒｄs：ｓｏｄｉｕｍｃｏｐｐｅｒｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎ；ｓｕｇａｒcane ｍｉｌｌ；ｆｉｌｔｅｒｍｕｄ；ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ叶绿素铜钠盐作为一种天然水溶性安全无毒食用色素，是经过联合国粮农组织和我国食品添加剂标准委员会批准使用的色素［１］。
叶绿素铜钠盐的制备及稳定性研究_王正平
工程师园地文章编号:1002-1124(2004)09-0050-02 叶绿素铜钠盐的制备及稳定性研究王正平,单旭峰(哈尔滨工程大学化工学院,黑龙江哈尔滨150001) 摘 要:具有独特的生物活性的叶绿素铜钠盐作为天然卟啉-叶绿素的衍生物,有着广泛的用途。
本文对叶绿素铜钠盐的结构表达、制备方法及应用进行了较为翔实的论述。
关键词:叶绿素;叶绿素铜钠盐;卟啉;结构中图分类号:T Q20213 文献标识码:AStudy on prep aration and stability of chlorophyllW ANG Zheng -ping ,SH AN Xu -feng(Chem ical Engineering Institute ,Harbin Engineering University ,Harbin 150001,China ) Abstract :As the derivative of natural perphyrinchlorophyll ,chlorophyll Cu -Na salt has a special bioactivity ,it hasa extensive use.This paper summarized the contruction expression ,the preparation and application of chlorophyll Cu -Na salt.K ey w ords :chlorophyll ;chlorophyll Cu -Na salt ;porphyin ;construction收稿日期:2004-07-22作者简介:王正平(1958-),男,教授,1982年毕业于浙江大学,硕士生导师,主要从事精细化学的研究开发工作。
对植物食品中具有生物活性物质的研究表明,日益增加的水果和蔬菜消费量与心血管疾病、癌症等疾病的下降有密切的关系[1]。
叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定
单位：班级：实验操作人：实验同组人：实验地点:指导老师：实验操作时间：叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定一、实验目的1．分析叶绿素铜钠的纯度，计算产率。
2．从绿色植物中提取叶绿素并算提取率。
3．利用光谱技术对合成的叶绿素铜钠进行初步表征4．初步研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的条件二、实验原理叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的叶和绿色茎中，是植物进行光合作用的催化剂。
叶绿素难溶于水，易溶于有机溶剂。
通常说的叶绿素是指由多种含镁卟啉化合物共存的混合物，有a,b两种 R=CH 3者为a型R=CHO者为b型叶绿素一旦离开活性植物体，就很不稳定，；把叶绿素转化为叶绿素铜钠盐，就解决了上述问题。
叶绿素铜钠盐也有a，b型。
b 型中的—CHO在多步反应中易被氧化，以钠盐形式存在。
将蚕沙中萃取的叶绿素粗品（无溶剂物称糊状叶绿素），经皂化、置铜、纯化和成盐等几步后，就可得出叶绿素铜钠盐成品。
鉴别叶绿素铜钠盐的纯度要看它的吸光度（E1%1cm405nm），在规定条件下，吸光度值大，叶绿素铜钠盐含量高。
其中E1%1cm不低于568。
利用多波长分光光度法对产品叶绿素铜钠进行初步表征。
测定叶绿素铜钠质量的三项指标：吸光度比值、游离铜含量、干燥失重。
a和叶绿素b分子式如下：叶绿素与碱发生皂化反应：叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：C55H72MgN4O5 + 2 NaOHC34H30O5N4MgNa2 + CH3OH + C20H39OH在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸：C34H30O5N4MgNa2 + 4 H+C34H34O5N4 + Mg2+ + 2 Na+叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐：C34H34O5N4 + Cu2+C34H34O5N4Cu + 2 H+C34H34O5N4Cu + 2 NaOHC34H34O5N4CuNa2 + 2 H2O蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在360~700之间有2个吸收峰在波长440处有一最大吸收峰,其吸光度为114;在630处有一较小的吸收峰,其吸光度为017"在波长440的吸收峰为叶绿素铜钠盐特有,而在630处的吸收峰为叶绿素特有,叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍，所以试验中均采用440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。
叶绿素铜钠盐--美国药典
DEFINITIONChlorophyllin Copper Complex Sodium contains sodium salts of copper-chelatedchlorophyll derivatives. It contains no artificial coloring.定义：叶绿素铜钠盐为叶绿素螯合铜、钠的衍生物；不包括人工色素。
IDENTIFICATION鉴别• A. Spectrophotometry and Light-Scattering 851 (in the visible region)分光光度法—可见光区Sample solution: 10 µg/mL 样品浓度：10µg/mLMedium: pH 7.5 phosphate buffer, prepared by mixing 0.15 M dibasic sodium phosphate and 0.15 M monobasic potassium phosphate (21:4)方法：PH 7.5磷酸盐缓冲溶液：0.15mol/l磷酸氢二钠溶液与0.15mol/l磷酸二氢钾溶液（21:4）Acceptance criteria: The ratio of A405/A630 is 3.0–3.9.吸光度比值：A405/A630 =3.0-3.9OTHER COMPONENTS 其他参数• Content of Total Copper总铜含量Stock solution 1: 1000 µg/mL of copper. Transfer 1.000 g of copper to a1000-mL volumetric flask, dissolve in 20 mL of nitric acid, and dilute with 0.2 N nitric acid to volume.[Note—Store in a polyethy l ene bottle. ]储备溶液1：1000 µg/mL Cu2+----1.000g Cu溶解于20ml硝酸，用0.2mol/l 稀硝酸定容至1000ml，储备于聚乙烯瓶中。
芹菜叶制取叶绿素铜钠盐的工艺研究
芹菜叶制取叶绿素铜钠盐的工艺研究孙永林;杨瑞【摘要】以新鲜的芹菜叶为材料,采用正交试验考察制取叶绿素铜钠盐的工艺优化条件.研究结果表明,芹菜叶叶绿素提取的最佳条件为:乙醇浓度为95%.料液比为1:9,浸提时间为8 h.叶绿素铜钠盐的制取工艺为:皂化pH值为11～12,皂化时间为30 min,酸化铜代的pH值为2～3,温度为75℃,CuSO4的加入量为理论值的2倍.反应时间1.5 h.【期刊名称】《长江蔬菜》【年(卷),期】2010(000)004【总页数】3页(P36-38)【关键词】芹菜;叶绿素铜钠盐;正交试验【作者】孙永林;杨瑞【作者单位】襄樊学院化学工程与食品科学学院,湖北襄樊,441053;襄樊学院化学工程与食品科学学院,湖北襄樊,441053【正文语种】中文芹菜（Apium graveolens）别名药芹或水芹，为伞形花科植物芹菜的全草，具有平肝降压、利尿消肿、养血补虚、防癌抗癌等功效[1]。
可食用部分为其肉质直立的叶柄，叶片往往作为废弃物被扔掉。
叶片中含有丰富的天然叶绿素资源，但天然的叶绿素着色力低，在光、热、氧气、pH值等变化时稳定性差，通过稀酸分离的方法可除去其卟啉环中心的镁，形成脱镁叶绿素，用铜取代镁后可获得对光稳定的衍生物叶绿素铜钠，该衍生物具有补血、造血、活化细胞、抗菌消炎、抑制癌细胞生成等功效[2]。
为了充分利用资源，减少废弃物对环境的污染，我们对芹菜叶的叶绿素及叶绿素铜钠的提取工艺进行了研究。
1 材料与方法1.1 试验材料芹菜，购于609菜场。
试验仪器有UV-1900紫外-可见分光光度计、旋转蒸发仪、水浴锅、烧杯、锥形瓶、量筒、玻璃棒、漏斗等。
试验试剂有氢氧化钠、硫酸铜、无水乙醇、95%乙醇、石油醚、丙酮等均为国产分析纯。
1.2 试验方法①叶绿素的提取将新鲜的芹菜叶洗净、晾干并剪成适当大小的碎片，分批投入沸水中烫漂1 min，不断搅拌，迅速取出，用去离子水冲洗3遍，滤干水分。
常用作物生理指标测定方法以及叶绿色测定
SOD,POD,CAT,MDA,可溶性蛋白用同一提取液。
磷酸缓冲液配制：A液（Na2HPO40.2M）:Na2HPO4.2H2O=35.61g(或Na2HPO4.12H2O=71.64g)定容1000MLB液（NaH2PO4 0.2M）:NaH2PO4.H2O=27.6g(或NaH2PO4.2H2O=31.21g)定容到1000ml浓度mol/l PH值A液体积ml B液体积ml 定容体积ml0.05 7.8 91.5 8.5 4000.1 7.5 84 16 2000.1 7.0 61 39 2000.1 6.0 12.3 87.7 2001/15 7.0 61 39 300130mmol/l甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml0.75mmol/l氮蓝四唑（NBT）溶液：称0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存0.1mmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml0.02mmol/l核黄素溶液：取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存反应液组成水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD=5：30：6：6：6：6150ml反应液的组成是水12.7ml+磷酸（0.05M,PH=7.8）76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA=Na215.25ml+FD15.25mlSOD：称取0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L PH=7.8），冰浴研磨，研磨后再加入1ml缓冲液倒入离心管，再用2ml缓冲液冲洗研钵，倒入离心管中，平衡后低温（0-4℃）10000rpm离心后10min冷藏保存。
取相同型号的试管，加入20μl上清液（2支对照管加缓冲液），分别加3ml反应液，其中一支对照放于暗处，其余在4000lux下反应20-30min（温度高时时间短，温度低时时间长）后再560nm下进行比色。
叶绿素实验报告
叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定食品092一、实验目的：二、产品验收指标项目和指标───────────────┬──────────项目│ 指标───────────────┼──────────pH │ 9.0～10.71％│E 405nm ≥ │ 5681cm │消光比值│ 3.2～4.0总铜(Cu),％│ 4.0～6.0游离铜(Cu),％≤ │ 0.025砷(As),％≤ │ 0.0002铅(Pb),％≤ │ 0.0005干燥失重,％≤ │ 4.0硫酸灰分,％≤ │ 36.0───────────────┴──────────三、实验原理:四、仪器和试剂（一）、试剂：1、蚕沙（50克）2、95%乙醇3、NaOH 溶液4、稀盐酸5、溶液 8、蒸馏水 9、40%乙醇(纯乙醇丙酮 6、石油醚 7、CuSO4与蒸馏水按2:3配) 10、5%NaOH-乙醇溶液 11、pH试纸 12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：4混合（二）、仪器：A、叶绿素的提取叶绿素铜钠合成1、温度计 1支回流冷凝管 1支 500ml 圆底烧瓶 1个恒温槽 1台滤瓶及漏斗 1个胶头胶管 1个玻璃棒 1支 100mL量筒 1个铁架台 1台电热恒温水浴装置 1套2、减压蒸馏装置 1台3、台氏天平 1台4、PH试纸若干B、叶绿素铜钠质量分析1、751分光光度计 1台2、台式天平、分析天平各1台3、玻棒 1支胶头滴管 1支10mL、50mL量筒各一个 100mL 、50mL容量瓶各1个25mL、1mL吸量管各一支4、试纸若干吸耳球一个五、实验步骤（一）叶绿素铜钠的合成1、叶绿素的提取：（1）在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙，再加入95%乙醇100ml。
（2）将反应瓶用水浴加热，使水浴温度在60℃（防止叶绿素a和b分解），浸泡提取2小时，滤出提取液。
（3）按步骤2用乙醇重复2次。
蚕沙中叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定实验报告
蚕沙中叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定化工091 王维 200900601039化工091 刘阳 200900601040一、实验目的1、从干蚕沙中提取叶绿素并计算提取率。
2、研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件。
3、分析叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率。
4、通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作二、实验原理叶绿素是一个双羧酸的酯，不溶于水，易溶于乙醚，苯，丙酮，乙醇的脂性溶剂，难溶于石油醚。
所得的叶绿素由于遇热，光，酸，碱等易分解，，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。
叶绿素铜钠为墨绿色，有金属光泽的粉末，无臭或带氨臭，易溶于水，水溶液呈绿色，透明，无沉淀。
1%的水溶液的PH值为9.5-10.2。
微溶于乙醇和氯仿，几乎不溶于油脂和石油醚。
水溶液中加入钙盐会析出沉淀其耐光性比叶绿素强，加热到110℃以上会分解。
叶绿素可与碱发生皂化反应：Ｃ55Ｈ72Ｏ5Ｎ4Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2 + ＣＨ3ＯＨ + Ｃ20Ｈ39ＯＨＣ55Ｈ70Ｏ6Ｎ4Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4ＭｇＮａ2 + ＣＨ3ＯＨ + Ｃ20Ｈ39ＯＨ在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸：Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2 + 4Ｈ+ = Ｃ34Ｈ34Ｏ5Ｎ4 + Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4ＭｇＮａ2 + 4Ｈ+ = Ｃ34Ｈ32Ｏ6Ｎ4 + Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：Ｃ34Ｈ34Ｏ5Ｎ4+Ｃｕ2+ = Ｃ34Ｈ32Ｏ5Ｎ4Ｃｕ+ 2Ｈ+Ｃ34Ｈ32Ｏ6Ｎ4+Ｃｕ2+ = Ｃ34Ｈ30Ｏ6Ｎ4Ｃｕ+ 2Ｈ+Ｃ34Ｈ32Ｏ5Ｎ4Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4CｕＮａ2 + 2Ｈ2ＯＣ34Ｈ30Ｏ6Ｎ4Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4CｕＮａ2 + 2Ｈ2O三、仪器和试剂（一）、试剂：1、蚕沙（50克）2、95%乙醇3、NaOH 溶液4、稀盐酸5、丙酮6、石油醚7、CuSO4溶液8、蒸馏水9、40%乙醇10、5%NaOH-乙醇溶液11、pH试纸12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：4混合（二）、仪器：721型分光光度计，蒸馏装置,过滤装置,减压过滤装置,回流装置,分液漏斗装置，电子天平,电热恒温水浴锅及常用玻璃仪器等。
实验4 叶绿体色素的吸收光谱曲线及含量的测定
实验二叶绿体色素吸收光谱曲线及含量的测定一、实验目的掌握分光光度计的使用方法，学会绘制叶绿体色素的吸收光谱曲线。
了解叶绿体色素含量测定的原理，掌握叶绿体色素含量测定的方法。
二、实验原理叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光谱最强的吸收区有两个：一个在波长640~660nm的红光部分，另一个在波长430~450nm的蓝紫光部分。
在光谱的橙光、黄光和绿光部分只有不明显的吸收带，其中尤以对绿光的吸收最少。
胡萝卜素和叶黄素的最大吸收带在蓝紫光部分，不吸收红光等长波的光。
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：D＝KCLD：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度,K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm。
95 ％乙醇提取液中叶绿素a 和b 及类胡萝卜素分别在在665nm 、649nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
三、实验材料及器材仪器及试剂：研钵、量筒、滴定管、烧杯、比色杯、滤纸、脱脂棉、分光光度计、95%乙醇材料：菠菜叶片四、实验步骤1、提取称取1g菠菜叶片，加入少许95%乙醇，研磨，用量筒定容至25ml。
2、吸收光谱去1ml提取液，加3ml95%乙醇，置于比色杯中，用95%乙醇作为对照，在400~700nm 之间每隔20nm测一次光，记录波长和吸光度D于下表中，并在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。
λ（nm）400 420 440 460 480 500 …... 600 620 640 660 680 700 A3、将色素提取液充分混匀后，取光径1cm 的比色杯，注入提取液，以95%乙醇作为空白对照，在波长665nm 、649nm 和470nm 下测定吸光度（、和）。
叶绿素、叶绿素铜钠盐的稳定性分析研究
绪论食品的色泽是人们对食品的第一感性接触，色泽美观的食品不仅可以提高食品的感观性质，给人以美的享受，激发人们的购买欲望，而且还能增进食欲。
因此，色泽是衡量食品质量的重要指标之一[1]。
为了保持或改善食品的色泽，在食品加工中往往需要对食品进行人工着色。
食用色素就是一种使食品着色和改善食品色泽的食品添加剂。
食品色素按其来源分为天然的及化合的两类。
化学合成色素一般色泽鲜艳，着色力强，坚牢度大，性质稳定，曾一度广泛应用。
但随着食品色素安全性试验技术的发展，发现有的合成色素有致癌作用和诱发染色体变异，因而许可使用的合成色素品种有所减少，产量降低。
近年来，国外在合成色素方面正在致力开发大分子聚合物合成色素。
天然色素色泽较差，但安全性高，有的还有一定的营养价值或药理作用，且来源丰富，因而日益受到人们的重视，增长趋势很快。
在天然色素的开发和应用方面，日本居世界前列。
在当前食用色素的使用方面，天然色素已占主导地位。
开发天然色素是世界食用色素发展的总趋势。
叶绿素及其衍生物作为天然食用色素的生产在我国已有30余年的历史，主要产品是糊状叶绿素和叶绿素铜钠盐。
生产叶绿素的原料很多，最早使用的是蚕沙，近年来有人试验用竹叶、芦苇、芭蕉叶、甜菜叶、菠菜叶等各种叶子作为生产叶绿素的原料．取得了令人满意的效果[2]。
就游离的叶绿素来说很不稳定，对光、热敏感，易氧化裂解而褪色，故用作食品添加剂有其局限性。
而将叶绿素用碱水解，除去甲基和叶绿醇基，并将中心离子镁用铜或锌取代生成叶绿素铜（锌）钠盐，其稳定性增加，可作为一种良好的食用色素[3]。
本研究以茶叶为原料提取叶绿素．并用铜代和锌代分别制得叶绿素铜钠盐和叶绿素锌钠盐。
通过研究其溶解性的强弱、PH值的影响、稳定性的差异、安全性的异同及着色能力的强弱，分析比较这三种茶绿色素作为食用色素的优劣性，探求影响其稳定性的条件及为三种色素的应用优劣性提供科学依据。
1. 叶绿素、叶绿素铜（锌）钠盐的形成机理及其性质研究1.1 叶绿素叶绿素(chlorophyll)属卟啉类化合物，和胡萝卜素、叶黄素等同时存在于绿色植物的叶子或微生物体内，在植物和微生物的光合反应中起重要作用。
叶绿素铜钠盐检验标准
每批产品必须有产品检验报告（厂家内部或官方部门出具），如无，则整批拒收，来料的名称、标签与采购单不相符的，整批产品退回。
2.2外包装及感官检验：（AQL值：主要MAJ:1.0轻微MIN:2.5）
项目
要求
方法
缺失
MAJ
MIN
外包装
外包装应牢固、洁净、有相应的名称、生产日期、保质期、制造商，执行标准等。
目测
外包装严重不洁、外漏，没有标签
∨
轻微不洁、破损，
标志不全
∨
外观
墨绿色至黑色粉末
目测
色泽异常
∨
气味
具有叶绿素的特有气味
嗅
无异味
∨
杂质
无可见黑点，异物
目测
异物
∨
2.3理化及卫生要求（0收1退）:
项目
指标
监控频率
检验机构
干燥失重，%
≤15.0
每批
工厂内部
细菌总数cfu/g
≤10000
每批
工厂内部
大肠菌群MPN/100g
***食品有限公司
文件编号
FW-QC-IQC-021
版号
A1
文件名称：色素-叶绿素检验标准
页次
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生效日期
2012.08.01
1、抽样方法:
1.1感官检验:以包(袋)为判别单位,采用MIL-STD-105E LEVEL 2抽样
1.2理化及卫生检验：以每一生产期为一个检验批。
1.3采样数量：2桶以下采1桶，3-10桶采2桶，采样总数须大于250克。
≤30
每批
工厂内部
砷（以As计）,mg/kg
≤1.0
1次/年
银杏叶叶绿素铜钠盐质量标准
性状 本品为墨绿色或黑色颗粒或粉末；无气味或有轻微类似胺类化合物的特殊臭味，有吸湿性。 水溶液显碱性。 本品在水中易溶，在乙醇中微溶。 吸收系数 避光操作。取本品 40mg，精密称定，置 100ml 量瓶中，加水适量使溶解并稀释 至刻度，摇匀，精密量取 2ml，置 100ml 量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）稀释至刻度，摇 匀，立即照分光光度法，在 405±3nm 的波长处测定吸收度。按干燥品计算，吸收系数（E1% 1cm ） 应符合相应指标值。 鉴别 （1）取本品 20mg，加水 20ml 使溶解，溶液澄清并显翠绿色，滴加稀盐酸使成酸性，即有 绿色絮状沉淀析出，再加氢氧化钠试液调至碱性，沉淀溶解。 （2）取铅盐测定项下剩余的溶液 5ml，加入氨试液使成碱性，溶液显蓝色。 （3）取铅盐测定项下剩余的溶液 5ml，加 0.1%二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液 0.5ml，发生 褐红色沉淀。 （4）本品的水溶液显钠盐的鉴别反应。 （5）取吸收系数测定项下的溶液，在 405±3nm 和 630±3nm 的波长处测定吸收度。405 ±3nm 与 630±3nm 波长处的吸收度比值应符合相应指标值。 检查 ［溶解度］取本品 10g，加水 90ml，振摇 5min，中速离心 10min，离心管底不得有沉淀。
色谱图中 1 ，2 峰紫外及可见光谱图
#
#
［干燥失重］ 取本品，在 105℃干燥至恒重，减失重量不得过 4.0%。 ［非必要硫酸灰份］ 取本品 0.5g，置已在 550±50℃炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓 缓炽灼至完全炭化， 放冷至室温； 加硫酸 0.5～1ml 使湿润， 低温加热至硫酸蒸气除尽后， 置 550 ±50℃下炽灼 2 小时，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在 550±50℃炽灼至恒重， 即得硫酸灰份。 非必要硫酸灰份按下式计算： 非必要硫酸灰份 % 硫酸灰份 % - 总铜 % - 游离铜 % 4.90
天然叶绿素铜钠盐
叶绿素铜钠盐Sodinm Copper Chlorophyllin性状本品为蓝黑~绿黑色粉末，无臭或稍有特异气味。
鉴别试验（1）称取本品1g，放入瓷坩埚内，加入硫酸少量润湿，慢慢加热，尽可能在低温下几乎灰化后，放冷，再加入硫酸1ml，慢慢加热至硫酸蒸气几乎不再产生后，放冷。
在此残留物内加入盐酸（1+3）10ml,在水浴上加热溶解，必要时过滤，加水配制10ml,作为检测液，进行如下实验；（i）检测液，进行焰色反应试验时，开始显绿色，接着显黄色；（ii）取检测液5ml,加入二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液（1+1000）0.5ml时，生成褐色沉淀。
（2）取本品的水溶液（1+1000）1ml,测定加入磷酸缓冲液（ph7.5）配至为100ml溶液的吸光度时，波长在403-407nm和627-633nm范围内出现最大吸收峰，在每个最大吸收峰处，把吸光度作为A1和A2时，A1/A2比值应小于4.0.纯度试验（1）比吸光度（405nm附近最大吸收峰）大于508（换算成干品）。
精确称取本品约.01g，加水溶解，准确配至100ml。
准确量取该溶液1ml，加磷酸缓冲液（ph7.5）,准确配至100ml,测定波长在405nm附近最大吸收峰的吸光度，再进行干燥品换算。
此处，操作要避免日光直射，在避光容器内进行。
（2）ph值ph9.5-11.0(1.0g，水100ml)。
（3）无机铜盐以CU计，小于300ug/g。
称取本品1.0g，加水60ml溶解，作为检测液。
量取检测液2ul，不用对照液，将正丁醇-水-乙酸混合液（4:2:1）作为展开溶剂，进行薄层色谱分析时，不得生成淡褐色的斑点。
此处薄层板系用薄层色谱用硅胶在110o C干燥1h后，作为载体制成的。
展开溶剂的前沿上升到约10cm高度时停止展开，风干后，喷雾二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液（1->1000）。
（4）砷以AS2O3计，小于4.0ug/g (0.5g，第3法，装置B)。
叶绿素含量总表
表1不同的盐浓度条件下不同品种的白菜叶绿素含量的变化叶绿素含量盐处理0Na 100Na 200Na 300Na 400Na春大强 3.12±0.05 3.28±0.19 3.86±0.75 3.08±0.07 3.12±0.10 春大王 2.94±0.22 3.01±0.44 3.90±0.33 3.64±0.04 2.90±0.12 迷你娃娃菜 3.46±0.03 3.63±0.35 3.69±0.57 3.78±0.23 3.85±0.33 橘红 3.64±0.34 3.80±0.23 3.69±0.57 3.07±0.25 3.00±0.34 抗病黄芯 3.16±0.55 3.50±0.13 3.90±0.30 3.51±1.11 3.27±0.51 爽口 3.33±0.11 3.53±0.27 4.62±0.34 3.86±0.04 3.66±0.22 春晓 3.21±0.61 3.87±0.25 4.39±0.55 3.82±1.01 2.60±0.46 夏胜 3.79±0.41 5.13±0.15 5.12±0.69 3.65±0.85 1.66±0.18 迷你黄 2.85±0.17 4.10±0.11 4.48±0.13 4.33±0.65 3.54±0.71 金童玉女 2.96±0.25 3.21±0.05 3.23±0.28 3.34±0.40 2.32±0.30 金星 4.05±0.30 4.16±0.54 4.41±0.16 4.22±0.54 3.88±0.42 优势无 2.75±0.03 3.00±0.28 2.76±0.27 2.11±0.10 抗热2号 3.46±0.36 3.94±0.31 4.58±0.29 3.61±0.23 3.74±0.21 玲珑 3.35±0.34 3.88±0.28 3.65±0.15 3.67±0.27 3.18±0.30 田娃 3.88±0.03 3.89±0.50 3.95±0.30 3.71±0.55 3.73±0.15 珍宝 3.31±0.81 3.71±0.42 4.43±0.08 4.63±0.16 4.58±0.60如图表1，在盐处理一周后，测量16个品种白菜的叶绿素含量，此时叶绿素含量变化随着不同盐浓度的变化而变化。
7.叶绿素铜钠盐
w1
=
Ε1% 1cm
(405nm
Ε1% 1cm
(630nm
± 3nm）…………………………（A.2）
± 3nm）
式中：
Ε1% 1cm
(405nm
±
3nm）——试样液浓度为
1
%，用
1
cm
比色皿，在
405
nm±3nm
范围内的最大吸
收波长处测得的吸光度；
Ε1% 1cm
(630nm
±
3nm）——试样液浓度为
a）取试液作焰色试验。开始呈绿色，后呈黄色。 b）取 5mL 试液，加入 0.5mL 浓度为 0.1％的二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液（1g 溶于 1000 mL 水中），产生褐红色沉淀。
A.3 pH的测定
配制浓度为 1％的试样溶液（1g 试样溶于 100mL 水中），用酸度计测定其 pH 值。
A.4 吸光度及吸光度比值的测定
A.4.1 试剂和材料 A.4.1.1 0.15mol/L磷酸氢二钠溶液：称取53.7g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），加水溶解，稀释 并定容至1000mL。 A.4.1.2 0.15mol/L磷酸二氢钾溶液：称取20.4g磷酸二氢钾（KH2PO4），加水溶解，稀释并定容至 1000mL。 A.4.1.3 磷酸盐缓冲液（pH7.5）：取21份0.15mol/L磷酸氢二钠溶液与4份0.15mol/L磷酸二氢钾溶液 混合。 A.4.2 仪器和设备
钠盐。
2 分子式和相对分子质量
2.1 分子式 铜叶绿酸三钠：C34H31O6N4CuNa3 铜叶绿酸二钠：C34H30O5N4CuNa2
2.2 相对分子质量 铜叶绿酸三钠：724.17(按2007年国际相对原子质量) 铜叶绿酸二钠：684.16(按2007年国际相对原子质量)
叶绿素测定以及标准曲线绘制,还有过氧化酶测定
过氧化物酶活性的测定仪器药品721型分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器、20mmol/LKH2PO4、愈创木酚、30%过氧化氢、100mmol/L磷酸缓冲液（PH6.0）反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液50ml与烧杯中,加入愈创木酚28ul，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解，带溶液冷却后，加入30%过氧化氢19ul，混和均匀，保存于冰箱中。
操作步骤1．称取植物材料1g，加20mmol/LKH2PO45ml，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心15分钟，倾出上清夜保存在冷处，残渣在用KH2PO4溶液提取一次，合并两次上清夜，处于冷处备用。
2．取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml，KH2PO41ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长470nm下进行。
3．以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/min.mg 鲜重表示之。
4．植物样品中过氧化物酶活性的测定:采用粗天平称取剪碎、混匀的植株叶片1g,于研钵中加入少许蒸馏水及约0.2gCaCO3,研磨成匀浆状.转移全部匀浆至100mL容量瓶中并补充体积至刻度,摇匀.取25mL悬浮液注入50mL量瓶中,用10%硝酸钙溶液稀释至刻度,摇匀,在定期摇动下浸泡30-40min.经过滤后,采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性[4].叶面积测量法单叶表面积的估算采用坐标纸描绘法,即先随意挑取48片叶描绘在坐标纸上,计算出面积,然后以长(ａ)×宽(ｂ)为变量,叶面积为依变量进行线性回归,方程式为:ｙ=0.87ａｂ-0.21 ｒ2=0.98。
单叶面积依此公式将叶长、叶宽换算而得。
特殊叶面积为单叶面积与单叶重量的比值。
单株总叶面积为叶重和特殊叶面积的乘积。
叶面积率为单株总叶面积与植株总重的比值。
根形态测定法1)菜豆试验.采用分层式磷控释砂培试验。